專(zhuān)利名稱(chēng)：SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)類(lèi)豬圓環(huán)病毒P1的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl (即是類(lèi)豬圓環(huán)病毒2型因子P1，見(jiàn)溫立斌等，一株類(lèi)豬圓環(huán)病毒2型因子Pl的全基因組序列測(cè)定與分析，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010年02期，41Γ416)的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，為單股環(huán)狀DNA病毒，是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒?，F(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，即PCVl和PCV2。PCVl為非致病性的病毒。PCV2為致病性的病毒，可引起圓環(huán)病毒相關(guān)疾病，其中最 重要的是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)。本病最早發(fā)現(xiàn)于加拿大(1991)，很快在歐美及亞洲一些國(guó)家包括我國(guó)發(fā)生和流行，除PMWS外，PDNS (豬皮炎與腎病綜合征)、PNP (增生性壞死性肺炎)、PRDC (豬呼吸道疾病綜合征)、繁殖障礙、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關(guān)聯(lián)。此外，PCV2感染可導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，引起免疫失敗以及繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)已被世界各國(guó)的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為引起豬免疫障礙的重要傳染病(Segal^ s等Porcine circovirusdiseases . Anim Health Res Rev, 2005, 6: 119 - 142)。類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl是新近發(fā)現(xiàn)的病毒，可引起感染豬出現(xiàn)類(lèi)似PMWS癥狀(Wen 等 A novel porcine circovirus-like agent Pl is associated with wastingsyndromes in pigs. PLoS ONE 2012，7(8) : e41565)。它不僅擁有單股環(huán)狀DNA基因組，而且其核苷酸序列大部分與PCV2的高度同源(Wen等Complete genome sequence of anovel porcine circovirus-like agent. J Virol. 2012, 86(1): 639XSYBR Green I 是一種雙鏈DNA結(jié)合染料，其特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。與其他實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相比，SYBR Green I在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，而且通過(guò)融解曲線(xiàn)分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，區(qū)分非特異性擴(kuò)增。由于Pl擁有與PCV2高度同源的序列，目前報(bào)道的診斷Pl的定量PCR方法尚無(wú)法鑒別Pl和PCV2，只能結(jié)合普通PCR結(jié)果綜合判斷(溫立斌等SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)類(lèi)豬圓環(huán)病毒因子Pl.華北農(nóng)學(xué)報(bào).2009，4:31-35)。本發(fā)明利用反向PCR原理，設(shè)計(jì)新型特異性引物，采用的絕對(duì)定量技術(shù)，為樣本中類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl載量消長(zhǎng)規(guī)律等方面的研究提供方法，為Pl流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、致病機(jī)理的研究提供技術(shù)支持。同時(shí)還可區(qū)分Pl與PCV2的感染提供技術(shù)平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl的熒光定量PCR檢測(cè)引物和方法。該方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)IO1個(gè)拷貝的病毒分子，具有良好的特異性和重復(fù)性。不僅可對(duì)Pl進(jìn)行定量，還可對(duì)PCV2定性加以鑒別，從而為類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl的檢測(cè)和監(jiān)控提供有效方法。技術(shù)方案
一種類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，其特征在于，
上游引物5’ AAGACCCCCCACTTAAACCC 3’ ；
下游引物5’ GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT 3’
其目的擴(kuò)增片段為119 bp,擴(kuò)增序列具體如下 AAGACCCCCCACTTAAACCCTAAATGAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC。
所述的引物用于類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法為
(O定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建與制備
以提取的類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl DNA為模板，用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增含有靶序列的基因片段，PCR反應(yīng)體系為2 XPCR TaqMix 12. 5 μ L、50 μ mol/L的上游引物O. 25 μ L、50ymol/L的下游引物0. 25 μ L, DNA模板2. 5 μ L、無(wú)菌雙蒸水9. 5 μ L，總反應(yīng)體系為25 μ L ；
反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變形30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物于質(zhì)量比2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳；
PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，通過(guò)膠回收純化目的片段，然后將目的片段119 bp與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行提純，獲得定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；
