專利名稱：大豆細菌性斑點病菌harpinZ_PsgA1蛋白的表達和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物基因工程領域，更具體地說，涉及一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細菌信號因子hrpZPsgA1基因的克隆及其高效表達產(chǎn)物的純化，以及該純化蛋白harpinZPsgA1促進植物生長及抗病方面的應用。
背景技術：
大豆是一種其種子含有豐富的蛋白質(zhì)的豆科植物，其種子呈橢圓形、球形，顏色有黃色、淡綠色、黑色等，故又有黃豆、青豆、黑豆之稱，是豆科植物中最富有營養(yǎng)而又易于消化的食物，是蛋白質(zhì)最豐富最廉價的來源，在今天世界上許多地方是人和動物的主要食物。大豆具有多種用途，最常用來做各種豆制品、榨取豆油、釀造醬油和提取蛋白質(zhì)，而豆渣或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜飼料，是最重要的經(jīng)濟作物之一。高等植物過敏性反應(hypersensitive response ;HR)是植物受到病原細菌侵染，發(fā)生非親和性反應時，在病原菌入侵點周圍植物組織局部快速死亡形成枯斑，是植物對病原菌抗性的一種普遍表現(xiàn)形式。hrp 基因(hypersensitive reaction and pathogencitygene)是一類決定病原菌對寄主植物致病性和誘導非寄主植物產(chǎn)生過敏性反應的基因。hrp基因是由多個hrp位點組成的基因簇，具有復雜的結(jié)構(gòu)，并具有至少四方面的功能:基因調(diào)控、蛋白質(zhì)泌出和編碼HR反 應激發(fā)子，以及參與細菌纖毛(pilus)的合成。在hrp基因所編碼的HR反應激發(fā)子中，harpin是一類非特異性蛋白質(zhì)激發(fā)子，該蛋白質(zhì)富含甘氨酸，不含半胱氨酸，對熱穩(wěn)定，對蛋白酶K敏感，可以在非寄主植物煙草上激發(fā)過敏反應，并且過敏反應可以被真核生物代謝抑制劑抑制，是目前研究得較為深入的一類細菌分泌蛋白。Wei(1992)首次從梨火疫(E.amylovora)中分離得到一種能引起過敏反應的蛋白激發(fā)子HrpN,隨后在丁香假單胞菌和青枯假單胞菌中也分離到了相應的harpin類蛋白。以往研究表明，harpin可以通過啟動多種信號途徑來誘導植物獲得抗性，harpin蛋白可以通過啟動至少三條信號通路即:水楊酸(SA)信號通路、茉莉酸(JA)/乙烯(ET)信號通路和脫落酸(ABA)信號通路來誘導植物獲得多種有益表型，如促進生物生長，使植物增強對病原菌和害蟲的抗性，作為新型微生物蛋白農(nóng)藥的代表具有廣泛的應用前景。大豆細菌性斑點病是我國，尤其是北方，大豆產(chǎn)區(qū)的一種主要病害，給我國的大豆生產(chǎn)帶來巨大損失。大豆細菌性斑點病主要危害大豆的幼苗、葉片、葉柄、莖及豆莢。幼苗染病子葉生半圓形或近圓形褐色斑。葉片染病初生褪綠不規(guī)則形小斑點，水潰狀，擴大后呈多角形或不規(guī)則形，大小約3 4_，病斑中間深褐色至黑褐色，外圍具一圈窄的褪綠暈環(huán)，病斑融合后成枯死斑塊。莖部染病初呈暗褐色水潰狀長條形，擴展后為不規(guī)則狀，稍凹陷。莢和豆粒染病生暗褐色條斑。大豆細菌性斑點病的致病菌為丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.glycinea),其也是世界范圍內(nèi)重要的植物病原細菌。因此，有獲取可有效提高植株對丁香假單胞菌大豆致病變種的抗性，促進植株生長的harpin類蛋白及其相關的生物制品的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供大豆細菌性斑點病菌的harpin類蛋白，表達所述蛋白的重組載體及其構(gòu)建的工程菌。本發(fā)明是通過如下技術手段實現(xiàn)的:在本發(fā)明的第一方面，提供了一種編碼具有harpin蛋白功能的氨基酸序列的核苷酸序列hrpZPsgA1，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，其特征在于，所述載體含有第一方面所述的核苷酸序列，優(yōu)選地，所述載體為pET41a(+) -hrpZPsgA1重組載體。