專利名稱：月季RcHSP70基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生理學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，具體涉及一種月季RcHSP70基因及其應(yīng)用，特別是涉及一種在月季中表達(dá)的RcHSP70 (月季熱激蛋白，Rosa chinensisHeat shock protein，RcHSP70)的克隆，基因表達(dá)模式分析，轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因菌株的獲得及其在提高多種非生物脅迫抗性方面的應(yīng)用，以及所述基因在提高轉(zhuǎn)基因植物的溫度抗性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于“溫室效應(yīng)”現(xiàn)象日益明顯，全球氣溫持續(xù)升高，夏季高溫已成為制約植物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要環(huán)境因子，植物生長(zhǎng)發(fā)育面臨高溫逆境的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。熱激蛋白(heat shockprotein, HSPs)是HSPs —類在有機(jī)體受到高溫等逆境刺激后大量表達(dá)的蛋白，根據(jù)分子質(zhì) 量大小將其分成HSP110s、HSP90s、HSP70s、HSP60s和小分子熱激蛋白(smHSPs)。HSP70s屬于大分子熱激蛋白。熱激蛋白是植物對(duì)逆境脅迫短期適應(yīng)的必需組成成分，對(duì)減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。有機(jī)體在受到逆境脅迫后，體內(nèi)變性蛋白急劇增加，熱激蛋白可以與變性蛋白結(jié)合，維持它們的可溶狀態(tài)，在有Mg2+和ATP的存在下使解折疊的蛋白質(zhì)重新折疊成有活性的構(gòu)象。已有研究證明HSPs的主要功能是參與新生肽的折疊以及蛋白質(zhì)變性后的復(fù)性、降解，維持胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，起分子伴侶(molecular chaperones)的作用。雖然植物熱激蛋白的研究起步較晚，但已成為當(dāng)今分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)和植物抗逆生理的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容，其中心問(wèn)題是HSPs的生物學(xué)功能。大分子熱激蛋白既可以作為常溫下細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白，也可以作為高溫?zé)峒は碌囊环N保護(hù)性蛋白，其中HSP70家族是熱激蛋白中研究最多、了解最深入的一個(gè)家族，它的成員遍布于細(xì)胞的各個(gè)組分，如胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和葉綠體(Vierling, 1991，F(xiàn)rydman, 2001 )。HSP70功能包括與新合成的多肽結(jié)合，參與新生多肽鏈的折疊及促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成；引導(dǎo)多肽到達(dá)不同的細(xì)胞器；在熱激情況下，通過(guò)與變性或異常狀態(tài)的蛋白質(zhì)結(jié)合來(lái)防止它們凝聚從而避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)的崩潰，促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的復(fù)性(Skcwyra等，1990; Buchner等，1992; Hartl, 1996)。HSP70與ATP的高度親和性表明其在行使功能時(shí)需要ATP水解放出的能量。其它大分子HSPs均已證明具有分子伴侶功能，并且也有越來(lái)越多的證據(jù)表明，大分子HSPs的作用途徑是相同的，其功能有部分重疊或是互補(bǔ)，HSPs通過(guò)協(xié)同作用來(lái)更好的行使分子伴侶功能(Bukau 和 Horwich, 1998 ；Easton 等，2000 ；Sung 等，2001 ；ffang 等，2004)。許多研究表明，HSPs的生成量與生物耐熱性呈正相關(guān)。也有研究表明HSPs與植物的抗冷性相關(guān)，Collins等(1995)首先證實(shí)了 HSPs和耐冷性的直接關(guān)系。隨著生活水平的提高，園林觀賞植物越來(lái)越受到人們關(guān)注，研究觀賞植物對(duì)溫度逆境抗性的遺傳機(jī)制有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一在于提供一種月季RcHSP70基因，將該月季RcHSP70基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌后可以提高轉(zhuǎn)基因菌株對(duì)高溫、低溫的抗性，應(yīng)用該技術(shù)不僅可以提高原核生物的溫度抗性，而且還可以提高轉(zhuǎn)基因植物的溫度抗性。所述的月季RcHSP70基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，長(zhǎng)度為1956bp。該基因是一個(gè)大分子熱激蛋白基因，因此又稱月季RcHSP70基因。所述的月季RcHSP70基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2，由651個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為71118. 813道爾頓，pi為4. 975。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二在于一種檢測(cè)所述月季RcHSP70基因表達(dá)模式的分析方法，包括以下步驟I)將耐熱性能差異顯著的兩個(gè)月季品種二年生嫁接苗于25°C常溫及38°C熱激處理3小時(shí)，分別提取它們嫩葉的總RNA。2)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA，然后根據(jù)所述月季RCHSP70基因的開放閱讀框的特異序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其中正向引物的序列為5’ -ATGGCCGGAAAGGGAGAG-3’，反向引物的序?yàn)?’ -TTAGTCAACTTCTTCAATCT-3’，進(jìn)行PCR。電泳之后，用相對(duì)定量軟件進(jìn)行分析。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三在于提供所述月季RcHSP70基因利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高大腸桿菌對(duì)多種非生物脅迫耐受性的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)將所述月季RcHSP70基因連接于原核表達(dá)載體PET32a中，獲得重組表達(dá)載體pET32a-RcHSP70，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在原核生物(大腸桿菌BL21)中表達(dá)，結(jié)果表明，所獲得的大腸桿菌BL21對(duì)多種非生物脅迫耐性顯著增高。由此說(shuō)明本發(fā)明的月季RcHSP70基因可用于提高大腸桿菌對(duì)多種非生物的脅迫耐受性。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之四在于提供所述月季RcHSP70基因提高轉(zhuǎn)基因植物的溫度抗性中的應(yīng)用。將所述月季RcHSP70基因的開放閱讀框連接于載體PHB中，獲得重組表達(dá)載體PHB-RcHSP70，并與空載PHB (CK)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，以農(nóng)桿菌浸染法(葉盤法)轉(zhuǎn)化煙草葉片，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草(PHB-RcHSP70)比空載PHB (CK)具有更強(qiáng)的耐熱性。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“月季RcHSP70基因的開放閱讀框”指編碼完整的月季RcHSP70蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO. I中第1-1956位的核苷酸序列。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。


