專利名稱：一種多功能纖維素酶及其表達基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于哈氏嗜纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)的多功能纖維素酶及其表達基因與應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
纖維素是由吡喃型D-葡萄糖殘基以P -I, 4糖苷鍵形成纖維素鏈，纖維素鏈又通過氫鍵締合形成不溶于 水的纖維素束。纖維素作為植物細胞壁的主要組成成分，是植物的主要支持物，可以說是地球上最豐富的可再生資源。將這些生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化成為人類可以利用的能源、食物等，對于人類社會的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。已發(fā)現(xiàn)的纖維素酶大多產(chǎn)于微生物，一般認為微生物可以產(chǎn)生纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶以及3 -葡萄糖苷酶，纖維素外切酶可以攻擊纖維素鏈的一端并持續(xù)性地產(chǎn)生纖維二糖，被認為是結(jié)晶纖維素降解的關(guān)鍵酶。纖維素內(nèi)切酶可以攻擊非結(jié)晶區(qū)的纖維素鏈，使其斷裂，產(chǎn)生較短的糖鏈，也為纖維素外切酶提供更多的攻擊位點?！?葡萄糖苷酶則能進一步降解纖維二糖和纖維寡糖生成葡萄糖，為微生物代謝所利用。由于真菌的纖維素酶主要分泌于胞外，易于分離純化，現(xiàn)在工業(yè)上用的纖維素酶大多來源于真菌的發(fā)酵產(chǎn)物。但是真菌作為一種真核生物，其基因含有內(nèi)含子并且產(chǎn)生的蛋白有比較復雜的糖基化修飾，不容易在已經(jīng)比較成熟的大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行異源表達從而獲得更高產(chǎn)量，因此開發(fā)細菌中的高效纖維素酶顯得尤為重要。哈氏嗜纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)是一種土壤中廣泛存在的、好氧的纖維素降解細菌，它能在貧瘠的條件下迅速徹底地降解結(jié)晶度很高的天然棉纖維或濾紙(Decomposition of Cellulose by Cytophaga. Ernest Walker and Frederick Lloyd Warren, BiochemJ. 1938January; 32 (I) :31 -43)。對其基因組的生物信息學預測顯示哈氏菌中主要含有多種纖維素內(nèi)切酶及￠-葡萄糖苷酶，未發(fā)現(xiàn)有對于降解結(jié)晶纖維素起關(guān)鍵作用的纖維素外切酶(Genome Sequence of the Cellulolytic Gliding Bacterium Cytophagahutchinsonii. Gary Xieetc, 2007, AppI. Environ. Micobiol. 73:3536-3546)，而且其絕大多數(shù)纖維素酶均不含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種多功能纖維素酶及其表達基因與應(yīng)用。一種多功能纖維素酶CHU-2103，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。多功能纖維素酶CHU-2103為一個單結(jié)構(gòu)域的多功能酶，其分子量只有不足40kD，具有纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶及糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。該酶降解纖維素能夠產(chǎn)生纖維三糖、纖維二糖及少量葡萄糖，呈現(xiàn)出類似纖維素外切酶持續(xù)性降解的特性。降解羧甲基纖維素鈉則能夠使其粘度迅速下降，顯示出纖維素內(nèi)切酶的活性。該酶既可以降解三糖及以上纖維寡糖為小分子寡糖，也能在一定條件下通過轉(zhuǎn)糖基作用與纖維寡糖反應(yīng)生成更高分子量的寡糖，該酶能夠與3-葡萄糖苷酶共同作用直接將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖。
上述多功能纖維素酶的表達基因chu_2103，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。表達基因chu_2103容易進行異源表達，獲得活性蛋白。表達基因chu_2103為哈氏嗜纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)的纖維素酶前體蛋白基因去除信號肽序列后制得。表達基因chu_2103裝載在pMAL-c2x載體上得到重組質(zhì)粒pChu2103，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌E. coliJM109宿主中得到工程菌JM Chu2103。該重組工程菌株經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，麥芽糖親和層析柱(NEB)純化能夠得到了大量活性纖維素酶CHU-2103。一種重組質(zhì)粒，插入了如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的基因片段。一種重組工程菌株，插入了如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的基因片段或上述重組質(zhì)粒。上述多功能纖維素酶CHU-2103、表達基因chu_2103、重組質(zhì)?；蛑亟M工程菌株在降解纖維素中的應(yīng)用?！び幸嫘Ч景l(fā)明所述多功能纖維素酶CHU-2103為一個單結(jié)構(gòu)域的多功能酶，其分子量不足40kD，容易進行異源表達，獲得具有纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶及糖基轉(zhuǎn)移酶活性的活性蛋白，有效地解決了由于哈氏菌的生長周期比較長，酶成分比較復雜，不容易對纖維素酶直接進行分離純化的問題。該酶在生物能源、飼料等行業(yè)具廣泛的應(yīng)用潛力。