在本發(fā)明的第三方面，提供了第二方面所述的pET41a(+)-hrpZPsgA1重組載體的構(gòu)建方法，其由以下方法構(gòu)建:(I)將大豆細菌性斑點病菌Al菌株在28°C條件下于KB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，之后提取Al菌株基因組DNA，用5’端分別引入BamHl和EcoRl酶切位點的引物對hrpZPsgA1_Pl和hrpZPsgA1-P2以Al菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增:hrpZPsgA1-Pl:5’ -GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC BamHl (SEQ ID NO:3),hrpZPsgA1-P2:5' -GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG EcoRl (SEQ ID NO:4)；反應條件:94°C預變性4min, 94°C變性lmin,56°C退火lmin,72°C延伸90s,循環(huán)35次，72°C延伸IOminJf PCR產(chǎn)物與pMD18_T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T_hrpZPsgA1并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中；

(2)以重組質(zhì)粒pMD18-T-hrpZPsgA1為模板，PCR擴增，擴增產(chǎn)物回收后經(jīng)BamHl和EcoRl雙酶切后連接到表達載體pET41a(+)上，使得hrpZPsgA1基因與pET41a(+)上的還原型谷胱甘肽GST標簽融合，進而得到重組質(zhì)粒pET41a (+) _hrpZPsgA1。在本發(fā)明的第四方面，提供了含有第二方面所述載體的重組細胞，優(yōu)選地，所述重組細胞為重組大腸桿菌BL21/pET41a(+)-hrpZPsgA1。在本發(fā)明的第五方面，提供了第四方面中所述的重組大腸桿菌BL21/pET41a(+)-hrpZPsgA1的構(gòu)建方法，其包括將重組質(zhì)粒ET41a(+)_hrpZPsgA1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 中，獲得重組大腸桿菌 BL21/pET41a(+)-hrpZPsgA1。在本發(fā)明的第六方面，提供了第一方面所述的核苷酸序列所編碼的蛋白harpinZPsgA1，其序列為 SEQ ID NO:2。在本發(fā)明的第七方面，提供了包含第四方面所述的重組細胞或第六方面所述的蛋白的生物制品。在本發(fā)明的第八方面，提供了第七方面所述的生物制品在植物病害防治中的應用，優(yōu)選地，所述植物病害為煙草花葉病毒引起的植物病害。本發(fā)明中使用的縮略語:LB:細菌培養(yǎng)基，酵母粉5g/L+胰蛋白胨10g/L+NaC110g/L，PH7.0 ；KB:假單胞菌培養(yǎng)基，胰蛋白胨 10g/L+ 甘油 10g/L+K2HP04l.5g/L+MgS04.7Η201.5g/L ；Km50:50μ g/ml 的卡那霉素；IPTG:異丙基硫代-β -半乳糖苷；PMSF:蛋白酶抑制劑苯甲基黃酰氟。有益效果1.本發(fā)明公開了一種大豆細菌性斑點病Al菌株的hrpZPsgA1基因序列及其所編碼的蛋白質(zhì)，采用基因工程方法利用GST融合表達harpin蛋白，顯著提高其在大腸桿菌中的表達量。并通過GSTrap FF對目的蛋白進行純化，純蛋白濃度約為lmg/ml。2.本發(fā)明所獲得harpinZPsgA1富含甘氨酸，不含半胱氨酸，可以在非寄主植物煙草上激發(fā)過敏反應。3.本發(fā)明所獲得harpinZPsgA1處理煙草，可以促進煙草的生長，顯著提高煙草對煙草花葉病毒病的抗性，以上結(jié)論證明harpinZPsgA1具有開發(fā)成生物源農(nóng)藥的應用價值。


圖1.重組質(zhì)粒pET41a(+)_hrpZPsgA1PCR及酶切驗證:A重組質(zhì)粒pET41a(+) -hrpZPsgA1 的 PCR 擴增，其中 Ml 為 DNA marker λ -HindIII ；Μ2 為 DNAmarker DL2000 ；1 為 pET41a (+) _hrpZPsgA1 ;2 為 pET41a (+)-hrpZPsgSl ;B 重組質(zhì)粒pET41a(+)-hrpZPsgA1 的酶切驗證，其中 Ml 為 DNA marker DL2000 ；1 為 hrpZPsgA1 ；2 為hrpZPsgSl ；3為清水對照。圖2.harpinZPsgA1的表達及純化:其中M為蛋白marker ；1為harpinZPsgA1粗提蛋白；2為純化的harpinZPsgA1蛋白。圖3.harpinZPsgA1 的生物活性檢測:其中 I 為 BL21 ；2 為 BL21/pET41a (+) ；3 為 PBS緩沖液；4 為 harpinZPsgA1。圖4.harpinZPsgA1對煙草種子的促生作用，其中A為不同濃度的harpinZPsgA1對煙草種子的促生作用；B為 harpinZPsgA1處理煙草種子16天后根長差異顯著性分析。圖5.harpinZPsgA1誘導煙草抵抗煙草花葉病毒(TMV)侵染。
具體實施例方式以下通過具體實施方式