(2)抽提樣品病毒DNA，與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按照以下定量PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系為12.5yL 2 X UltraSYBR Mix, 10 μ M正向引物、反向引物各
O.025 μ L，待測(cè)樣品的DNA 2 μ L，補(bǔ)充雙蒸水至25 μ L ;
PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C IOmin; 95V 15 sec, 60°C 30 sec,進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)；
待測(cè)樣品的結(jié)果判定當(dāng)待測(cè)樣品實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果有“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)，Ct值彡34. O且Tm值介于82. (TC——83. (TC之間時(shí)，判定待測(cè)樣品中含有類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl。有益效果
本發(fā)明采用SYBR Green I熒光定量PCR進(jìn)行類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl的檢測(cè)，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
I.檢測(cè)快速、高效該檢測(cè)方法在PCR反應(yīng)結(jié)束后，可立即通過(guò)儀器自帶軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)判定，不需要瓊脂糖凝膠電泳、EB染色來(lái)觀察結(jié)果，減少了環(huán)境污染和樣品交叉污染，從核酸提取到結(jié)果判定僅需3小時(shí)，一次可以進(jìn)行96個(gè)樣品的檢測(cè)。2.準(zhǔn)確定量通過(guò)制備標(biāo)準(zhǔn)品及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值，可以對(duì)待測(cè)樣品中的類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl進(jìn)行定量，準(zhǔn)確度高。3.精確定量，靈敏度聞在標(biāo)準(zhǔn)品IOci IO8拷貝范圍內(nèi)都有極好的線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)范圍可達(dá)9個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)下限可達(dá)10個(gè)拷貝以下，具有極高的靈敏度。4.特異性強(qiáng)特異性引物可與類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl特異性結(jié)合，與PCV2雖然也可結(jié)合，但通過(guò)融解曲線(xiàn)分析，可以鑒別PCV2的感染，解決了以前定量PCR技術(shù)無(wú)法鑒別Pl與PCV2混合感染的問(wèn)題。


圖I.類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖
圖2.實(shí)施例中熒光定量PCR特異性檢測(cè)的融解曲線(xiàn)圖(A) PI; (B)PCV2; (C-E)PRV, PRRSV 和 PPV
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和實(shí)質(zhì)，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。 實(shí)驗(yàn)試劑和材料
類(lèi)豬圓環(huán)病毒P1、豬圓環(huán)病毒2型PCV2、豬細(xì)小病毒PPV、豬偽狂犬病毒PRV和豬藍(lán)耳病病毒PRRSV均為公知公用((類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl即是類(lèi)豬圓環(huán)病毒2型因子P1，見(jiàn)溫立斌等，一株類(lèi)豬圓環(huán)病毒2型因子Pl的全基因組序列測(cè)定與分析，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010年02期，411116;豬圓環(huán)病毒2型PCV2、豬細(xì)小病毒PPV、豬偽狂犬病毒PRV見(jiàn)潘群興等，檢測(cè)PCV2、PPV、PRV疫苗株與野毒株的多重PCR方法，中國(guó)病毒學(xué)，2005年6期，603 606 ;豬藍(lán)耳病病毒PRRSV見(jiàn)李彬等，我國(guó)長(zhǎng)江流域PRRSV 0RF3基因的遺傳變異分析，華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011年3期，20Γ209)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所自行分離、鑒定及提供，DH5 α購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，pMD18_T載體購(gòu)于TaKaRa Biotechnology Co. , Ltd,膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Biomiga公司，病毒DNA提取試劑盒購(gòu)于北京天恩澤基因科技有限公司，ABI 7500型定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司。實(shí)驗(yàn)方法 I.引物設(shè)計(jì)
從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得所有類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl的基因組序列，通過(guò)DNAman軟件進(jìn)行序列比對(duì)，得到類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl的特異性保守序列。通過(guò)0LIG06. O軟件對(duì)該保守序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，得到一對(duì)特異性引物，目的擴(kuò)增片段為119bp。上游引物5’AAGACCCCCCACTTAAACCC 3’ ；
下游引物5’ GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT 3’。2.定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建與制備
以提取的GenBank登錄號(hào)為EF514716的類(lèi)豬圓環(huán)病毒2型因子Pl基因組全長(zhǎng)質(zhì)粒DNA序列(公知公用，見(jiàn)溫立斌等，一株類(lèi)豬圓環(huán)病毒2型因子Pl的全基因組序列測(cè)定與分析，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010年02期，P413左I. 3. 3部分PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序)為模板，用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增含有靶序列的基因片段，PCR反應(yīng)體系為2XPCRTaqMix 12. 5 μ L、上游引物(50 μ mol/L)0. 25 μ L、下游引物(50 μ mol/L)0. 25μ L、DNA 模板
