β-1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及從鱗翅目昆蟲體內(nèi)提取、分離、純化獲得β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其結(jié)構(gòu)、獲得β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的分離純化制備方法以及利用基因工程技術(shù)獲得重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段的結(jié)構(gòu)和分離純化制備方法。此外，也涉及利用天然、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段作為抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體及其抗體獲得方法。同時(shí)，也涉及天然、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及其抗體，可廣泛應(yīng)用于針對(duì)微生物的預(yù)防、治療藥物以及相應(yīng)檢測(cè)、診斷等領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】β-1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的結(jié)構(gòu)及其獲得方法與應(yīng)用，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段的結(jié)構(gòu)及其制備生產(chǎn)方法，以及其在微生物及其相關(guān)分子模式檢測(cè)、誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生抗菌肽、制備β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段抗體等方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]先天性免疫是一種古老的宿主防御機(jī)制，對(duì)“非己”的識(shí)別策略不在于它們能識(shí)別每一個(gè)可能的抗原，而是能夠識(shí)別在微生物(病原體)中普遍存在的高度保守的共有結(jié)構(gòu)。這種不同于獲得性免疫系統(tǒng)的識(shí)別方式被稱為模式識(shí)別作用(Pattern recognition)。模式識(shí)別作用中包含兩種不可或缺的成分，即微生物中普遍存在的高度保守的共有結(jié)構(gòu)一病原體相關(guān)的分子模式和宿主體內(nèi)的先天性免疫識(shí)別分子-模式識(shí)別受體。
[0003]微生物中普遍存在的高度保守的共有結(jié)構(gòu)被稱為病原體相關(guān)的分子模式，(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)。已報(bào)道的 PAMPs 包括細(xì)菌脂多糖(LipopoIysaccharide, LPS)、妝聚糖(Peptidoglycan, PGN)、脂憐壁酸(Lipoteichoicacids,LTA);分枝桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、甘露聚糖(Mannan);細(xì)菌DNA中未甲基化的CpG模體；RNA病毒中的雙鏈RNA;真菌的葡聚糖(Glucan);以及許多細(xì)菌、病毒、真菌及寄生蟲表面的以甘露糖(Man)、乙酰氨基甘露糖(ManNAc)、乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)等為末端糖基的糖結(jié)構(gòu)，等等。盡管這些PAMPs的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為不同，但它們具有共同的特征:PAMPs由微生物(病原體)產(chǎn)生；PAMPs代表的是對(duì)微生物的生存所必需的保守的分子模式；PAMPs為一大組微生物所共有。
[0004]先天性免疫系統(tǒng) 中能夠識(shí)別PAMPs的受體稱為模式識(shí)別受體(Patternrecognition receptors,PRRs),也稱模式識(shí)別蛋白(識(shí)別蛋白)。這些受體通過(guò)與特異性PAMPs的結(jié)合激活存在于該生物體內(nèi)的特定蛋白酶類和利用免疫反應(yīng)組織的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而引起該生物體免疫反應(yīng)。除此之外，PRRs還可以作為促進(jìn)吞噬的調(diào)理素，或是凝集、黑化及其他蛋白質(zhì)修飾級(jí)聯(lián)反應(yīng)等免疫過(guò)程的起始因子。
[0005]其中，能與β-1，3-葡聚糖發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白被稱為β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白，也稱β-1，3-葡聚糖模式識(shí)別受體(0GRP)。目前在果蠅體內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)僅與β-1，3-葡聚糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，但在家蠶、煙草天蛾、黃粉蟲等許多昆蟲體內(nèi)則發(fā)現(xiàn)β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白，并且在與β_1，3-葡聚糖結(jié)合后可誘導(dǎo)自身酚氧化酶的活性以及進(jìn)一步激活Toll信號(hào)傳遞途徑。1988年Masaaki Ashida等人從家蠶中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)能夠與β_1,3_葡聚糖發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，該蛋白的分子量為63k Da，等電點(diǎn)為4.3，并能激活家蠶體內(nèi)的酚氧化酶原級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，從而進(jìn)一步激活Toll信號(hào)傳遞途徑。隨后，在煙草天蛾、按蚊、黃粉蟲中發(fā)現(xiàn)的PGRPs在序列特點(diǎn)、組織分布、分子量等方面與家蠶中的PGRP具有相似之處。純化后的PGRPs可不同程度的與β_1，3-葡聚糖發(fā)生特異性的結(jié)合而不與肽聚糖結(jié)合，其中煙草天蛾P(guān)GRP還可以一定程度的與磷壁酸特異性結(jié)合。實(shí)驗(yàn)證明，這些β GRPs均參與受真菌感染后的酚氧化酶原級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)以及Toll信號(hào)傳遞途徑的激活。
[0006]SOderhail在淺水螯蝦中發(fā)現(xiàn)了一種β GRP，其特殊之處在于該蛋白與脂多糖、β-1，3-葡聚糖具有相似的結(jié)合特異性而與肽聚糖不發(fā)生結(jié)合。分子量為40kDa。其結(jié)構(gòu)與革蘭陰性菌結(jié)合蛋白及葡聚糖酶的同源性較高，無(wú)葡聚糖酶催化能力。其多克隆抗體可以抑制由β_1，3-葡聚糖所介導(dǎo)的酚氧化酶的激活。
[0007]另外，鱟體內(nèi)凝固因子G是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)既可以特異性結(jié)合β-1，3_葡聚糖，又具有絲氨酸蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)是由兩種不同類型的亞基組成的異源二聚體，參與由β_1，3-葡聚糖引起的鱟血液凝集作用。對(duì)兩個(gè)亞基分別進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，β亞基是一個(gè)絲氨酸蛋白酶原而α亞基具有與β-1，3-葡聚糖特異性結(jié)合的能力。當(dāng)α亞基與β-1，3-葡聚糖結(jié)合后，可引起β亞基的自動(dòng)激活。
[0008]本發(fā)明是針對(duì)鱗翅目、天(大)蠶蛾科昆蟲體內(nèi)的β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白(3GRP)，研究該天然β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的制備方法、一級(jí)結(jié)構(gòu)(基因和蛋白質(zhì))、生物學(xué)功能以及其應(yīng)用，利用基因工程技術(shù)獲得重組β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物或類似物或活性片段以及其生物學(xué)功能和應(yīng)用。此外，利用天然、重組β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物或類似物或活性片段作為抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，同時(shí)研究了該抗體的應(yīng)用。
[0009]在Genbank中有一種柞蠶β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白的核苷酸及其氨基酸序列(登錄號(hào):JN880424.1)，該識(shí)別蛋白與本發(fā)明專利所述的β _1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白，不僅在結(jié)構(gòu)具有差異，更主要是與β_1，3-葡聚糖結(jié)合的生物活性具有非常顯著差異。為了將兩者區(qū)別開來(lái)，本專利將Genbank的β _1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白(登錄號(hào)JN880424.1)稱為β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b。目前，還沒(méi)有見到β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b的制備方法、生物學(xué)功能等方面的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0010]本
【發(fā)明內(nèi)容】
的陳述，是使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。
[0011]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。
[0012]本發(fā)明所指昆蟲是鱗翅目昆蟲，鱗翅目昆蟲優(yōu)選天(大)蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲，選自柞蠶、蓖麻蠶、天蠶、印度柞蠶、琥珀蠶、美國(guó)柞蠶、樗蠶、大山蠶、美洲天蠶、樟蠶、楓蠶，昆蟲為任何地域的天然或人工放養(yǎng)或人工飼養(yǎng)的昆蟲。為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面、清晰理解本發(fā)明，以柞蠶作為代表來(lái)描述下面的內(nèi)容，而選擇柞蠶作為代表來(lái)描述并不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。
[0013]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種從鱗翅目、天(大)蠶蛾科昆蟲中獲取β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的制備方法、結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及其應(yīng)用。首先利用蛋白提取、分離、純化技術(shù)，從鱗翅目、天(大)蠶蛾科昆蟲中分離、純化獲得天然β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白。其次，利用蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)，解析β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)(基因和蛋白質(zhì))并獲得其基因。再次，利用基因工程技術(shù)，實(shí)現(xiàn)β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白基因、β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)合蛋白提取、分離、純化技術(shù)獲得重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b。同時(shí)，利用基因重組技術(shù)，獲得了 β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的衍生物或類似物或部分片段。天然、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白以及其衍生物或類似物或部分片段以及重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b，均能特異性識(shí)別β_1，3-葡聚糖，并在昆蟲體內(nèi)激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號(hào)傳遞途徑，通過(guò)激活的Toll信號(hào)傳遞途徑而使昆蟲體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽。本發(fā)明的天然β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物或類似物或部分片段、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b以及其作為抗原產(chǎn)生抗體，均可廣泛應(yīng)用于針對(duì)微生物的預(yù)防、檢測(cè)、診斷、治療藥物等領(lǐng)域。
[0014]一、天然β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的制備
[0015]本發(fā)明所獲得天然β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括:
