專利名稱：一種手性4-羥基-4苯基丁酸酯的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法。
背景技術(shù)：
Y-羥基酸酯是一類重要的化工醫(yī)藥中間體以及很多重要生物活性化合物的重要結(jié)構(gòu)單元，其手性單一對映異構(gòu)體0 )和C )-Y_羥基酸酯均是重要的手性砌塊，4-羥基-4-苯基丁酸酯及其衍生物是合成手性內(nèi)酯或者其他一些化工醫(yī)藥類化合物的重要結(jié)構(gòu)單元。 目前所知的制備手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的方法，通常采用的是化學(xué)催化劑和酶催化酮酸酯的不對稱還原法?；瘜W(xué)方法主要采用金屬催化劑，金屬催化劑價昂貴，對環(huán)境污染大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點(diǎn)而提供一種能獲得光學(xué)純度高、成本低且安全環(huán)保的手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法。本發(fā)明的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟
(I)菌株的準(zhǔn)備將菌株在121 °C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基平板上劃線，于25-30 V靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面靜置培養(yǎng)，生長2天后于4 1保存?zhèn)溆茫?br> (2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到含有10mL PYG培養(yǎng)基的50 mL的搖瓶中，在30 1和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24h后，按5%的接種量接種于含有100 mLPYG培養(yǎng)基的500 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，獲得菌株的濕細(xì)胞備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化將所培養(yǎng)的菌株的濕細(xì)胞，以細(xì)胞濕重10g /L的濃度懸浮于100 mL、pH為6-8的緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，再加入有機(jī)溶劑5 mL，葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 °C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，獲得手性4-羥基-4-苯基丁酸酯。上述的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，其中菌種為木蘭假絲酵母{Candida magnoliae CGMCC 2. 1919)或釀酒酵母(feccAaro焊ces cerevisiae CGMCC
2.399)，既可以采用休止細(xì)胞，生長中的細(xì)胞，也可以是固定化的細(xì)胞，或者使用其所含的還原酶。上述的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，其中PYG培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸餾水I. O L，pH6.8_7· O ο上述的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，其中緩沖液為K2HPO4-KH2PO4 或 NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖液。上述的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，其中有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、正己烷、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯或甲基叔丁基醚等。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下明顯的優(yōu)點(diǎn)和有益的效果，從以上技術(shù)方案可知在生物催化反應(yīng)中，有機(jī)溶劑的影響，涉及到溶劑對酶的抑制作用，對活性中心的修飾作用以及底物的溶解性、分散度等等諸多因素。水相反應(yīng)中加入少量的有機(jī)溶劑有時也會對反應(yīng)有明顯的影響，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)加入了所選的有機(jī)溶劑，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率有所提高，而對映選擇性則基本上沒有什么改變。實(shí)驗(yàn)證明，magnoliae CGMCC 2. 1919和Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2. 399兩株酵母細(xì)胞內(nèi)含有高立體選擇性的還原酶,能有效的催化4-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不對稱還原反應(yīng)，合成手性4-羥基-4-苯基丁酸 酯。由于4-氧代-4-苯基丁酸酯易于合成且價格便宜，以其作為底物進(jìn)行不對稱氧化反應(yīng)獲取手性4-羥基-4-苯基丁酸酯是非常經(jīng)濟(jì)有效的制備途徑。本發(fā)明的具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟
(1)菌株的準(zhǔn)備將木蘭假絲酵母magnoliaeCGMCC 2. 1919)(購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)在121 °C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g，酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸懼水I. O I, pH 6. 8-7. O)平板上劃線，于25 1靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)，約2天后保存于4 °C冰箱中備用;
(2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到10mL PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸懼水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的搖瓶中，在30°〇和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24h后，按5%的接種量接種于含有100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24 h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，得木蘭假絲酵母濕細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)含有R-選擇性的羰基還原酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化取木蘭假絲酵母濕細(xì)胞5g，懸浮于50 mL pH 7. O的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，加入乙醇5 mL，葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 0C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到0 )-4_羥基-4-苯基丁酸乙酯。42%產(chǎn)率，產(chǎn)物做手性GC分析，99% ee。產(chǎn)物分析4-羥基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR和13C NMR如下=1H NMR (300MHz, CDCl3) : δ 7. 22 (d, 2H, Ph)，7. 16 (d, 2H, Ph)，4. 68 (pt. 1H, CH0H)，2. 40 (q2H, CH2), 2. 34 (s, 3H, CH3), 2. 23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), I. 25 (q, 3H,CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173，145，128，126，74，61，34，30，14.