圖I :pMAL_c2x質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 :多功能纖維素酶CHU-2103 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳帶；其中1泳道為純化后的CHU_2103，2泳道為Marker，3泳道為誘導后工程菌超聲破碎離心后的上清，4泳道為未誘導工程菌超聲破碎離心后的上清。圖3 :反應(yīng)溫度及pH對多功能纖維素酶CHU-2103的纖維素內(nèi)切酶(以羧甲基纖維素鈉為底物)活力影響曲線；圖4 :多功能纖維素酶CHU-2103降解纖維素產(chǎn)物的HPLC檢測；其中1為加入滅活CHU-2103降解磷酸膨脹纖維素的產(chǎn)物，2、3、4分別為磷酸膨脹纖維素被多功能纖維素酶CHU-2103降解不同時間的產(chǎn)物。圖5 :金屬離子對多功能纖維素酶CHU-2103酶活力的影響；其中橫坐標為離子濃度，縱坐標為相對酶活。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。哈氏嗜纖維菌購自美國菌種保藏中心，菌種編號為ATCC NO. 33406。實施例I :多功能纖維素酶的克隆表達I、哈氏嗜纖維菌的培養(yǎng)哈氏嗜纖維菌的培養(yǎng)條件為PY6培養(yǎng)基，300C，160rpm振蕩培養(yǎng)，PY6培養(yǎng)基每升組分如下葡萄糖4g,胰蛋白胨6g,酵母浸提液0. 5g,余量水，pH 7.0。2、基因組的提取
將培養(yǎng)好的哈氏嗜纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)的細菌培養(yǎng)物離心收集菌體，用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司生產(chǎn)的細菌DNA提取試劑盒)，按照產(chǎn)品說明書提取基因組DNA，備用。3、目的基因克隆(I)引物設(shè)計哈氏嗜纖維菌(Cytophaga hutchinsonii )的全基因組測序工程已經(jīng)完成，我們選擇了一個預測為纖維素內(nèi)切酶的基因chu-2103作為研究對象。SEQ ID NO. I基因序列預計編碼346個氨基酸，其編碼的纖維素酶前體蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，通過Signal 4. 0軟件網(wǎng)上分析服務(wù)，預測蛋白N-端的23個 氨基酸是信號肽序列，去除這個信號肽序列后得到纖維素酶的成熟蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示，對應(yīng)編碼這個纖維素酶成熟蛋白的基因序列如序列表SEQ IDNO. 3所示。根據(jù)該基因的序列特點，以及序列對應(yīng)的表達蛋白的信號妝序列和成熟蛋白序列特點，我們設(shè)計了兩端帶有限制性酶切位點的引物上游引物ATG ACT GGA TCC CAAAAG ACA ATC GTT GA，劃線部分為 BamH I 酶切位占.下游引物CTGCGG AAG CTT CTA TTT TGT TTT TGA TTT CT，劃線部分為HindIII酶切位點；委托華大基因公司合成這一對引物用于克隆該纖維素酶成熟蛋白基因(該基因編碼的纖維素酶成熟蛋白的氨基酸序列參見SEQ ID NO. 4)，克隆基因采取PCR擴增的方法。(2)目的基因(SEQ ID NO. 3)的PCR擴增和純化在50 U I TransStart FastPfu DNA Polymerase 反應(yīng)體系中(購自 Transegene 公司，配制方法參見試劑說明書)，以步驟2中提取獲得的基因組DNA為模板，上述引物作為擴增引物，通過PCR的方法進行擴增，PCR反應(yīng)條件預變性95°C 2分鐘；熱循環(huán)條件是95°C 20秒，55°C 20秒，72°C 30秒，反應(yīng)進行31個循環(huán)；最后在72 C保溫延伸10分鐘。通過PCR擴增的該基因的全長為969bp，用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測證實得到目的基因的DNA擴增產(chǎn)物后，使用DNA凝膠回收試劑盒(購于Omega公司)切膠回收，純化擴增產(chǎn)物。4、重組質(zhì)粒的構(gòu)建將上述純化的DNA片段和載體pMAL_c2x用BamH I和Hind III (購于Takara公司)進行雙酶切，實驗操作參見Takara產(chǎn)品說明書。酶切完畢后用Cycle-pure kit (購于Omega公司)對酶切產(chǎn)物進行純化。將上述純化的DNA片段和載體片段混合,在16°C用Solution I (購自Takara公司)進行過夜連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coliDH5 a (購自Takara公司)中，在含有100mg/ml氨芐青霉素的固體LB平皿上涂布，37°C靜置培養(yǎng)，直至出現(xiàn)單菌落，選擇性挑取單菌落在含有100mg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中37°C震蕩培養(yǎng)。菌液PCR驗證工程菌的重組質(zhì)粒中含有目的片段。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒PCHU2103委托華大基因進行序列測定。測出序列與哈氏菌原基因(SEQ ID NO. 3)進行比對，無堿基錯誤或移碼突變。說明此工程菌可以表達SEQ ID NO. 4所述氨基酸序列的成熟蛋白CHU-2103。