(I)昆蟲血淋巴作為初始原料；昆蟲血淋巴(簡(jiǎn)稱血淋巴)，是昆蟲血液(或血細(xì)胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆蟲壓榨或勻漿的體液；(2)原料分別通過(guò)親和層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、鹽析、超濾或上述方法的不同組合，分離純化得到不同純度乃至電泳純或HPLC純的β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白。
[0016]β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白的提取、分離、純化體系基本條件的特征:1.操作溫度在0°C -45°c，優(yōu)選(TC -1O0C ；2.溶液的酸堿度在pH2_pH12，優(yōu)選pH4_pH10 ；3.調(diào)節(jié)溶液酸堿度的化學(xué)試劑是常規(guī)、通用的酸或堿及其溶液，酸及其溶液優(yōu)選HC1、HAc、磷酸、檸檬酸、硫酸、硼酸，堿及其溶液優(yōu)選NaOH、KOH、Tris、檸檬酸鈉或鉀鹽、磷酸鈉或鉀鹽、硼砂；4.緩沖液是常規(guī)、通用緩沖離子對(duì)緩沖液，優(yōu)選檸檬酸根緩沖離子對(duì)、HCl-Tris緩沖離子對(duì)、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對(duì)、磷酸根緩沖離子對(duì)、醋酸根緩沖離子對(duì)、硼酸根緩沖離子對(duì)、硼酸-Tris緩沖離子對(duì)、上述各緩沖離子的組合；5.溶液或緩沖液的離子強(qiáng)度在0.0Olmol/L-0.5mol/L,優(yōu)選0.01mo`l/L-0.lmol/L。上述條件既不破壞提取、分離、純化所采用介質(zhì)的理化性質(zhì)，又不影響β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的生物活性。
[0017]將昆蟲用蒸餾水或去離子水反復(fù)清洗，采用常規(guī)方法，如蠟盤法、離心法、背血管取血法、灌注法、壓榨、勻漿法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪開法、穿刺法等，在10°c至-5°c條件下收集昆蟲血淋巴。為確保β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的生物活性，其收集及儲(chǔ)存過(guò)程需要同時(shí)滿足如下條件:(I)收集過(guò)程使用的器械、溶液、容器等均處無(wú)菌狀態(tài)，且不含有微生物相關(guān)分子模式；(2)收集后的血淋巴需放置于中性鹽溶液、或含有酚氧化酶原激活系統(tǒng)抑制劑的溶液、或含抗凝劑的溶液、或直接收集至液氮或干冰，以及上述條件的任何組合，或利用上述β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的提取、分離、純化體系基本條件特征的溶液等收集血淋巴。
[0018]1.離子交換層析分離純化β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白
[0019]取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)PH至要求條件范圍下。將處理好的樣品上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的離子交換層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以米用鹽濃度階段方式，分別用 0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、lmol/L、2mol/L、3mol/L鹽溶液進(jìn)行階段洗脫；也可以米用鹽濃度梯度方式，梯度從0.00mol/L-3mol/L。利用抗β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體檢測(cè)目的蛋白的存在情況，將含有β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的洗脫液合并儲(chǔ)存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽，或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。
[0020]離子交換層析分離純化的特征:1.層析介質(zhì)選擇陽(yáng)離子交換層析添料，如CM-離子交換層析添料或SP-離子交換層析添料或S-離子交換層析添料等陽(yáng)離子交換層析添料，此時(shí)緩沖液酸堿度選擇在PH2-PH7 ；2.層析介質(zhì)選擇陰離子交換層析添料，如Q-離子交換層析添料或DEAE-離子交換層析添料或QAE-離子交換層析添料等離子交換層析添料，此時(shí)緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12 ;3.緩沖液及其濃度選擇，按上述β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；4.洗脫的鹽溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；5.中性鹽選擇(NH4) #04或Na2SO4或NaCl或KCl，優(yōu)選NaCl ；6.分離純化操作溫度按上述β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。上述條件既不影響β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的生物活性，又不影響活性成分的分離純化。
[0021]2.親和層析分離純化β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白
[0022]取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)PH至β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。將處理好的樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的親和層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用鹽(或化學(xué)試劑)濃度梯度(0.0mol/L ~3.0mol/L 或 0.0mol/L ~6.0mol/L 或 0.0mol/L ~8.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽(或化學(xué)試劑)階段濃度洗脫方式，分別采用0.1mol/L、0.2mol/L、
0.5mol/L、lmol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L 鹽溶液進(jìn)行階段方式洗脫。利用抗β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體檢測(cè)目的蛋白的存在情況，將含有β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的洗脫液合并儲(chǔ)存?zhèn)溆茫灰部梢圆捎贸Ｒ?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽(或化學(xué)試劑)或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。
[0023]親和層析分離純化的特征:`1.親和填料的配基選擇不溶性β-1，3_葡聚糖(如CUrdlan)、i3-l，3-葡聚糖識(shí)別`蛋白抗體、肝素、刀豆素、絲氨酸蛋白酶抑制劑(如苯甲咪)；
2.分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；3.洗脫的鹽(或化學(xué)試劑)溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加鹽(或化學(xué)試劑)到需要的濃度；4.洗脫用鹽(或化學(xué)試劑)可以選擇(NH4)2SO4或Na2SO4或NaCl或KCl或尿素或鹽酸胍；5.洗脫用鹽(或化學(xué)試劑)選擇(NH4) #04或Na2SO4或NaCl或KCl的最高濃度為3.0mol/L，選擇尿素的最高濃度為8.0mol/L，選擇鹽酸胍的最高濃度為6.0mol/L ；6.如果洗脫用鹽(或化學(xué)試劑)選擇了尿素或鹽酸胍而使β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白發(fā)生變性作用，可以通過(guò)常規(guī)、通用的蛋白質(zhì)復(fù)性方法進(jìn)行復(fù)性而獲得β _1，3-匍聚糖識(shí)別蛋白。
[0024]3.疏水層析分離純化β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白
[0025]取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)PH至β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。加中性鹽至2mol/L濃度，上樣于預(yù)先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液平衡的疏水層析柱，先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用中性鹽濃度梯度(2.0mol/L~0.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽濃度階段洗脫方式，分別采用1.5mol/L、l.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性鹽溶液進(jìn)行階段方式洗脫。利用抗β _1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體檢測(cè)目的蛋白的存在情況，將含有β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的洗脫液合并儲(chǔ)存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。
[0026]疏水層析分離純化的特征:1.疏水層析介質(zhì)選擇苯基-疏水層析添料或正辛烷-疏水層析添料-或己烷-疏水層析添料-或丁烷-疏水層析添料；2.中性鹽選擇(NH4)#04或Na2SO4或NaCl ；3.分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按β_1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。
[0027]4.凝膠層析分離純化β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白
[0028]取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)PH至β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。樣品液上樣于預(yù)先用緩沖液平衡好的凝膠過(guò)濾層析柱并進(jìn)行分離純化洗脫，利用抗β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體檢測(cè)目的蛋白的存在情況，將含有β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的洗脫液合并儲(chǔ)存?zhèn)溆?；也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。
[0029]凝膠層析分離純化的特征:1.層析介質(zhì)可以選擇Sephacryl S-100 HR或Sephacryl S_200 HR或 Sephadex G-50 或 Sephadex G-75或 Sephadex G-100 或 SephadexG-150 或 Superose 12 prep grade 或 Superose 6 prep grade 或 Superdex 30 prep grade或 Superdex 75 prep grade 或 Superose 12HR 或 Superose 6 HR 或 Superdex Peptide HR或Superdex 75 HR或Superdex peptide PE等凝膠層析添料；2.分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征，此外洗脫液的濃度，優(yōu) 選在離子濃度大于0.15mol/L及以上。
[0030]5.鹽析分離純化β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白
[0031]取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)PH至β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。在樣品溶液中加入蛋白質(zhì)鹽析常規(guī)、通用的中性鹽，至濃度達(dá)到β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白仍處于溶解狀態(tài)，而一些雜蛋白處于沉淀。離心取其上清溶液繼續(xù)加入鹽析常規(guī)、通用的中性鹽至濃度達(dá)到β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白沉淀狀態(tài)。離心棄上清，沉淀溶于β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件特征的溶液或緩沖液儲(chǔ)存?zhèn)溆?；沉淀的溶解液，也可以采用常?guī)、通用透析或超濾方法，除去其中的鹽或再進(jìn)一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲(chǔ)存上述樣品溶液備用。
[0032]鹽析分離純化的特征:1.分離純化的緩沖液、酸堿度選擇，是按β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；2.分離純化操作溫度在(TC-45°C，優(yōu)選(TC ;3.鹽析使用的中性鹽，選擇(NH4) 2S04或Na2SO4或NaCl，優(yōu)選(NH4) 2S04或Na2SO4 ；
4.在使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白處于溶解狀態(tài)，選擇中性鹽在5%-40%，優(yōu)選20%-35%;
5.在使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白處于鹽析沉淀狀態(tài)，選擇中性鹽在45%-85%，優(yōu)選45% -65% .