進一步描述本發(fā)明，由技術常識可知，本發(fā)明也可通過其它的不脫離本發(fā)明技術特征的方案來描述，因此所有在本發(fā)明范圍內(nèi)或等同本發(fā)明范圍內(nèi)的改變均被本發(fā)明包含。實施例1.hrpZPsgA1基因的克隆將大豆細菌性斑點病菌丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringaepv.glycinea)Al菌株(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏日期為2012年10月22日，保藏號為CGMCC N0.6700)在28°C條件下于KB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌株生長到對數(shù)期，提取Al菌株基因組DNA，根據(jù)GenBank中登錄號為L41862的hrpZ序列，設計完整開放閱讀框(ORF)引物，在5’端分別引入BamHl和EcoRl酶切位點；hrpZPsgA1-Pl:5’ -GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC ；hrpZPsgA1-P2:5’ -GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG。以Al菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應條件:94°C預變性4min，94°C變性 lmin，56°C退火 lmin，72°C延伸 90s，循環(huán) 35 次，72°C延伸 IOmin0 將 PCR 產(chǎn)物與 pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci中，經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切驗證得到陽性轉(zhuǎn)化子。提取重組質(zhì)粒DNA并測序。序列分析采用DNAStar軟件，同源性比對在GenBank (http://www.ncb1.nlm.gov)中通過Blast程序進行比對。
實施例2.harpinZPsgA1蛋白的表達及純化以測序正確的陽性重組質(zhì)粒pMD18-T_hrpZPsgA1為模板，PCR擴增。擴增產(chǎn)物回收后經(jīng)BamHl和EcoRl雙酶切后連接到表達載體pET41a (+)上，使得hrpZPsgA1基因與pET41a (+)上的還原型谷胱甘肽GST標簽融合，進而得到重組質(zhì)粒pET41a (+) -hrpZPsgA1。將重組質(zhì)粒和pET41a(+)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21后經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切鑒定出陽性重組菌株。重組菌株BL21/pET41a(+)-hrpZPsgA1 在 LB 液體培養(yǎng)基(km50 μ g/ml)中 37 V(200rpm/min)振蕩培養(yǎng)過夜，次日按照1%的比例轉(zhuǎn)接到km50的液體LB中，37°C振蕩培養(yǎng)約2-3h，至0D600=0.6 0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，37°C振蕩培養(yǎng)2_3h。取誘導的菌液離心收集菌體，用PBS (磷酸緩沖液)洗三次，重溶于1/20原菌體培養(yǎng)體積的磷酸緩沖液中，向菌體懸浮液中加入終濃度為100 μ g/ml的溶菌酶，終濃度為0.1mM的蛋白酶抑制劑PMSF,經(jīng)超聲波破碎后離心取上清即為粗提蛋白，SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況。使用GSTrap FF對 標簽蛋白進行純化，具體操作參見操作說明書進行，純蛋白濃度約為lmg/ml。以上獲得的純化harpinZPsgA1可以在促進植物生長，誘導植物抗病方面得到應用。實施例3:大豆細菌性斑點病菌Al菌株hrpZPsgA1基因的克隆與測序大豆細菌性斑點病菌Al菌株首先在KB固體培養(yǎng)基上篩選，該菌株能分泌熒光色素，并能在紫外光下檢測到熒光。將選取的單克隆菌落，于28°C條件下在KB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)24h，用于提取基因組DNA。根據(jù)Genbank中登錄號為L41862的hrpZ序列，設計完整開放閱讀框(ORF)引物，在5’端分別引入BamHl和EcoRl酶切位點；hrpZPsgA1-Pl:5’ -GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC ；hrpZPsgA1-P2:5’ -GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG。