專利名稱：一種粘桿菌素菌種篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及粘桿菌素菌種篩選方法。
背景技術(shù)：
粘桿菌素(CbJi1Sii/ )國內(nèi)又稱粘菌素、抗敵素、克利斯汀，是1947年由美國和英國的學(xué)者在多粘芽孢桿菌培養(yǎng)液中與多粘菌素B {Polymyxin B、一起發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時被稱為多粘菌素E {Polymyxin E\后來由粘桿菌素芽孢桿菌OfeciJAz1SCWi1SiiZW1S)發(fā)酵生產(chǎn)，改稱為粘桿菌素。它是一種帶有氨基酸環(huán)和脂肪酸側(cè)鏈的堿性環(huán)肽類抗生素，能與細(xì)菌細(xì)胞膜上的脂類結(jié)合而擾亂細(xì)胞膜功能，并能破壞細(xì)胞壁的完整性，對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、流感桿菌、百日咳桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌特別是綠膿桿菌有很強(qiáng)的殺菌作用，且不易產(chǎn)生抗藥性。多粘菌素菌種篩選是提聞、穩(wěn)定菌種質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一直以來，多粘菌素聞廣菌株篩選采用自然分離、紫外誘變等隨機(jī)性較強(qiáng)的方法。這些方法篩選效率低，周期長。另外，菌株產(chǎn)能測定多采用高壓液相色譜儀。由于菌株篩選經(jīng)過初篩和復(fù)試兩個階段，每批需測樣品均在150-180個以上，且發(fā)酵樣品檢測處理繁瑣，工作量大，液相色譜檢測所需時間較長，不僅降低了篩選效率，還影響高產(chǎn)菌株保存的最佳時期，對菌種活性造成一定損傷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選效率高，周期短，檢測方便的粘桿菌素菌種篩選方`法。
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本發(fā)明提供的粘桿菌素菌種篩選方法，包括將多粘芽孢桿菌(Mcilluscolistinus)加到含有L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基中，單菌落成熟后傳斜面保存，同時接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)成熟后離心，取上清加入指示菌菌液中培養(yǎng)，制成被檢測樣品，檢測被檢測樣品的吸光度，選擇吸光度低的菌株保藏留用。本發(fā)明更為具體的多粘菌素菌種篩選方法，包括以下步驟
a、固體培養(yǎng)將多粘芽孢桿菌稀釋至10_3-10_6個/mL，取O.2 mL涂布到含有O. 2mg/mL的L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基中，于28°C -37°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)72-100 h ;所述固體培養(yǎng)基由O. 2mg/mL L-天門冬氨酸、1%_3%葡萄糖、1%_3%酵母膏、O. 1%-0. 5%蛋白胨、
O.1%-0. 5%氯化鈉、2. 2%瓊脂、余量為水的組分組成，pH6. 0-7. O ；
b、斜面培養(yǎng)在含有L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基上挑取外形規(guī)則的單菌落，劃線涂布于斜面培養(yǎng)基上，于28°C -37°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)72-100 h ;所述斜面培養(yǎng)基的成分與a步驟中的固體培養(yǎng)基成分相同；
C、發(fā)酵培養(yǎng)將斜面培養(yǎng)基上成熟的斜面菌苔用接種針轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于280C -37°C, 200 rpm條件下震蕩培養(yǎng)72-96 h，離心，得發(fā)酵上清液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基由3-5%豆柏粉、1-3%硫酸銨、O. 05-0. 10%磷酸二氫鉀、O. 01-0. 07%七水硫酸亞鐵、余量為水組分組成，ρΗ6· 0-7. O ；d、制備指示菌菌液取-80°C保存的大腸桿菌于37°C_38°C水浴快速化凍，按照2%_3%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中；所述LB培養(yǎng)基由O. 5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1%氯化鈉組成，pH7. 0-7. 2 ；
e、制備被檢測樣品取c步所制發(fā)酵上清液30-50μ L加入250-270 μ L d步所制指示菌菌液中，于37°C，200 rpm條件下用96孔板震蕩培養(yǎng)2_3 h ；
f、高產(chǎn)菌株篩選取被檢測樣品200μ L至96孔酶標(biāo)板中，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測，選擇吸光值最低的菌株進(jìn)行保藏留用。本發(fā)明方法，在于所采用的酶標(biāo)儀，其濾光片波長優(yōu)選條件是設(shè)置在660 nm進(jìn)行吸光度檢測。本發(fā)明是以大腸桿菌為指示菌，向含有大腸桿菌的指示菌菌液中加入經(jīng)培養(yǎng)的多粘菌素菌株，再培養(yǎng)一定時間后，測定培養(yǎng)液的吸光度；吸光度越低，意味著培養(yǎng)液中大腸桿菌受到的抑制作用越強(qiáng)。經(jīng)測定表明，大腸桿菌受到的抑制作用強(qiáng)弱與粘桿菌素效價高低成正比，因此，可據(jù)此挑選出粘桿菌素高產(chǎn)菌株。本發(fā)明的方法大大提高了多粘菌素菌種篩選速度；將篩選周期由原來的3-4周縮短到I周，篩選效率提高了 70%以上。