[0033]6.超濾分離純化β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白以及處理β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白溶液
[0034]取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調(diào)PH至β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內(nèi)。利用常規(guī)、通用超濾方法，分離純化β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白。一種方案，選擇一定規(guī)格的超濾膜，使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白透過(guò)超濾膜，而一些雜蛋白則被超濾膜截留，從而使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白得以分離純化；透過(guò)超濾膜的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白溶液，再選擇一定規(guī)格的超濾膜，使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白被截留，而一些雜蛋白則透過(guò)超濾膜，從而使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白得以分離純化。另一種方案，是選擇一定規(guī)格的超濾膜，使β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白先被超濾膜截留，隨后再選擇一定規(guī)格的超濾膜，使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白透過(guò)超濾膜，從而使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白得以分離純化。
[0035]超濾處理β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白溶液的目的，是除去β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白溶液中的鹽或小分子雜質(zhì)或更換緩沖液。此外，對(duì)β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白溶液進(jìn)行濃縮。處理方法同上所述，選擇一定規(guī)格的超濾膜，使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白被超濾膜截留，而鹽或小分子雜質(zhì)或緩沖液的緩沖離子對(duì)則透過(guò)超濾膜，從而實(shí)現(xiàn)去除鹽、小分子雜質(zhì)或更換緩沖液或濃縮的目的。
[0036]超濾分離純化和處理的特征:1.透過(guò)β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的超濾膜選擇分子量為50kDa或60kDa或70kDa或80kDa或90kDa或IOOkDa規(guī)格的超濾膜，優(yōu)選90kDa_60kDa的超濾膜，大于或小于優(yōu)選規(guī)格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；2.截留β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的超濾膜選擇是分子量為IOkDa或20kDa或30kDa或50kDa的超濾膜，優(yōu)選10kDa-30kDa的超濾膜，大于或小于優(yōu)選規(guī)格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；3.超濾分離純化或處理的操作溫度、緩沖液及其酸堿度或濃度選擇，是按β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。
[0037]通過(guò)上述方法所獲得的β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白純度，有時(shí)無(wú)法滿足相應(yīng)需要。本方法是從昆蟲血淋巴中分離純化高純度β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白，并可以達(dá)到電泳純乃至HPLC純度。其特征在于，將上述六種分離純化方法(離子交換柱層析、親和柱層析、疏水柱層析、凝膠過(guò)濾柱層析、鹽析、超濾)，進(jìn)行兩種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或三種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或四種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或五種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或六種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，直至樣品純度得到預(yù)期要求。
[0038]二、β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白結(jié)構(gòu)解析以及其基因序列解析
[0039]按照常規(guī)蛋白質(zhì)化學(xué)與分子生物學(xué)的技術(shù)、方法、手段，對(duì)β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。其特征在于，(1)利用生物質(zhì)譜測(cè)定天然β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的分子量；(2)采用常規(guī)蛋白水解酶及其水解條件，針對(duì)
【發(fā)明內(nèi)容】
所獲得β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白進(jìn)行降解，通過(guò)HPLC分離降解片段，利用生物質(zhì)譜或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，從而獲得β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白分子內(nèi)的氨基酸序列片段；(3)利用分子生物學(xué)技術(shù)、方法，從昆蟲脂肪體提取總RNA，利用RACE技術(shù)構(gòu)建昆蟲cDNA pool。根據(jù)目的蛋白降解片段的氨基酸序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增片段基因。隨后結(jié)合RACE技術(shù)獲得β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白基因-eDNA，通過(guò)基因序列測(cè)定分析獲得其堿基序列并由其開放閱讀框堿基序列推導(dǎo)獲得β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)一級(jí)結(jié)構(gòu)；(4)利用分子生物學(xué)技術(shù)、方法等，從昆蟲脂肪體提取其染色體基因。設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增上下游引物，以昆蟲染色體基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白染色體基因，通過(guò)基因序列測(cè)定分析獲得β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白染色體基因中的內(nèi)含子、外顯子序列；(5)通過(guò)上述1-4所獲得β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的分子量、分子內(nèi)部分氨基酸序列、cDNA開放閱讀框序列、染色體基因中的外顯子序列，彼此相互驗(yàn)證上述結(jié)構(gòu)信息，獲得β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白序列。本文中所指β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白，為不含信號(hào)肽的成熟肽一天然β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白；本文中所指β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈，為包含信號(hào)肽在內(nèi)的完整的開放閱讀框架編碼的肽鏈。
[0040]三、重組β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物的制備
[0041]本發(fā)明的β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物可以利用基因工程表達(dá)制備獲得，通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，包括:(I)將編碼β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物DNA重組至表達(dá)載體；(2)用步驟(1)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(原核或真核細(xì)胞)；(3)在適合的誘導(dǎo)表達(dá)條件下，培養(yǎng)步驟(2)的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)收獲并純化所得到的目的蛋白。
[0042]本發(fā)明同時(shí)提供上述β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物的表達(dá)產(chǎn)物分離純化方法?？墒褂名}析沉淀、超濾、親和層析、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過(guò)濾等方法以及上述方法的多種組合，從基因工程細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物或培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達(dá)產(chǎn)物。在表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化過(guò)程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(Western)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的存在及相應(yīng)分子大小。
[0043]四、β-1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物的結(jié)合特異性及其應(yīng)用
`[0044]本發(fā)明再一個(gè)目的是針對(duì)天然β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白、重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物的體外結(jié)合特異性以及對(duì)激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)和Toll途徑的激活情況的對(duì)比，確定了天然β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白、重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物，與β_1，3-葡聚糖結(jié)合的生物活性。同時(shí)，也研究了天然β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白、重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物的應(yīng)用。
[0045]此外，本發(fā)明也研究了天然β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體、抗體的制備以及其應(yīng)用。
[0046]五、β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b的獲得方法以及其生物功能、抗體等及其應(yīng)用
[0047]本發(fā)明針對(duì)β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白_b，首次開展了 β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白_b)_的基因工程表達(dá)生產(chǎn)方法、生物學(xué)功能及其應(yīng)用、作為抗原產(chǎn)生抗體及其應(yīng)用等方面研究。
[0048]本發(fā)明所述的天然β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白、重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其部分片段或衍生物或類似物、重組β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b獲得方法常規(guī)、簡(jiǎn)單、產(chǎn)量聞。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0049]圖1為天然β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的分離結(jié)果
[0050]A:實(shí)施例1分離獲得天然β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的電泳圖譜；Β:實(shí)施例1純度分析圖譜；C:實(shí)施例2，3分離獲得天然β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白的電泳圖譜
[0051]圖2為β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白序列