5、重組質(zhì)粒在宿主菌中的表達將含有目的片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌E. coliJM109 (購自Takara公司)中，選取陽性克隆于含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日以2wt%接種量接入新鮮培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4至0. 6之間，加入異丙基硫代P -D-半乳糖苷(IPTG)，終濃度為0. 3mM, 18°C,80rpm低速振蕩培養(yǎng)15小時左右，離心收集菌體，制得IPTG誘導的工程菌，然后超聲破碎，12000g，離心15min，所得上清進行12%SDS_PAGE，顯示有目的蛋白的表達，如圖2所示。以此粗酶液，用羧甲基纖維素鈉作為底物，以DNS法檢測還原糖含量，經(jīng)粗酶液處理后有還原糖產(chǎn)生，即通過異源表達得到了活性蛋白。6、其他該多功能纖維素酶的表達方法
除了用上述的方法表達該纖維素酶以外，可以采取其他的生物手段進行表達?？梢酝ㄟ^將編碼該多功能纖維素酶的基因整合至宿主的染色體上，或者是選用其他載體或是宿主細胞，比如其他細菌或是真菌。其他的宿主細胞及載體載有本發(fā)明涉及的多功能纖維素酶基因后，同樣可以表達、產(chǎn)生本發(fā)明所涉及的多功能纖維素蛋白，這樣的生物體就變成能表達、生產(chǎn)該多功能纖維素酶的基因工程菌或是基因工程細胞。實施例2 :多功能纖維素酶的純化將上述IPTG誘導的工程菌離心收集菌體，用超聲緩沖液重懸，后超聲破碎，所得破碎液，12000g離心15min，得上清，過麥芽糖層析柱，具體操作參見NEB操作手冊，即可得到純化的多功能纖維素酶CHU-2103。實施例3 :重組多功能纖維素酶的性質(zhì)(I)水解羧甲基纖維素、濾紙、磷酸膨脹纖維素的纖維素酶活以羧甲基纖維素鈉鹽、濾紙或是磷酸膨脹纖維素作為底物，應(yīng)用本發(fā)明的多功能纖維素酶進行反應(yīng)，然后通過檢測反應(yīng)體系中生成的還原糖的量來分析纖維素酶的活力，通過HPLC或TLC檢測生成還原糖的種類。還原糖的生成量采用DNS法進行測量。蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍檢測法。實驗測定本發(fā)明所涉及的纖維素酶，對羧甲基纖維素鈉有較高的水解活力，而對濾紙和磷酸膨脹纖維素的水解活力相對較低。對羧甲基纖維素鈉酶解后的產(chǎn)物為一系列大小不一的寡糖，而對濾紙、磷酸膨脹纖維素酶解后的產(chǎn)物主要二糖和三糖，并有少量單糖，說明其兼具纖維素內(nèi)切酶及纖維素外切酶的活力，結(jié)果如圖4所示。(2)多功能纖維素酶的最適溫度及最適pH以羧甲基纖維素鈉為底物，在檸檬酸緩沖體系中，檢測溫度及pH對其活力的影響。實驗測定本發(fā)明涉及的多功能纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為30°C -36°C，高于45°C時酶活力顯著下降，而且最適pH則相對較為寬泛，在5. 5-7. 5之間都具有相對較高的活力，結(jié)果如圖3所示。(3)金屬離子對酶活力的影響測試四種無機離子(Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+)在不同濃度時對本發(fā)明所涉及的多功能纖維素酶的纖維素內(nèi)切酶(以羧甲基纖維素鈉為底物)活力的影響，測試溫度是30°C，使用的緩沖液是PH6. 8的磷酸緩沖液。結(jié)果顯示在一定的濃度范圍內(nèi)Ca2+和Zn2+對酶活力有一定的促進作用，而且隨濃度增大促進作用增強，而Mn2+和Mg2+對酶活力有一定的抑制作用，隨離子濃度增大，抑制作用增強。結(jié)果如圖5 所示。
權(quán)利要求
1.ー種多功能纖維素酶CHU-2103，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.權(quán)利要求I所述多功能纖維素酶CHU-2103的表達基因chu_2103，核苷酸序列如SEQID NO. 3 所示。
3.—種重組質(zhì)粒，插入了如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的基因片段。
4.一種重組工程菌株，插入了如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的基因片段或權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求I所述多功能纖維素酶CHU-2103、權(quán)利要求5所述表達基因chu_2103、權(quán)利要求6所述重組質(zhì)?；驒?quán)利要求4所述重組工程菌株在降解纖維素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多功能纖維素酶及其表達基因與應(yīng)用。多功能纖維素酶CHU-2103的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；多功能纖維素酶CHU-2103的表達基因chu_2103的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；本發(fā)明所述多功能纖維素酶CHU-2103為一個單結(jié)構(gòu)域的多功能酶，其分子量不足40kD，容易進行異源表達，獲得具有纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶及糖基轉(zhuǎn)移酶活性的活性蛋白，有效地解決了由于哈氏菌的生長周期比較長，酶成分比較復雜，不容易對纖維素酶直接進行分離純化的問題。該酶在生物能源、飼料等行業(yè)具廣泛的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N1/15GK102952790SQ20121043921
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者盧雪梅, 張聰, 季曉飛, 張為燦 申請人:山東大學