實(shí)施例2
一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟
(I)菌株的準(zhǔn)備將釀酒酵母cerevisiae CGMCC 2. 399)(購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)在121 °C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. Og,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸餾水I. O L，pH 6. 8-7. O)平板上劃線，于30 1靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)，約2天后保存于4 V冰箱中備用；
(2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到10mL PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸懼水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的搖瓶中，在30 °〇和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24 h后，按5%的接種量接種于含有100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24 h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，得釀酒酵母濕細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)含有選擇性的羰基還原酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化取釀酒酵母濕菌體5g，懸浮于50 mL pH 7. O的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，再加入乙醇5 mL，葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 0C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到C )-4-羥基-4苯基丁酸乙酯。38%產(chǎn)率。產(chǎn)物用手性GC分析，99% ee。產(chǎn)物分析4-羥基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR和13C NMR如下=1H NMR (300MHz, CDCl3) : δ 7. 22 (d, 2H, Ph)，7. 16 (d, 2H, Ph)，4. 68 (pt. 1H, CH0H)，2. 40 (q2H, CH2), 2. 34 (s, 3H, CH3), 2. 23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), I. 25 (q, 3H,CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173，145，128，126，74，61，34，30，14.
實(shí)施例3
一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟
(I)菌株的準(zhǔn)備將木蘭假絲酵母(t/a magnoliae CGMCC 2. 1919)(購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)在121°C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸餾水I. O L，pH 6. 8-7. O)平板上劃線，于25-30 1靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)，約2天后保存于4 °〇冰箱中備用；
(2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到10mL PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸懼水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的搖瓶中，在30°〇和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24 h后，按5%的接種量接種于含有100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24 h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，得木蘭假絲酵母濕細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)含有R-選擇性的羰基還原酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化取釀酒酵母濕菌體5g，懸浮于50 mL pH 6. O的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，再加入甲醇5 mL，葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 0C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離。得到0 )-4-羥基-4苯基丁酸乙酯，21%產(chǎn)率。產(chǎn)物用手性GC分析,99% ee。 產(chǎn)物分析4-羥基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR和13C NMR如下=1H NMR (300MHz, CDCl3) : δ 7. 22 (d, 2H, Ph)，7. 16 (d, 2H, Ph)，4. 68 (pt. 1H, CHOH)，2. 40 (q2H, CH2), 2. 34 (s, 3H, CH3), 2. 23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), I. 25 (q, 3H,CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173，145，128，126，74，61，34，30，14.
實(shí)施例4
一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟
(1)菌株的準(zhǔn)備將木蘭假絲酵母magnoliaeCGMCC 2. 1919)(購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)在121°C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g，酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸懼水I. O I, pH 6. 8-7. O)平板上劃線，于25-30°C靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)，約2天后保存于4 °C冰箱中備用；
(2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到10mL PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸餾水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的搖瓶中，在30°C和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24h后，按5%的接種量接種于含有100 mL生長培養(yǎng)基的500mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24 h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，得木蘭假絲酵母濕細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)含有TP-選擇性的羰基還原酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化取木蘭假絲酵母濕細(xì)胞5g，懸浮于50 mL pH 7. O的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，加入正己烷5mL，葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 0C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到0 )-4-羥基-4-苯基丁酸乙酯。19%產(chǎn)率，產(chǎn)物做手性GC分析，99% ee。產(chǎn)物分析4-羥基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR和13C NMR如下=1H NMR (300MHz, CDCl3) : δ 7. 22 (d, 2H, Ph)，7. 16 (d, 2H, Ph)，4. 68 (pt. 1H, CH0H)，2. 40 (q2H, CH2), 2. 34 (s, 3H, CH3), 2. 23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), I. 25 (q, 3H,CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173，145，128，126，74，61，34，30，14.