[0052]A:氨基酸序列；Β:核苷酸序列
[0053]圖3為β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物、類似物、活性片段結(jié)構(gòu)
[0054](I)為Met-組氨酸標(biāo)簽_凝血酶酶切位點(diǎn)_ β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白序列。
[0055](2)為Met-13-l，3_葡聚糖識(shí)別蛋白序列
[0056](3)為Met-組氨酸標(biāo)簽_ β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白序列
[0057](4)為Met- β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白_組氨酸標(biāo)簽序列
[0058](5)為Met-GST標(biāo)簽_ β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白序列
[0059](6)為Met- β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白-GST標(biāo)簽序列
[0060](7)為β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列及其基因序列
[0061]A:氨基酸序列；Β:核苷酸序列
[0062](8)為Met-組氨酸標(biāo)簽_ β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈序列
[0063](9)為Met- β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈_組氨酸標(biāo)簽序列
[0064](10)為Met-GST標(biāo)簽一凝血酶酶切位點(diǎn)_ β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈序列
[0065](11)為Met-β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈-凝血酶酶切位點(diǎn)_GST。
[0066]標(biāo)簽序列
[0067]圖4為分離純化的重組表達(dá)產(chǎn)物(原核表達(dá)體系)電泳圖譜
[0068]1:采用pET_28a構(gòu)建獲得重組β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白；2:采用pTYBll構(gòu)建獲得重組β _1，3-匍聚糖識(shí)別蛋白；3:米用pGEX_2T構(gòu)建獲得重組β _1，3-匍聚糖識(shí)別蛋白；4:采用pET20b構(gòu)建獲得重組β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白；5:采用pTYBll構(gòu)建獲得重組β _1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b
[0069]圖5為分離純化的重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白(昆蟲表達(dá)體系)電泳圖譜1:pFastBacl-sf9昆蟲表達(dá)體系；2:pMIB/V5-His_Sf21昆蟲表達(dá)體系
[0070]圖6為分離純化的重組β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白(哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系)電泳圖譜
[0071]圖7為β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白、β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白-b與β-1，3_葡聚糖的結(jié)合實(shí)驗(yàn)
[0072]A: β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白的結(jié)合特異性。1:與curdlan的結(jié)合能力；2:與酵母菌的結(jié)合能力；3:與大腸桿菌的結(jié)合能力；4:與金黃色葡萄球菌的結(jié)合能力。
[0073]8:@-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白、3-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-13與β_1，3_葡聚糖結(jié)合強(qiáng)度的比較。a:13-l，3-葡聚糖識(shí)別蛋白山:@-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-13。1_3反映β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白與β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b的濃度:l:lyg;2:5yg;3:20yg。
[0074]圖8為由真菌類的酵母菌或β_1，3-葡聚糖引發(fā)柞蠶幼蟲黑化
[0075]A:柞蠶幼蟲；B:酵母菌致黑化；C: β-1，3-葡聚糖致黑化；D:酵母菌與β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白復(fù)合物致黑化；Ε:β-1，3-葡聚糖與β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白致黑化；F:酵母菌與β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b復(fù)合物致黑化；G:13-l，3-葡聚糖與β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b致黑化
[0076]圖9為由真菌類的酵母菌或β_1，3-葡聚糖引發(fā)柞蠶幼蟲抗菌肽的產(chǎn)生
[0077]A:柞蠶幼蟲；B:酵母菌誘導(dǎo)作用；C:@-1，3-葡聚糖誘導(dǎo)作用；D:酵母菌與β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白復(fù)合物誘導(dǎo)作用；Ε: β -1，3-葡聚糖與β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白誘導(dǎo)作用；F:酵母菌與β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b復(fù)合物誘導(dǎo)作用；G:13-l，3-葡聚糖與β-1，
3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b誘導(dǎo)作用
[0078]圖10為β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b在酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的作用
[0079]圖11為β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b抗體在酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的作用
【具體實(shí)施方式】:
[0080]下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。
[0081]實(shí)施例1
[0082]天然β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的分離純化
[0083]1.將預(yù)冷(0°C )的飽和硫酸銨攪拌并緩慢加入血淋巴中，至硫酸銨濃度為30%，12，OOOrpm, 4°C離心15min取上清液。上清液繼續(xù)滴加預(yù)冷的飽和硫酸銨(0°C )至硫酸銨濃度為50%，12，000rpm，4°C離心15min取沉淀。沉淀用50%硫酸銨洗滌、離心取沉淀，重復(fù)5次。
[0084]2.將上一步驟所得沉淀溶解于緩沖溶液(50m mol/L檸檬酸緩沖液，5m mol/LEDTA, pH5.0)中超濾除鹽。
[0085]3.將上一步驟所得樣品溶液上樣至SP Sepharose F.F，將層析柱用平衡后用Omol/L ~lmol/L NaCl (50m mol/L 梓檬酸緩沖液，5m mol/L EDTA,pH5.0)梯度洗脫。收集各組分采用Western blot檢測(cè)目的蛋白。
[0086]4.將上一步驟分析獲得的樣品組分用緩沖溶液20mmol/L Tris-HCl，pH9.0透析過(guò)夜，離心取上清液。上樣至 Q Sepharose F.F, 0mol/L ~0.5M NaCl (20mmol/L Tris-HCl,pH9.0)梯度洗脫。收集各組分采用Western blot檢測(cè)目的蛋白。
[0087]5.將步驟4分析獲得的樣品組分用緩沖溶液20mmol/L PBS, pH7.0透析過(guò)夜，離心取上清液。上樣至凝膠過(guò)濾層析填料，洗脫并收集各組分采用Western blot檢測(cè)目的蛋白。
[0088]試驗(yàn)結(jié)果如圖1-(A) (B)所示，分離純化所得到的天然β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的純度約99.9%以 上。
[0089]實(shí)施例2:
[0090]分離純化天然β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白
[0091]1.將收集于抗凝緩沖溶液(15mmol *L_1 NaCl ；136mmol.L4 朽1 檬酸鈉；26mmol *L_1梓檬酸；20mmol.I71 EDTA, pH 5.0)的血淋巴原料液,上樣至肝素-Sepharose,Omol/L~lmol/LNaCl抗凝緩沖溶液梯 度洗脫。收集各組分采用Western blot檢測(cè)目的蛋白。[0092]2.將上一步驟分析獲得的樣品組分用抗凝緩沖溶液超濾除鹽，離心取上清液上樣至SP Sepharose F.F。將層析柱平衡后用ρΗ5.0~ρΗ8.0, lmol/LNaCl抗凝緩沖溶液梯度洗脫。收集各組分采用Western blot檢測(cè)目的蛋白。
[0093]3.將上一步驟分析獲得的樣品組分上樣至辛基疏水柱，lmol/L~Omol/L NaCl抗凝緩沖溶液梯度洗脫。收集各組分采用Western blot檢測(cè)目的蛋白。
[0094]試驗(yàn)結(jié)果如圖1-(C)泳道I所示，獲得電泳純的天然β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白。
[0095]實(shí)施例3:
[0096]分離純化天然β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白
[0097]1.將預(yù)冷的飽和硫酸銨攪拌并緩慢加入原料液中，至硫酸銨濃度為30%，12，000rpm,4°C離心15min取上清液。上清液繼續(xù)滴加預(yù)冷的飽和硫酸銨(0°C )至硫酸銨濃度為80%, 12，OOOrpm,4°C離心15min取沉淀。沉淀用20mmol/L PBS,pH 7.0溶解備用。
[0098]2.將上一步驟分離獲得的樣品組分上樣至β -1，3-葡聚糖親和層析柱，Omol/L~3MNaCl,20mmol/L PBS, pH 7.0梯度洗脫。收集各組分采用Western blot檢測(cè)目的蛋白。
[0099]3.將上一步驟分離獲得的樣品組分用20mmol/L PBS,pH 7.0緩沖溶液超濾除鹽，離心取上清液上樣至Sephacryl S-100 HR并洗脫。收集各組分采用Western blot檢測(cè)目的蛋白。
[0100]試驗(yàn)結(jié)果如圖1-(C)泳道2所示，獲得電泳純的天然β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白。
[0101]實(shí)施例4:`
[0102]β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白結(jié)構(gòu)解析以及其基因序列解析
[0103]按照常規(guī)蛋白質(zhì)化學(xué)與分子生物學(xué)的技術(shù)、方法、手段，對(duì)β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。具體方法、手段按照
【發(fā)明內(nèi)容】
二中所列內(nèi)容實(shí)施。
[0104]獲得天然β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白(也稱成熟肽鏈，在本專利簡(jiǎn)稱β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白)的一級(jí)結(jié)構(gòu)一氨基酸序列以及編碼天然β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的基因及其序列(如圖2所示)。
[0105]利用生物信息學(xué)技術(shù)、方法等，針對(duì)本發(fā)明β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果表明:本發(fā)明的β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白與家蠶、煙草天蛾、黃粉蟲等昆蟲的β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白屬于同一家族。
[0106]實(shí)施例5:
[0107]利用原核生物表達(dá)系統(tǒng)獲得重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及重組β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b
[0108]本實(shí)施例列舉描述原核生物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段基因，以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b基因的構(gòu)建策略和基本方法。
[0109]原核生物表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。
[0110]本實(shí)施是為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。