以Al菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應條件:94°C預變性4min，94°C變性 lmin，56°C退火 lmin，72°C延伸 90s，循環(huán) 35 次，72°C延伸 IOmin0 將 PCR 產(chǎn)物與 pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci中，經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切驗證得到陽性轉(zhuǎn)化子。提取重組質(zhì)粒DNA送到南京金斯瑞生物科技有限公司測序。對重組質(zhì)粒pMD18-T-hrpZPsgA1序列測定結(jié)果顯示，hrpZPsgA1基因大小為1026bp，編碼341個氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)富含甘氨酸(13.19%)，不含半胱氨酸。實施例4:harpinZPsgA1蛋白的表達及純化l.hrpZPsgA1基因工程表達菌株的構(gòu)建以測序正確的陽性重組質(zhì)粒pMD18-T_hrpZPsgA1為模板，PCR擴增。擴增產(chǎn)物回收后經(jīng)BamHl和EcoRl雙酶切后連接到表達載體pET41a (+)上，使得hrpZPsgA1基因與pET41a (+)上的還原型谷胱甘肽GST標簽融合，進而得到重組質(zhì)粒pET41a (+) -hrpZPsgA1。將重組質(zhì)粒和pET41a(+)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21后經(jīng)質(zhì)粒PCR及酶切鑒定出陽性菌株(圖1)。2.harpinZPsgA1 蛋白的表達(I)活化原種:重組菌株BL21/pET41a (+) _hrpZPsgA1接種于LB液體培養(yǎng)基(km50y g/ml)中37°C (200rpm/min)振蕩培養(yǎng)過夜，次日按照1%的比例轉(zhuǎn)接到km50的液體LB中，37°C振蕩培養(yǎng)約2-3h，至0D600=0.6 0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，37°C振蕩培養(yǎng)2-3h。(2)破碎細胞:收集菌液8000rpm/min，4°C離心IOmin收集菌體，用PBS (磷酸緩沖液)洗三次，重溶于1/20原菌體培養(yǎng)體積的磷酸緩沖液中，向菌體懸浮液中加入終濃度為100 μ g/ml的溶菌酶，終濃度為0.1mM的蛋白酶抑制劑PMSF。10000rpm/min, 4°C離心15min,收集上清，即為harpinZPsgA1的粗提蛋白。SDS-PAGE檢測融合蛋白大小為62kDa，harpinZPsgA1大小為35kDa, GST標簽大小為27kDa (圖2)。3.harpinZPsgA1 的純化使用GSTrap FF對標簽蛋白進行純化，具體步驟按照說明書顯示的方法，純化之前,用0.45 μ m濾膜過濾harpinZPsgA1粗提蛋白，去除粗提蛋白中一些細胞碎片或其它雜質(zhì)，以免阻塞純化柱，純化時使用蠕動泵上樣。純化的樣品經(jīng)超濾柱超濾、濃縮，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，純蛋白于-70V保存。4:harpinZPsgA1蛋白 的生物活性檢測用無頭的注射器向煙草葉背面細胞間隙注射harpinZPsgA1粗提液，同時以BL21、BL21/pET41a(+)和清水處理為對照，36h內(nèi)觀察葉片HR發(fā)展情況(圖3)。實施例5:harpinZPsgA1蛋白質(zhì)的應用舉例1.harpinZPsgA1促進煙草的生長將純化的harpinZPsgA1稀釋后浸泡煙早種子，冋時以清水為對照。12h后吸出蛋白液，加入30%的NaClO表面消毒5min，滅菌水清洗三次后倒置于滅菌的濾紙上，待種子吸干水后用滅菌牙簽點入含MS培養(yǎng)基的方形培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱中，垂直培養(yǎng),每個處理設置5個重復。20d后觀察，測定根長和鮮重，應用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。經(jīng)過3次獨立生物學重復得出50-200 μ g/ml的harpinZPsgA1對煙草有明顯的促生作用(圖4A和圖4B)，100 μ g/ml的harpinZPsgA1與清水對照組存在顯著性差異。2.harpinZPsgA1誘導煙草抗煙草花葉病毒使用100 μ g/ml純化的harpinZPsgA1預先噴霧處理煙草中部葉片，以清水噴霧處理為對照。6h后在處理葉片上摩擦接種煙草花葉病毒。3天后，我們觀察病斑的數(shù)目及直徑。結(jié)果顯示，經(jīng)harpinZPsgA1處理后的煙草葉片，其上形成的病斑數(shù)要明顯少于清水處理組，病斑抑制率可達60%以上。