實(shí)施例5
一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟
(I)菌株的準(zhǔn)備將釀酒酵母cerevisiae CGMCC 2. 399)(購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)在121°C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸餾水I. O L，pH 6. 8-7. O)平板上劃線，于25-30 1靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)，約2天后保存于4 °〇冰箱中備用；(2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到10mL PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸懼水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的搖瓶中，在30°〇和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24 h后，按5%的接種量接種于含有100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24 h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，得釀酒酵母濕細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)含有選擇性的羰基還原酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化取釀酒酵母濕菌體5g，懸浮于50 mL pH 6. O的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，再加入四氫呋喃5 mL,葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 0C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到(5)-4-羥基-4-苯基丁酸乙酯。33%產(chǎn)率。產(chǎn)物用手性GC分析，99% ee。產(chǎn)物分析4-羥基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR和13C NMR如下=1H NMR (300 MHz, CDCl3) : δ 7. 22 (d, 2H, Ph)，7. 16 (d, 2H, Ph)，4. 68 (pt. 1H, CH0H)，2. 40 (q2H, CH2), 2. 34 (s, 3H, CH3), 2. 23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), I. 25 (q, 3H,CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173，145，128，126，74，61，34，30，14.
實(shí)施例6
一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟
(1)菌株的準(zhǔn)備將木蘭假絲酵母magnoliaeCGMCC 2. 1919)(購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)在121 °C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g，酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸懼水I. O I, pH 6. 8-7. O)平板上劃線，于25-30 1靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)，約2天后保存于4 °〇冰箱中備用；
(2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到10mL PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸懼水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的搖瓶中，在30°〇和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24h后，按5%的接種量接種于含有100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24 h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，得木蘭假絲酵母濕細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)含有R-選擇性的羰基還原酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化取木蘭假絲酵母濕細(xì)胞5g，懸浮于50 mL pH 7. O的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，加入N，N-二甲基甲酰胺5mL，葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 °C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到0 )-4-羥基-4苯基丁酸乙酯。26%產(chǎn)率，產(chǎn)物做手性GC分析，99% ee。產(chǎn)物分析4-羥基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR和13C NMR如下=1H NMR (300MHz, CDCl3) : δ 7. 22 (d, 2H, Ph)，7. 16 (d, 2H, Ph)，4. 68 (pt. 1H, CH0H)，2. 40 (q2H, CH2), 2. 34 (s, 3H, CH3), 2. 23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), I. 25 (q, 3H,CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173，145，128，126，74，61，34，30，14。
實(shí)施例7
一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟
(I)菌株的準(zhǔn)備將釀酒酵母cerevisiae CGMCC 2. 399)(購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)在121 °C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. Og,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸餾水I. O L，pH 6. 8-7. O)平板上劃線，于25-30 1靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)，約2天后保存于4°C冰箱中備用；
(2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到10mL PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸懼水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的搖瓶中，在30°〇和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24 h后，按5%的接種量接種于含有100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24 h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，得釀酒酵母濕細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)含有選擇性的羰基還原酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化取釀酒酵母濕菌體5g，懸浮于50 mL pH 8. O的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，再加入甲苯5 mL，葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 0C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，得到C )-4-羥基-4苯基丁酸乙酯。22%產(chǎn)率。產(chǎn)物用手性GC分析,99% ee。產(chǎn)物分析4-羥基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR和13C NMR如下=1H NMR (300MHz, CDCl3) : δ 7. 22 (d, 2H, Ph)，7. 16 (d, 2H, Ph)，4. 68 (pt. 1H, CH0H)，2. 40 (q2H, CH2), 2. 34 (s, 3H, CH3), 2. 23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), I. 25 (q, 3H,CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173，145，128，126，74，61，34，30，14.