[0111]對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，是采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等。
[0112]1.表達(dá)載體構(gòu)建[0113]根據(jù)β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白(結(jié)構(gòu)如圖3)的N末端和C末端氨基酸序列，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)寡核苷酸引物，同時(shí)在上述兩個(gè)寡核苷酸引物的5'端，分別加上限制性核酸內(nèi)切酶水解位點(diǎn)序列；以昆蟲脂肪體cDNApool為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物并進(jìn)行核酸片段的凝膠回收；經(jīng)過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后與同樣進(jìn)行雙酶切表達(dá)質(zhì)粒，在DNA連接酶的作用下進(jìn)行重組連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)過(guò)菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后提交生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。通過(guò)上述基因工程的方法，構(gòu)建β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白基因的表達(dá)載體。
[0114]同上所述，根據(jù)β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白-b序列，構(gòu)建β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白_b基因的表達(dá)載體。
[0115]本實(shí)施例表達(dá)載體構(gòu)建的特征:1.以大腸桿菌為宿主，表達(dá)載體可選擇pTYBll、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b 等；2.可以在目的基因的 N 端前融合一段肽段作為親和層析的標(biāo)簽(Tag) ；3.可以在目的基因的C段后融合一段肽段作為親和層析的標(biāo)簽(Tag) ；4.標(biāo)簽可以選擇His-Tag(連續(xù)六個(gè)及以上組氨酸)、GST_Tag等；5.可以在親和層析標(biāo)簽與目的基因之間，添加蛋白水解酶水解位點(diǎn)的氨基酸序列，如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等，以獲得與天然目的蛋白一致的重組蛋白。
[0116]2.重組目的蛋白的獲得
[0117]利用基因工程技術(shù)，將目的基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落后接種至含抗生素的LB，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，從而獲得含有目的蛋白的培養(yǎng)液或菌體。含有目的蛋白的菌體首先經(jīng)裂解液裂解、超聲破碎，釋放目的蛋白后利用離心方法收集上清液作為重組目的蛋白的原料液備用。
[0118]重組目的基因表達(dá)的特征:1.表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主的方式可以選擇熱轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化方法；2.誘導(dǎo)表達(dá)的方式包括化學(xué)誘導(dǎo)一異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)和加溫誘導(dǎo)；3.β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白基因可表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外；3.存在于細(xì)胞內(nèi)的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白需通過(guò)裂解液裂解、超速破碎等方式，將目的蛋白釋放至溶液中。
[0119]按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，從上述含目的蛋白的原料液中分離純化重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段，以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b至需要的純度，直至達(dá)到電泳純或HPLC純。
[0120]例如:(I)采用pET_28a構(gòu)建N端前融合組氨酸標(biāo)簽的β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白基因，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Met-(His標(biāo)簽)-β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。采用裂解緩沖液(50mmol/L PBS, 0.15M NaCl，50mmol/L咪唑)重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心獲得上清液作為進(jìn)一步分離純化β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白的原料液。按照實(shí)施例I的方法、原理、策略等，分離純化β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白至電泳純(圖4-泳道I)。
[0121](2)采用pTYBll構(gòu)建無(wú)標(biāo)簽β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白表達(dá)載體，采用電轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。采用裂解緩沖液重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心獲得上清液作為進(jìn)一步分離純化β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的原料液。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白至電泳純(圖4-泳道2)。
[0122](3)采用PGEX-2T構(gòu)建C端后融合GST標(biāo)簽的β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白表達(dá)載體，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)加溫誘導(dǎo)表達(dá)，β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-GST表達(dá)于胞內(nèi)。采用裂解緩沖液重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心獲得上清液作為進(jìn)一步分離純化β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的原料液。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白至電泳純(圖4-泳道3)。
[0123](4)采用pET20b構(gòu)建C端后融合組氨酸標(biāo)簽的β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白基因，采用電轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)加溫誘導(dǎo)表達(dá)，β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白一His表達(dá)于胞外。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白至電泳純(圖4-泳道4)。
[0124](5)采用與⑵相同方法獲得重組β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b，既采用pTYBll構(gòu)建無(wú)標(biāo)簽β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b表達(dá)載體，采用電轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。采用裂解緩沖液重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心獲得上清液作為進(jìn)一步分離純化β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b的原料液。按照實(shí)施例1的方法、原理、策略等，分離純化β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b至電泳純(圖
4-泳道5)。
[0125]上述(I)、(2)、(3)、(4)表達(dá)重組的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白結(jié)構(gòu)如圖3所示，分離純化獲得的重組表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證其純度如圖4所示。
[0126]上述含標(biāo)簽的純化后表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)上述常規(guī)、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表達(dá)產(chǎn)物中的融合肽段，再經(jīng)分離純化從而獲得β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白，該重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的結(jié)構(gòu)與天然的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的結(jié)構(gòu)相同。
`[0127]實(shí)施例6:
[0128]利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段
[0129]本實(shí)施例列舉描述昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。
[0130]昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。
[0131 ] 本實(shí)施例是使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。
[0132]對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等。
[0133]1.利用pFastBacl —sf9昆蟲表達(dá)體系獲得重組β _1，3_匍聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段
[0134]將β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白成熟肽及其衍生物、類似物、活性片段基因連接到pFastBacl質(zhì)粒中，構(gòu)建pFastBacl-β GRP重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座大腸桿菌DH10, Bluo-gal和IPTG誘導(dǎo)后,藍(lán)白篩選獲得轉(zhuǎn)座重組bacmid。轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9, Western blot驗(yàn)證重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0135]收集細(xì)胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl，pH8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于預(yù)先平衡好的不溶性β_1，3-葡聚糖(curdlan)層析柱，經(jīng)過(guò)兩個(gè)不同階段的pH緩沖液去除大量雜蛋白后，用含Omol/L-3mol/L NaCl的裂解緩沖液pH8.0)進(jìn)行梯度洗脫，重組蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)，達(dá)到電泳純度。表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如圖3所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖5-(1)。
[0136]2.利用pMIB/V5_His — Sf21昆蟲表達(dá)體系獲得重組β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段