圖1本發(fā)明方法中被檢測樣品吸光度與菌株效價的對應(yīng)性考察圖。其中O表示生物效益,O表示HPLC檢測效益，國表示吸光度。圖2本發(fā)明方法中被檢測樣品的菌株效價檢測值與被檢測樣品吸光度之間的對應(yīng)關(guān)系。其中E□表示HPLC檢測效益，麵表示生物效價檢測值。
具體實(shí)施例方式下面用具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但并不以任何方式意味著對本發(fā)明進(jìn)行限制。下述實(shí)施例所采用的多粘芽孢桿菌出發(fā)菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(編號為CGMCC N0:4099)。大腸桿菌購自中國藥檢所(編號為CMCC(B) 44103)，其他原料均為市售。實(shí)施例1
a、固體培養(yǎng)將多粘芽孢桿菌稀釋到10_3個/mL，取O.2 mL均勻涂布的固體培養(yǎng)基上，于28°C_30°C，相對濕度為40%條件下培養(yǎng)72 h，得到單菌落；所述的固體培養(yǎng)基為以L-天門冬氨酸？ g、葡萄糖lg、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨O. lg、氯化鈉O. lg、瓊脂2. 2g、水？ g的組分，按照常規(guī)方法制成、PH6. 0-7. O ；
b、斜面培養(yǎng)在含有L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基上挑取外形規(guī)則的單菌落，劃線涂布于斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基成分與a步驟中的固體培養(yǎng)基一致；培養(yǎng)條件也與a步驟相同。C、發(fā)酵培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基上成熟的斜面菌苔與20%甘油溶液混勻進(jìn)行冷凍保藏，同時取約O. 25 cm2菌苔接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C _30°C，200 rpm條件下震蕩培養(yǎng)96 h，得粘桿菌素發(fā)酵液；離心，得發(fā)酵上清液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為以豆柏粉3g、硫酸銨lg、磷酸二氫鉀O. 05g、七水硫酸亞鐵O. Olg、余量為水的組分組成，pH6. 0-7. O ；
d、制備指示菌液取_80°C保存的大腸桿菌于37°C_38°C水浴快速化凍，按照2%_3%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中；所述LB培養(yǎng)基由酵母提取物O. 5g，胰蛋白胨lg，氯化鈉IgdK97. 5 g，按照常規(guī)方法制成，pH7. 0-7. 2 ；
e、制備被檢測樣品取c步驟中所制備的發(fā)酵上清液30μ L加入到d步驟中所制備的250 “1^指示菌液中，于371，200 rpm條件下用96孔板震蕩培養(yǎng)2_3 h ；
f、高產(chǎn)菌株篩選取被檢測樣品，設(shè)置酶標(biāo)儀濾光片波長為660nm進(jìn)行吸光度檢測，吸光值最低的被檢測樣品中的菌株即為高產(chǎn)菌株。選擇吸光值低的菌株進(jìn)行保藏j^HPLC方法檢測，其中的粘桿菌素效價為1-8萬U/mL
實(shí)施例2被檢測樣品吸光度與菌株效價對應(yīng)性考察
選取同批次三株菌株進(jìn)行HPLC效價測定，并繪制平均吸光值、HPLC效價及平均生物效價柱狀圖(如圖1)，結(jié)果顯示，生物效價高的菌株其相應(yīng)吸光值低、對應(yīng)的HPLC檢測實(shí)際效價高；生物效價低的菌株，其相應(yīng)吸光值高、對應(yīng)的HPLC檢測實(shí)際效價低。由圖1也可明顯看出指示劑吸光度與發(fā)酵液效價的對應(yīng)性良好，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)O. 99以上。 實(shí)施例3:
a、固體培養(yǎng)將多粘芽孢桿菌稀釋到10_6個/mL，取O.2 mL均勻涂布的固體培養(yǎng)基上，于35°C_37°C，相對濕度為60%條件下培養(yǎng)96 h，得到單菌落；所述的固體培養(yǎng)基為以L-天門冬氨酸O. 2mg/mL、葡萄糖3g、酵母膏3g、蛋白胨O. 5g、氯化鈉O. 5g、瓊脂2. 2g、余量為水的組分，按照常規(guī)方法制成、PH6. 0-7. O ；
b、斜面培養(yǎng)在含 有L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基上挑取外形規(guī)則的單菌落，劃線涂布于斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基成分與a步驟中的固體培養(yǎng)基一致；培養(yǎng)條件也與a步驟相同；
C、發(fā)酵培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基上成熟的斜面菌苔約取O. 20 cm2菌苔接種于20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32°C-35°C，200 rpm條件下震蕩培養(yǎng)72 h，得粘桿菌素發(fā)酵液；離心，得發(fā)酵上清液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為以豆柏粉5g、硫酸銨3g、磷酸二氫鉀O. Olg、七水硫酸亞鐵O. 07g、余量為水的組分組成，PH6. 0-7. O ；