實(shí)施例8
一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟
(1)菌株的準(zhǔn)備將木蘭假絲酵母magnoliaeCGMCC 2. 1919)(購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)在121 °C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g，酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸懼水I. O I, pH 6. 8-7. O)平板上劃線，于25-30°C靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)，約2天后保存于4 °C冰箱中備用；
(2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到10mL PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,蒸懼水I. O L, pH 6. 8-7. O)的50 mL的搖瓶中，在30°〇和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24h后，按5%的接種量接種于含有100 mL生長培養(yǎng)基的500 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24 h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，得木蘭假絲酵母濕細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)含有R-選擇性的羰基還原酶)備用；
(3)生物轉(zhuǎn)化取木蘭假絲酵母濕細(xì)胞5g，懸浮于50 mL pH 7. O的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，加入甲基叔丁基醚5 mL，葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 °C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離。得到0 )-4-羥基-4-苯基丁酸乙酯，19%產(chǎn)率，產(chǎn)物做手性GC分析，99% ee。產(chǎn)物分析4-羥基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR和13C NMR如下=1H NMR (300MHz, CDCl3) : δ 7. 22 (d, 2H, Ph)，7. 16 (d, 2H, Ph)，4. 68 (pt. 1H, CH0H)，2. 40 (q2H, CH2), 2. 34 (s, 3H, CH3), 2. 23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), I. 25 (q, 3H,CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173，145，128，126，74，61，34，30，14. 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟 (I)菌株的準(zhǔn)備將菌株在121 °C滅菌20 min的PYG培養(yǎng)基平板上劃線，于25-30 V靜置培養(yǎng)I天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面靜置培養(yǎng)，生長2天后于4 1保存?zhèn)溆茫? (2)細(xì)胞的培養(yǎng)挑取上述斜面培養(yǎng)的種子，接種到含有10mL PYG培養(yǎng)基的50 mL的搖瓶中，在30 1和200 rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行培養(yǎng)24h后，按5%的接種量接種于含有100 mLPYG培養(yǎng)基的500 mL的大搖瓶中，在搖床上培養(yǎng)24h后取出，在4 1和8000 rpm的條件下離心去除上清液，所得細(xì)胞在4 1下用生理鹽水洗滌二次，離心，獲得菌株的濕細(xì)胞備用； (3)生物轉(zhuǎn)化將所培養(yǎng)的菌株的濕細(xì)胞，以細(xì)胞濕重10g /L的濃度懸浮于100 mL、pH為6-8的緩沖液中，將底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反應(yīng)體系之中，再加入有機(jī)溶劑5 mL，葡萄糖250 mg，放入搖床反應(yīng)(30 °C, 300 rpm)，HPLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心處理取上清液，加入氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，獲得手性4-羥基-4-苯基丁酸酯。
2.如權(quán)利要求I所述的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，其中菌種為木蘭假絲酵母magnoliae CGMCC 2.cerevisiaeCGMCC 2. 399)，既可以采用休止細(xì)胞，生長中的細(xì)胞，也可以是固定化的細(xì)胞，或者使用其所含的還原酶。
3.如權(quán)利要求I或2所述的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，其中PYG培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10. O g,酵母提取物5. O g,葡萄糖I. O g,瓊脂15. O g,蒸懼水I.O L, pH 6. 8-7. O。
4.如權(quán)利要求3所述的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，其中緩沖液為K2HPO4-KH2PO4 或 NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖液。
5.如權(quán)利要求4所述的一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，其中有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、正己烷、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、苯或甲基叔丁基醚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種手性4-羥基-4-苯基丁酸酯的制備方法，包括以下步驟將木蘭假絲酵母(CandidamagnoliaeCGMCC2.1919)或釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeCGMCC2.399)在121℃滅菌20min的PYG培養(yǎng)基平板上劃線，于25-30℃靜置培養(yǎng)1天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面靜置培養(yǎng)，生長2天后于4℃保存?zhèn)溆?；常?guī)細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明獲得的產(chǎn)品光學(xué)純度高、成本低且安全環(huán)保。
文檔編號C12R1/72GK102925500SQ20121043546
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者陳永正, 卓俊睿, 鄭代軍 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院