[0137]將β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白成熟肽及其衍生物、類似物、活性片段基因連接到pMIBN5-His質(zhì)粒中，構(gòu)建pMIBN5-His-PGRP重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座大腸桿菌DH5，Bluo-gal和IPTG誘導(dǎo)后，藍(lán)白篩選獲得轉(zhuǎn)座重組bacmid。轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf21，Western blot驗(yàn)證重組β _1，3-匍聚糖識(shí)別蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0138]收集細(xì)胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過(guò)兩個(gè)不同階段的pH緩沖液及0.02mol/L咪唑(pH 8.0)分別充分洗滌5個(gè)柱床體積去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)進(jìn)行洗脫，重組蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)，達(dá)到電泳純度。表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如圖3所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖5-(2)。
[0139]實(shí)施例7:
[0140]利用酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段
[0141]本實(shí)施例列舉描述酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。
[0142]酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。
[0143]為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍，本實(shí)施例以PPIC`9K表達(dá)載體、畢赤酵母GS115為代表進(jìn)行描述。
[0144]對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，是采用實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法、原理、策略等。
[0145]利用常規(guī)、通用的基因工程技術(shù)，將β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白成熟肽基因連接到PPIC9K表達(dá)載體中，構(gòu)建pPIC9K-His6- β GRP (或pPIC9K_ β GRP)重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性重組菌中重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切形成線性分子，利用電轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中與基因組同源重組，經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩及Mut表型鑒定，篩選出陽(yáng)性重組子，進(jìn)行發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Western blot驗(yàn)證，N末端帶有His6_tag的重組β GRP (或重組β GRP)為分泌型表達(dá)。
[0146]將重組菌GS115/pPIC9K-His6-P GRP (或 GS115/pPIC9K-β GRP)接種于 50mIBMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C，250rpm/min，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。3000g、4°C離心5min，收集菌體。用IOml BMMY培養(yǎng)基重懸菌體并開始甲醇誘導(dǎo)表達(dá)6h，重組蛋白以分泌表達(dá)形式存在于培養(yǎng)基中，12，000g、4°C離心4min，得上清液，并以此為純化初始液。
[0147]如果表達(dá)產(chǎn)物是His6- β GRP形式，直接將純化初始液上樣于0.05mol/LTris-HCKpH 8.0)預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過(guò)兩個(gè)不同階段的pH緩沖液及
0.02mol/L咪唑(pH 8.0)分別充分洗滌5個(gè)柱床體積去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)進(jìn)行洗脫并收獲該洗脫液。該表達(dá)產(chǎn)物為His6-P GRP。
[0148]如果表達(dá)產(chǎn)物是PGRP形式，采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等分離純化獲得重組 3GRP。[0149]實(shí)施例8:
[0150]利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段
[0151]本實(shí)施例列舉描述哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段基因的構(gòu)建策略和基本方法。
[0152]哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略，均為基因工程表達(dá)的常規(guī)、通用的表達(dá)載體、表達(dá)宿主細(xì)胞以及表達(dá)策略。
[0153]為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍，本實(shí)施例以PCDNA3.0 (neo+)質(zhì)粒、CHO-Kl細(xì)胞為代表進(jìn)行描述。
[0154]對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，是采用實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法、原理、策略等。
[0155]利用常規(guī)、通用的基因工程技術(shù)，將PGRP成熟肽基因連接到P⑶NA3.0 (neo+)質(zhì)粒中，構(gòu)建 PCDNA3.0 (neo+) -His6- β GRP (或 pCDNA3.0 (neo+) - β GRP)重組表達(dá)質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞株CHO-Kl，對(duì)轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞株于5% CO2培養(yǎng)箱中，37°C貼壁培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液，經(jīng)Western blot驗(yàn)證，N末端帶有His6_tag的重組β GRP得以表達(dá)。
[0156]用15ul 重組質(zhì)粒 pCDNA3.0 (neo+) -His6- β GRP (或 pCDNA3.0 (neo+) - β GRP)轉(zhuǎn)染8ml IMDM medium(含有 CH0-K1 cell，2X105 cell/ml )，于 37°C，15% CO2 培養(yǎng)箱中，37°C貝占壁培養(yǎng)72h。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞2~3min，使細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞。用5ml裂解液(NP40)使細(xì)胞裂解，12，000g、4°C離心5min，得上清液作為純化初始液。
[0157]如果表達(dá)產(chǎn)物是HiS6- β GRP形式，直接將純化初始液上樣于0.05mol/LTris-HCKpH 8.0)預(yù)先平衡`好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過(guò)兩個(gè)不同階段的pH緩沖液及
0.02mol/L咪唑(pH 8.0)分別充分洗滌5個(gè)柱床體積去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)進(jìn)行洗脫并收獲該洗脫液。該表達(dá)產(chǎn)物為His6-P GRP。表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如圖3所示，純化后的電泳鑒定結(jié)果如圖6。
[0158]如果表達(dá)產(chǎn)物是PGRP形式，采用實(shí)施例1的方法、原理、策略等分離純化獲得重組 3GRP。
[0159]實(shí)施例9:
[0160]β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白及β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白b抗體的獲得
[0161]按照常規(guī)、通用抗體產(chǎn)生的技術(shù)，利用實(shí)施例1、2、3、5、6、7、8獲得的各種β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b作為抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體。
[0162]利用常規(guī)、通用的抗體檢測(cè)方法，檢測(cè)被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清中β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體、β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b抗體的產(chǎn)生情況。
[0163]當(dāng)被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛產(chǎn)生了 β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白或β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b抗體后，采用常規(guī)、通用的動(dòng)物血清采集與存儲(chǔ)方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清并存儲(chǔ)，該血清可以直接應(yīng)用。
[0164]利用常規(guī)、通用的抗體分離純化技術(shù)，如鹽析、各種類型層析介質(zhì)、抗體親和層析介質(zhì)等，從存儲(chǔ)的含有β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體或β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b的血清中分離純化不同純度的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體或@-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白13抗體，直至獲得電泳純或HPLC純的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體或@-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白4抗體，以適于不同要求的應(yīng)用。
[0165]實(shí)施例10:
[0166]β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段和重組β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b的生物活性
[0167]為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍，本實(shí)施例以β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的生物活性為代表進(jìn)行描述，β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物、類似物、活性片段、β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b也具有相同的生物活性。同時(shí)也以柞蠶作為鱗翅目昆蟲的生物活性實(shí)驗(yàn)昆蟲為代表進(jìn)行描述。本專業(yè)技術(shù)人員可以以β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段、β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b的生物活性為核心與基礎(chǔ)，進(jìn)一步拓展β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b的應(yīng)用范圍。
[0168]1.β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段和重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白_b的結(jié)合特異性
[0169]5yg天然β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白或重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段或重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b，分別與200yg不溶性β-1，3-葡聚糖(curdlan)或者甲醛固定后的真菌類的酵母菌、或者甲醛固定后的革蘭陰性菌類的大腸桿菌、或者甲醛固定后的革蘭陽(yáng)性菌類的金黃色葡萄球菌混合并輕微震蕩30分鐘。5，OOOrpm離心15min。去除上清液，將沉淀分別用緩沖溶液平衡后，加入I X電泳上樣液，60°C加熱5min后,通過(guò)SDS/PAGE結(jié)合western-blot觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖7-A所示(只展示β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白樣品)，β-1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白能夠與curdlan及酵母菌結(jié)合，而不能與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:天然、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白以及其衍生物、類似物、活性片段和重組β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b能夠特異性結(jié)合真菌及其分子模式-β -1，3-葡聚糖。