d、制備指示菌液取_80°C保存的大腸桿菌于37°C_38°C水浴快速化凍，按照2%_3%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中；所述LB培養(yǎng)基由酵母提取物O. 5g，胰蛋白胨lg，氯化鈉IgdK97. 5 g，按照常規(guī)方法制成，pH7. 0-7. 2 ；
e、制備被檢測樣品取c步驟中所制備的發(fā)酵上清液50μ L加入到d步驟中所制備的270 “1^指示菌液中，于371，200 rpm條件下用96孔板震蕩培養(yǎng)2_3 h ；
f、高產(chǎn)菌株篩選取被檢測樣品，設(shè)置酶標(biāo)儀濾光片波長為660nm進(jìn)行吸光度檢測，吸光值最低(吸光度為O. 198)即為高產(chǎn)菌株。選擇吸光值低的菌株進(jìn)行保藏j^HPLC方法檢測，其中的粘桿菌素效價為5. 9萬U/mL。
權(quán)利要求
1.一種粘桿菌素菌種篩選方法，包括將多粘芽孢桿菌UaciBm colistinus)加到含有L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基中，單菌落成熟后傳斜面保存，同時接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)成熟后離心，取上清加入指示菌菌液中培養(yǎng)，制成被檢測樣品，檢測被檢測樣品的吸光度，選擇吸光度低的菌株保藏留用。
2.一種多粘菌素菌種篩選方法，其特征在它包括以下步驟 a、固體培養(yǎng)將多粘芽孢桿菌稀釋至10_3-10_6個/mL，取O.2 mL涂布到含有O. 2mg/mL的L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基中，于28°C -37°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)72-100 h ;所述固體培養(yǎng)基由質(zhì)量比為O. 2mg/mL L-天門冬氨酸、1%_3%葡萄糖、1%_3%酵母膏、O. 1%-0. 5%蛋白胨、O. 1%-0. 5%氯化鈉、2. 2%瓊脂、余量為水的組分組成，pH6. 0-7. O ； b、斜面培養(yǎng)在含有L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基上挑取外形規(guī)則的單菌落，劃線涂布于斜面培養(yǎng)基上，于28°C -37°C，40%-60%濕度條件下培養(yǎng)72-100 h ;所述斜面培養(yǎng)基的成分與a步驟中的固體培養(yǎng)基成分相同； C、發(fā)酵培養(yǎng)將斜面培養(yǎng)基上成熟的斜面菌苔用接種針轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于280C -37°C, 200 rpm條件下震蕩培養(yǎng)72-96 h，離心，得發(fā)酵上清液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基由3%-5%豆柏粉、1%-3%硫酸銨、O. 05-0. 10%磷酸二氫鉀、O. 01%-0. 07%七水硫酸亞鐵、余量為水的組分組成，PH6. 0-7. O ； d、制備指示菌菌液取-80°C保存的大腸桿菌于37°C_38°C水浴快速化凍，按照2%_3%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中；所述LB培養(yǎng)基由質(zhì)量比為O. 5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1%氯化鈉、余量為水的組分組成，PH7. 0-7. 2 ； e、制備被檢測樣品取c步所制發(fā)酵上清液30-50μ L加入250-270 μ L d步所制指示菌菌液中，于37°C，200 rpm條件下用96孔板震蕩培養(yǎng)2_3 h ； f、高產(chǎn)菌株篩選取被檢測樣品200μ L至96孔酶標(biāo)板中，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測，選擇吸光值最低的菌株進(jìn)行保藏留用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述多粘菌素菌種篩選方法，其特征在于所采用的酶標(biāo)儀，其濾光片波長設(shè)置在660 nm進(jìn)行吸光度檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種粘桿菌素菌種篩選方法，包括將多粘芽孢桿菌(Bacilluscolistinus)加到含有L-天門冬氨酸的固體培養(yǎng)基中，單菌落成熟后傳斜面保存，同時接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)成熟后離心，取上清加入指示菌菌液中培養(yǎng)，制成被檢測樣品，檢測被檢測樣品的吸光度，選擇吸光度低的菌株保藏留用。本發(fā)明所提供的方法大大提高了多粘菌素菌種篩選速度；將篩選周期由原來的3-4周縮短到1周，篩選效率提高了70%以上。
文檔編號C12N1/20GK103060227SQ20121043679
公開日2013年4月24日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者李琪, 劉聰潔, 王繪磚 申請人:河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司