圖I為半定量RT-PCR檢測(cè)月季RcHSP70基因表達(dá)的瓊脂糖電泳圖，其中NT-常溫，HT-高溫，KP- ‘新十全’，GO- ‘萊茵黃金，RA- ‘彩虹’，LA- ‘賭城’，GI- ‘小女孩’，SM-曼海姆宮殿’，上圖為RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，下圖為相應(yīng)的actin對(duì)照。圖2為重組表達(dá)載體和空載菌株在4°C低溫下不同耐性的比較結(jié)果。圖3為重組表達(dá)載體和空載菌株在55°C高溫下不同耐性的比較結(jié)果。圖4為重組表達(dá)載體和空載菌株及野生菌株對(duì)多種非生物脅迫的不同耐性比較·結(jié)果。 圖5為本發(fā)明的月季RcHSP70基因在煙草中異源表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因煙草的高溫脅迫耐性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York Cold Spring Harbor LabortaryPress, 1989)中所敘述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1月季RcHSP70基因的克隆1.將耐熱性強(qiáng)的月季品種‘曼海姆宮殿’(Schloss mannieim)(以下簡(jiǎn)稱‘曼海姆'SM)和耐熱性弱的‘新十全’ (Kordes，Perfecta,KP)進(jìn)行38°C熱激3小時(shí)。根據(jù)蘋果RcHSP70 (AF161180)與茶RcHSP70 (EU714122)的ORF 5，與3，端序列分別設(shè)計(jì)正向兼并引物5’ -ATGKCVGGAAAGGGAGAGG-3’ ；反向兼并引物5’ -TTARTCAACTTCYTCRATCT-3’。采用RT-PCR方法從‘曼海姆’ cDNA中擴(kuò)增出一條1956bp的條帶。將PCR產(chǎn)物回收，連接到T-載體上，用T7做為通用引物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST結(jié)果表明該序列和其他物種中相應(yīng)的大分子熱激蛋白70的序列高度保守。實(shí)施例2月季RcHSP70基因的序列信息與同源性分析對(duì)上述獲得的1956bp條帶進(jìn)行測(cè)定，其序列如SEQ ID NO. I所示，即為本發(fā)明的月季RcHSP70基因的核苷酸序列。該月季RcHSP70基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列由651個(gè)氨基酸殘基組成，分子量71118. 81道爾頓，pi為4. 975，序列如SEQ ID NO. 2所示。將上述月季RcHSP70基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列用BLAST程序在 Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GeneBank CDS transIations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與蘋果大分子熱激蛋白MdHSP2存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與蘋果大分子熱激蛋白MdHSP2基因的mRNA編碼序列(GeneBank AccessionNo. AF161180)有一定的同源性(參看下述表1)，在氨基酸水平上，它與蘋果大分子熱激蛋白MdHSP2蛋白質(zhì)的氨基酸殘基有92%的相似性(參看下述表2)。因此，該月季RcHSP70基因與蘋果大分子熱激蛋白MdHSP2基因存在較高的同源性。表1為本發(fā)明的月季RcHSP70基因與蘋果(Malus domestica)MdHSP2基因的核苷酸序列的同源性比較表(FASTA )>「gb IAF161180. 11 AF161180{J!Malus domestica high molecular weight heatshock protein(HSP2)mRNA, complete cdsLength=2212Score=2186bits (2424), Expect=O. 0Identities=1660/1956(84%)，Gaps=3/1956(0%)Strand=Plus/Plus
權(quán)利要求
1.月季RCHSP70基因，其核苷酸序列如SEQID NO. I所示。
2.權(quán)利要求I所述的月季RcHSP70基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.—種檢測(cè)權(quán)利要求I所述月季RcHSP70基因表達(dá)模式的分析方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將耐熱性能差異顯著的兩個(gè)月季品種二年生嫁接苗于25°C常溫及38°C/3h熱激處理，分別提取它們嫩葉的總RNA ； 2)將獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后根據(jù)所述月季RcHSP70基因的的特異序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行PCR，電泳之后進(jìn)行分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分析方法，其特征在于，正向引物序列為 5’ -ATGGCCGGAAAGGGAGAG-3’，反向引物序列5’ -TTAGTCAACTTCTTCAATCT-3’。
5.權(quán)利要求I所述的月季RcHSP70基因在提高多種非生物脅迫耐受性能中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述的月季RcHSP70基因在提高大腸桿菌對(duì)多種非生物脅迫耐受性中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述的月季RcHSP70基因在提高轉(zhuǎn)基因植物的溫度抗性中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I所述的月季RcHSP70基因在煙草中異源表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因煙草的高溫脅迫耐性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種月季RcHSP70基因及其應(yīng)用。所述月季RcHSP70基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。將本發(fā)明的基因在原核生物(大腸桿菌BL21)中表達(dá)，所獲得的大腸桿菌BL21對(duì)多種非生物脅迫耐性顯著增高。將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)，所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草有效提高了對(duì)高溫脅迫的耐性。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102925456SQ201210435158
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者蔣昌華, 李健, 秦俊, 奉樹成 申請(qǐng)人:上海植物園