[0170]如圖7-Β，采用間接ELISA方法，分別利用相應(yīng)的抗體，在不同濃度條件下(1:1μ g ;2:5μ g ;3:20μ g)，比較本專利重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白(圖中所示a樣品)與重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b(圖中所示b樣品)對(duì)β-1，3-葡聚糖的結(jié)合能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白較之β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b，與β-1，3-葡聚糖的結(jié)合能力更強(qiáng)，其結(jié)合能力具有非常顯著性差異。
[0171]2.參與昆蟲的酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及激活Toll信號(hào)傳遞途徑
[0172](I)昆蟲酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號(hào)傳遞途徑激活的活性驗(yàn)證
[0173]將真菌類的酵母菌溶液(活菌或死菌)直接注入柞蠶幼蟲體內(nèi)后，均可以使柞蠶幼蟲黑化乃至死亡。這是酵母菌的分子模式激活了柞蠶體內(nèi)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的酚氧化酶，由激活的酚氧化酶引發(fā)昆蟲的黑化(如圖8-B、C所示)乃至死亡。同時(shí)，可以從黑化乃至死亡的昆蟲體內(nèi)，利用常規(guī)、通用方法檢測(cè)到，因酵母菌激活柞蠶幼蟲體內(nèi)酚氧化酶原激活系統(tǒng)進(jìn)而激活Toll信號(hào)傳遞途徑而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌肽(如圖9-B、C所示)。
[0174]將真菌類的酵母菌(活菌或死菌)溶液加入柞蠶血淋巴后，柞蠶血淋巴發(fā)生黑化作用。這是酵母菌的分子模式激活了柞蠶血淋巴中酚氧化酶原激活系統(tǒng)的酚氧化酶，由激活的酚氧化酶引發(fā)昆蟲血淋巴發(fā)生黑化作用。
[0175](2)天然、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白以及其衍生物、類似物、活性片段和β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b參與昆蟲酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及Toll信號(hào)傳遞途徑的激活
[0176]將天然、重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白以及其衍生物、類似物、活性片段或β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b分別注入柞蠶幼蟲體內(nèi)后，柞蠶均沒(méi)有發(fā)生黑化乃至死亡。同時(shí)，也檢測(cè)不到因激活柞蠶體內(nèi)酚氧化酶原激活系統(tǒng)進(jìn)而激活Toll信號(hào)傳遞途徑而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌肽。同樣，將天然、重組β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白以及其衍生物、類似物、活性片段或β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白b加入柞蠶血淋巴后，柞蠶血淋巴均沒(méi)有發(fā)生黑化作用。
[0177]將天然、重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白以及其衍生物、類似物、活性片段和β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b分別與真菌(死菌)或真菌的分子模式-β_1，3-葡聚糖混合，洗滌去除沒(méi)有結(jié)合組分，獲得復(fù)合物。將復(fù)合物分別注入柞蠶幼蟲體內(nèi)后，均可以使柞蠶體黑化。β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白作用結(jié)果如圖8-D、E，β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b作用結(jié)果如圖8-F、G。在劑量相同的情況下，β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白所形成復(fù)合物引發(fā)血淋巴黑化程度，較之不含有識(shí)別蛋白的情況(圖8-B、C)以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b所形成復(fù)合物的情況，具有非常顯著差異。同時(shí)，也能夠檢測(cè)到，兩種模式識(shí)別蛋白均可因激活柞蠶體內(nèi)酚氧化酶原激活系統(tǒng)進(jìn)而激活Toll信號(hào)傳遞途徑而誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽(如圖9-D、E、F、G所示)。其中，β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白作用結(jié)果如圖9-D、E，β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b作用結(jié)果如圖9-F、G，可以看出，兩者誘導(dǎo)所產(chǎn)生的抗菌肽的量亦有明顯不同。
[0178]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:一方面，本發(fā)明專利的天然、重組β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白以及其衍生物、類似物、活性片段，以及β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b是柞蠶體內(nèi)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的成分，作為β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白與β-1，3-葡聚糖結(jié)合后，激活了柞蠶體內(nèi)酚氧化酶原激活系統(tǒng)進(jìn)而也激活Toll信號(hào)傳遞途徑；另一方面，兩種模式識(shí)別蛋白與真菌及β-1,3-葡聚糖的結(jié)合有非常顯著性差異，從而導(dǎo)致對(duì)酚氧化酶原激活系統(tǒng)以及激活Toll信號(hào)傳遞途徑的激活作用亦有明顯不同。
[0179]實(shí)施例11:
[0180]天然、重組β_1，3-葡聚糖`識(shí)別蛋白以及其衍生物、類似物、活性片段，以及β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b的應(yīng)用
[0181 ] 為使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍，本實(shí)施例以β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的生物活性為代表進(jìn)行描述，β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物、類似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b也具有相同的生物活性。同時(shí)也以柞蠶作為鱗翅目昆蟲的生物活性實(shí)驗(yàn)昆蟲為代表進(jìn)行描述。本專業(yè)技術(shù)人員可以以β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b的生物活性為核心與基礎(chǔ)，進(jìn)一步拓展β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b的應(yīng)用范圍。
[0182]1.誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生抗菌肽
[0183]如實(shí)施例10中的2.所描述，利用真菌或結(jié)合了 β-1，3_葡聚糖的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段，以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b均可以誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生抗菌肽，而且利用了 β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b后，結(jié)合了 β-1，3-葡聚糖的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白b，誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生抗菌肽程度，比沒(méi)有利用β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b的β_1，3-葡聚糖所誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生抗菌肽程度，具有非常顯著的差異(非常顯著的上調(diào)作用)?；诖?，從產(chǎn)生抗菌肽的昆蟲體內(nèi)制備相應(yīng)的抗菌肽，該抗菌肽可以用于醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0184]2.用于真菌的檢測(cè)
[0185]如實(shí)施例10中所描述，β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段，以及β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b作為酚氧化酶原激活系統(tǒng)的成分-起始激活因子，與真菌或β_1，3-葡聚糖結(jié)合后，能夠激活柞蠶體內(nèi)酚氧化酶原激活系統(tǒng)(激活的酚氧化酶引發(fā)黑化)進(jìn)而也激活Toll信號(hào)傳遞途徑的生物活性，而且利用β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b后，激活柞蠶體內(nèi)酚氧化酶原激活系統(tǒng)的強(qiáng)度，比沒(méi)有利用β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b的β_1，3-葡聚糖激活酚氧化酶原強(qiáng)度具有非常顯著的的差異(非常顯著的上調(diào)作用)。
[0186]同樣，如圖10所示，利用柞蠶血淋巴替代柞蠶觀察血淋巴的黑化程度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，相同檢測(cè)條件下，添加β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b后，對(duì)于檢測(cè)真菌而言，比沒(méi)有利用識(shí)別蛋白提高了檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，本試驗(yàn)也表明，利用β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白和β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-(b)誘導(dǎo)柞蠶血淋巴的激活，其作用效果有顯著性差異。
[0187]實(shí)施例12:
[0188]天然、重組β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白以及其衍生物、類似物、活性片段，以及β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b抗體的應(yīng)用
[0189]針對(duì)實(shí)施例9獲得的β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段，以及β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b的抗體，利用免疫學(xué)以及分子生物學(xué)等常規(guī)、通用的技術(shù)、方法等，采用所制備的抗體，用`于鱗翅目昆蟲(鱗翅目昆蟲優(yōu)選天蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲的β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白免疫檢測(cè)。同樣，也適用于從鱗翅目昆蟲(鱗翅目昆蟲優(yōu)選天蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲)分離純化制備β _1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白過(guò)程中免疫檢測(cè)跟蹤分析以及樣品的定性、定量檢測(cè)分析。此方面的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在上述的天然、重組β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段分離純化制備過(guò)程中的實(shí)施例應(yīng)用。