(圖5)。申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細特征以及方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細特征以及方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細特征以及方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，等效替換以及具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種編碼具有harpin蛋白功能的氨基酸序列的核苷酸序列hrpZPsgA1，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列。
2.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，優(yōu)選地，所述載體為pET41a(+)-hrpZPsgA1重組載體。
3.如權(quán)利要求2所述的載體的構(gòu)建方法，其由以下方法構(gòu)建: (1)將大豆細菌性 斑點病菌Al菌株在28°C條件下于KB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，之后提取Al菌株基因組DNAj 5’端分別引入BamHl和EcoRl酶切位點的引物對hrpZPsgA1_Pl和hrpZPsgA1-P2以Al菌株的基因組DNA為模板進行PCR擴增:hrpZPsgA1-P 1:5’ -GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC BamHl (SEQ ID NO:3),hrpZPsgA1-P2:5’ -GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG EcoRl (SEQID NO:4)； 反應條件:94°C預變性4min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸90s，循環(huán)35次，72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物與pMD18_T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T_hrpZPsgA1并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中； (2)以重組質(zhì)粒pMD18-T-hrpZPsgA1為模板，PCR擴增，擴增產(chǎn)物回收后經(jīng)BamHl和EcoRl雙酶切后連接到表達載體pET41a(+)上，使得hrpZPsgA1基因與pET41a(+)上的還原型谷胱甘肽GST標簽融合，進而得到重組質(zhì)粒pET41a (+) _hrpZPsgA1。
4.一種含有權(quán)利要求2所述載體的重組細胞，優(yōu)選地，所述重組細胞為重組大腸桿菌BL21 /pET41 a (+) -hrpZPsgA1。
5.如權(quán)利要求4中所述的重組細胞的構(gòu)建方法，其包括將重組質(zhì)粒ET41a(+) -hrpZPsgA1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，獲得重組大腸桿菌BL21/pET41a (+) -hrpZPsgA1。
6.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列所編碼的蛋白harpinZPsgA1，其序列為SEQID NO:2。
7.包含如權(quán)利要求4所述的重組細胞或如權(quán)利要求6所述的蛋白的生物制品。
8.如權(quán)利要求7所述的生物制品在植物病害防治中的應用，優(yōu)選地，所述植物病害為由煙草花葉病毒引起的植物病害。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆細菌性斑點病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1菌株hrpZPsgA1基因。該基因可調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育并使植物獲得廣譜抗病性。本發(fā)明采用GST融合表達harpinZPsgA1蛋白，可以顯著提高其在大腸桿菌中的表達量。所述蛋白可以促進作物生長，有效防治由煙草花葉病毒引起的植物病害。
文檔編號C12N15/31GK103205439SQ20121043433
公開日2013年7月17日 申請日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者高學文, 伍輝軍, 沈波, 張巖 申請人:無錫亞克生物科技有限公司