2.5 μ L、無(wú)菌雙蒸水9.5 μ L，總反應(yīng)體系為25 μ L。反應(yīng)條件為941預(yù)變性51^11，941變形30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，通過(guò)膠回收純化目的片段，然后將目的片段與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行提純，獲得定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定0D260和0D280值計(jì)算質(zhì)粒濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)。質(zhì)粒濃度(μg/ μ I) =0D260 X 稀釋倍數(shù) X 50/1000 ；
質(zhì)粒拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度X 6. 02 X IO2ViOOOM, M為質(zhì)粒分子量
3.熒光定量PCR方法的優(yōu)化與建立
通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中不同濃度的定量PCR引物，變性、退火/延伸的溫度和時(shí)間等實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，選擇反應(yīng)靈敏度高、本底熒光信號(hào)低、具有典型S型擴(kuò)增曲線(xiàn)、反應(yīng)效率接近于I的反應(yīng)體系。本發(fā)明使用的熒光定量PCR儀為ABI 7500。經(jīng)優(yōu)化后確定反應(yīng)體系采用兩步法，95°C預(yù)變性lOmin; 95°C變性15 sec, 60°C退火/延伸30 sec,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。25 μ I最佳反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.一種類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，其特征在于， 上游引物5’ AAGACCCCCCACTTAAACCC 3’ ； 下游引物5’ GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT 3’ 其目的擴(kuò)增片段為119 bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物，其用于類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl的SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法為 (O定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建與制備 以提取的類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl DNA為模板，用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增含有靶序列的基因片段，PCR反應(yīng)體系為2XPCR TaqMix 12. 5 μ L、50 μ mol/L權(quán)利要求I所述的上游引物O. 25 μ L、50 μ mol/L的下游引物O. 25 μ L、DNA模板2. 5 μ L、無(wú)菌雙蒸水9. 5 μ L,總反應(yīng)體系為25μ L ; 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變形30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)，.72°C延伸 10 min ； PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物于質(zhì)量比2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳； PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，通過(guò)膠回收純化目的片段，然后將權(quán)利要求I所述的目的片段.119 bp與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行提純，獲得定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒； (2)抽提樣品病毒DNA，與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按照以下定量PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為12.5yL 2 X UltraSYBR Mix, 10 μ M正向引物、反向引物各O. 025 μ L，待測(cè)樣品的DNA 2 μ L，補(bǔ)充雙蒸水至25 μ L ; PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C IOmin; 95V 15 sec, 60°C 30 sec,進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)； 待測(cè)樣品的結(jié)果判定當(dāng)待測(cè)樣品實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果有“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)，Ct值≤34. O且Tm值介于82. (TC——83. (TC之間時(shí)，判定待測(cè)樣品中含有類(lèi)豬圓環(huán)病毒Pl。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)類(lèi)豬圓環(huán)病毒P1的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括特異性引物的設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增方法的建立和優(yōu)化、樣本DNA提取及結(jié)果檢測(cè)判定。本發(fā)明檢測(cè)靈敏度高，穩(wěn)定性高、特異性好，可以檢測(cè)樣本中類(lèi)豬圓環(huán)病毒P1的含量，同時(shí)可以鑒別樣本中豬圓環(huán)病毒2型的感染。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102888471SQ20121043658
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者溫立斌, 何孔旺, 高曉靜, 王小敏, 李彬, 郭容利, 俞正玉, 茅愛(ài)華, 倪艷秀, 張雪寒, 呂立新, 周俊明, 胡屹屹, 汪偉, 葉青, 祝昊丹, 于洋, 沈江萍, 周萍 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院