[0190]將足夠劑量的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體或β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白b抗體分別首先注入柞蠶幼蟲體內(nèi)，再將酵母菌(死菌)或β_1，3-葡聚糖的溶液分別注入該柞蠶幼蟲體內(nèi)后，此時(shí)，酵母菌或β_1，3-葡聚糖并不能引發(fā)柞蠶的黑化乃至死亡；同樣，如圖11所示，用柞蠶血淋巴替代柞蠶，事先加入足夠劑量的β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體或β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b抗體也可以阻斷柞蠶血淋巴的黑化。同理，將充分結(jié)合β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體或β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b抗體的β-1，3-葡聚糖注入柞蠶幼蟲體內(nèi)，此時(shí)β_1，3-葡聚糖不引發(fā)柞蠶的黑化乃至死亡；同樣，用柞蠶血淋巴替代柞蠶，充分結(jié)合β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體或β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b抗體的β-1，3-葡聚糖也不引發(fā)柞蠶血淋巴的黑化。
[0191]在任何待檢測(cè)真菌的樣品，加入足夠劑量的β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白抗體或β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b抗體。按照實(shí)施例11中β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段用于真菌的檢測(cè)所述方法，進(jìn)行待檢測(cè)樣品的真菌檢測(cè)。同上結(jié)果，即便是樣品中有能夠被檢測(cè)出真菌的量也不能檢測(cè)出(陰性結(jié)果)，此實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)作為樣品真菌檢測(cè)的陰性對(duì)照組加以應(yīng)用。
[0192]上述結(jié)果表明:β-1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段的抗體，通過(guò)與β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段的結(jié)合而屏蔽了與β-1，3-葡聚糖的結(jié)合生物活性，從而使β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段失去了原有的生物活性?；谶@種結(jié)合屏蔽作用原理可以廣泛應(yīng)用。同樣，β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白b抗體也能夠屏蔽與β-1，3-葡聚糖的結(jié)合生物活性，從而使β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白失去了原有的生物活 性?；谶@種結(jié)合屏蔽作用原理可以廣泛應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.天然β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白，其特征在于，它包括(I)氨基酸序列如附圖2-(Α)所示，⑵編碼的基因序列如附圖2-(Β)所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白，其特征在于，所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白來(lái)源于鱗翅目(Lepidoptera)、天(大)蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲,選自昨蠶、蓖麻蠶、天蠶、印度柞蠶、琥珀蠶、美國(guó)柞蠶、樗蠶、大山蠶、美洲天蠶、樟蠶、楓蠶，所述的昆蟲為任何地域的天然或人工放養(yǎng)或人工飼養(yǎng)的昆蟲。
3.β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物或類似物或活性片段，其特征在于它包含權(quán)利要求I所述的氨基酸序列全序、片段，包括Me t - β -1，3 -葡聚糖識(shí)別蛋白、Me t -組氨酸標(biāo)簽-β _1，3_匍聚糖識(shí)別蛋白、Met- β -1，3_匍聚糖識(shí)別蛋白_組氛酸標(biāo)簽、Met-GST標(biāo)簽-β _1，3_匍聚糖識(shí)別蛋白、Met- β -1, 3_匍聚糖識(shí)別蛋白-GST標(biāo)簽；β _1，3-匍聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈、Met-組氨酸標(biāo)簽-β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈、Met- β -1，3_葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈-組氨酸標(biāo)簽、Met-GST標(biāo)簽-凝血酶酶切位點(diǎn)-β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈、Met-β-1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白全長(zhǎng)肽鏈-凝血酶酶切位點(diǎn)-GST標(biāo)簽等，如附圖3所示。
4.重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物、類似物、活性片段以及重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b，其特征在于，表達(dá)產(chǎn)物具有β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的生物學(xué)活性。
5.如權(quán)利要求1所述的β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，利用鱗翅目天蠶蛾科昆蟲的血淋巴，既昆蟲血液(或血細(xì)胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆蟲壓榨或勻漿的體液作為分離純化的原料液，原料液經(jīng)過(guò)單獨(dú)的離子交換層析或疏水層析或親和層析或凝膠過(guò)濾或鹽析或超濾分離純化β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白活性組分，或通過(guò)離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過(guò)濾、鹽析或超濾分離純化方法中的兩個(gè)或多個(gè)的組合以及其分離純化方法順序的重排組合獲得電泳純乃至HPLC純度的β -1,3-葡聚糖識(shí)別蛋白，其提取、分離、純化體系中:1.操作溫度在0°C -45°C，優(yōu)選(TC -1O0C ；2.溶液的酸堿度在pH2-pH12，優(yōu)選pH4 -pH10 ；3.調(diào)節(jié)溶液酸堿度的化學(xué)試劑是常規(guī)、通用的酸或堿及其溶液，酸及其溶液優(yōu)選HC1、HAc、磷酸、檸檬酸、硫酸、硼酸，堿及其溶液優(yōu)選NaOH、KOH、Tris、檸檬酸鈉或鉀鹽、磷酸鈉或鉀鹽、硼砂；4.緩沖液是常規(guī)、通用緩沖離子對(duì)緩沖液，優(yōu)選檸檬酸根緩沖離子對(duì)、HCl-Tris緩沖離子對(duì)、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對(duì)、磷酸根緩沖離子對(duì)、醋酸根緩沖離子對(duì)、硼酸根緩沖離子對(duì)、硼酸-Tris緩沖離子對(duì)、上述各緩沖離子的組合；5.溶液或緩沖液的離子強(qiáng)度在0.0Olmol/L-0.5mol/L，優(yōu)選0.01mol/L-0.lmol/L。
6.如權(quán)利要求1所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白或權(quán)利要求3所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物或類似物或活性片段或權(quán)利要求4所述β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b的基因表達(dá)生產(chǎn)方法，其特征在于，它包括(I)利用基因工程技術(shù)表達(dá)β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白、β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物或類似物或活性片段、@-1，3葡聚糖識(shí)別蛋白-13，(2)從上述表達(dá)體系中分離純化重組的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白、重組的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物或類似物或活性片段、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b，(3)上述表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)單獨(dú)的離子交換層析或疏水層析或親和層析或凝膠過(guò)濾或鹽析或超濾分離純化重組β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物或類似物或活性片段、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b活性組分，(4)上述表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)離子交換層析或疏水層析或親和層析或凝膠過(guò)濾或鹽析或超濾分離純化方法中兩個(gè)或幾個(gè)分離純化方法的組合以及其分離純化方法順序的重排組合獲得電泳純乃至HPLC純度的重組β -1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物或類似物或活性片段、重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白或β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物或類似物或活性片段或β_1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b的基因表達(dá)生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的基因表達(dá)體系包括(I)原核生物系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或枯草桿菌細(xì)胞，(2)酵母細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞，(3)昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞，(4)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)載體，表達(dá)宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，(5)上述表達(dá)形式為細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或分泌形式表達(dá)。
8.權(quán)利要求1所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白或權(quán)利要求3所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物或類似物或活性片段或權(quán)利要求4所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b的抗體，其特征在于，它包括(I)以天然β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白或重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白以及其衍生物或類似物或活性片段或重組β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b作為抗原，(2)產(chǎn)生β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白及其衍生物或類似物或活性片段以及β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白_b抗體的生物體為小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛，(3)采用常規(guī)方法從產(chǎn)生抗體的生物體血清制備抗體。
9.權(quán)利要求1所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白或權(quán)利要求3所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白衍生物或類似物或活性片段以及權(quán)利要求4所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b的應(yīng)用，其特征在于，它包括(I)激活酚氧化酶原激活系統(tǒng)，(2)誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生抗菌肽，(3)在微生物及其相關(guān)分子模式檢測(cè)中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白或權(quán)利要求3所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白的衍生物或類似物或活性片段或權(quán)利要求4所述的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白-b的抗體的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103788190SQ201210437330
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月26日
【發(fā)明者】張嶸, 張景海, 吳春福 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)