專利名稱：一種新型防御素bd2及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新型防御素BD2及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是天然免疫系統(tǒng)的重要成員，在防御外界病原菌侵染時(shí)具有重要作用，具有反應(yīng)時(shí)間快、耐藥性、廣譜抗菌活性等優(yōu)點(diǎn)。P -防御素(defensin)屬于一類含有30_45個(gè)氨基酸殘基的抗菌肽，P _防御素主要分布于呼吸道、胃腸道、生殖道表面和腺體中的一種富含半胱氨酸的陽(yáng)離子小分子抗菌肽，形成抵抗病原體的第一道重要防線。最早的￠-防御素是在牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的牛氣管抗菌肽(TAP) (Diamond G et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88 (9):3952-3956，1991)。防御素是一類分子量為3_4KDa的非糖基兩親(親水、親脂)低分子短肽，一般富含精氨酸，帶正電荷。分子中有6個(gè)半胱氨酸殘基，形成3對(duì)二硫鍵，含有3個(gè)相應(yīng)對(duì)稱的3折疊片結(jié)構(gòu)，缺少 a 螺旋結(jié)構(gòu)域(Schneider JJ, et al.Journal of MolecularMedicine83:587-95, 2005;Dhople V, et al.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes1758:1499-512,2006)。借助于細(xì)胞這個(gè)媒介，無(wú)論在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，防御素都可以直接殺死細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物。在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，它們通過(guò)吞噬微生物而促成厭氧菌的死亡。當(dāng)被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，它們通過(guò)攻擊微生物外膜發(fā)揮抗菌活性。除此之外，防御素還作為機(jī)體內(nèi)外免疫系統(tǒng)的“仲裁者”進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)以及創(chuàng)傷和神經(jīng)損傷的修復(fù)。防御素在宿主的嗜中性粒細(xì)胞、粘膜表面、皮膚和其他上皮細(xì)胞免疫中起重要作用，其定位和調(diào)控是通過(guò)抵抗病原的侵襲和內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)兩種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)(De Yang, et al.Trends inImmunology 23 :291-296, 2002;Zasloff.Nature 415:389-395, 2002;Lai Y, et al.Trendsin Immunology 30:131-41,2009)?，F(xiàn)在越來(lái)越多的病原菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，抗菌肽作為抗生素的替代品成為不可阻擋的趨勢(shì)。P -防御素作為抗菌肽的重要成員，具有廣譜抗細(xì)菌和抗病毒活性，對(duì)于防御外界病原微生物的侵害具有重要作用。目前對(duì)人類￠-防御素的研究較多，￠-防御素在魚類中的研究，尤其是功能方面的報(bào)道還比較少。且都集中于海水魚類的研究(郭洪燕等，生命科學(xué)，24(4):321-327, 2012)。近些年來(lái)，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的惡化、養(yǎng)殖密度的增大，魚類病害不斷發(fā)生，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，￠-防御素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用也是后續(xù)要解決的問(wèn)題。泥鰍作為一種鯉形目的淡水魚是一種新型且具有代表性的研究對(duì)象，為開(kāi)發(fā)具有廣譜抗菌活性的防御素且投入于水產(chǎn)飼料、漁藥等行業(yè)的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。P -防御素雖然具有廣譜抗菌活性，但是其表達(dá)量還是較低的，要想得到大范圍的應(yīng)用，通過(guò)基因工程的方法得到具有生物學(xué)活性的P-防御素也是目前需要解決的一大問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種防御素BD2。
本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述防御素的基因bd2。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述防御素基因的重組載體。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述防御素基因的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的再一目的是提供一種制備防御素的方法。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的新防御素。本發(fā)明的發(fā)明人從泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)中得到一個(gè)新的具有抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌活性的防御素。適合于水產(chǎn)飼料、漁藥等行業(yè)中使用。從泥鰍中獲得了一種防御素BD2，該蛋白含有62個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，前端19個(gè)氨基酸為的信號(hào)肽序列。其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示:I MRVLRLLVIT LLLLTAGEAY DTEIQGffTCG SRGLCRKHCY AQEHTVGYHG51CPRRYRCCAL RF*本發(fā)明還提供了編碼上述防御素的基因組DNA序列和cDNA序列?；蚪MDNA序列如SEQ ID N0.2所示，全長(zhǎng)1002bp，包括三個(gè)外顯子及兩個(gè)內(nèi)含子。其中52_164bp為第一個(gè)內(nèi)含子，282-981bp為第二個(gè)內(nèi)含子。cDNA序列全長(zhǎng)189bp，如SEQ ID N0.3所示。SEQ ID N0.2:I ATGAGAGTAC TAAGACTGCT TGTTATCACT TTACTGCTGC TGACAGCTGG AAAAGGTACA61 AGATACACGG TCATTTGAAT GCCTACAGAT TATAGCTATA GTTTACTATG TGTGCTACCA121CACCAGATAT GGTTATGTTT TAATATAGTT GTGATCTATT CCTTACAGCT TATGACACAG181GAATACAGGG ATGGACTTGT GGATCTCGAG GTCTGTGCAG GAAGCACTGC TATGCACAAG241AGCATACGGT CGGTTATCAT GGCTGCCCTC GAAGATACAG GTGCTCTTCA GATCTTATGA301ATTACATTTA TGTTTTTGAA TTATTGTGTT GTTGAATAAT CCTGTAAATG ATATGAACAC361ATATAGATTG GAAGATATAT ATAACAATGA GCTATAAAAG AGCTGTTACT GGGGTGGTAC421CCTTACAAA AAGTACCTAAA GGGTACATAT TAGTACCTCA AAGGTACATA TTGGTATTTC481AAAGGTACAT CTGTATCTAT GGTTTAAATA TATTAGGACT TTTTGAAAGG GTATCATCAC541AGTGACATTT ATTGCCCCAA AGGATCTAAA AACTTTTTAC TGTAGATTTA AATGAACATT601AAACATTAAC AAGTCTTTAT CTTTACAAAA TAAAACTATG AAATAACAGC CTTATGCAAA661GCATTCTGGG AACCAAAAAT CCTCATCAAC CTTTTTCTGT TATTTCCTTC AGATTTTGTT721TCAATGCTTT GCATGAGGCT GTTATTTAAA AAAATTTCTG TAAAGATAAA GACTTATTCA781TGTTTAATGT TCGTGTTAAC TTTGATCAAA CATCTGCCAG TAATATTGTT TTTCTACAGT841GATGTTGACA GAGCTTAATT TTAACTCAAA AATATTCCCG TAAAGCCGAT TTTTTATAAA901TGTTAAAGTA AGTTTGTGAT TCATTGAGTG AGTTATATTA GCATTGACTC AGCAACCTTA961CAATCTTCTT TTTTTATGAA GTGCTGTGCT TTGCGATTTT AASEQ ID N0.3I ATGAGAGTAC TAAGACTGCT TGTTATCACT TTACTGCTGC TGACAGCTGG AGAAGCTTAT61 GACACAGAAA TACAGGGATG GACTTGTGGA TCTCGAGGTC TGTGCAGGAA GCACTGCTAT121GCACAGGAGC ATACGGTCGG TTATCATGGA TGCCCTCGAA GATACAGGTG CTGTGCTTTG181CGATTTTAA防御素BD2去除前端19個(gè)氨基酸后的序列如SEQ ID N0.4所示:Y DTEIQGffTCG SRGLCRKHCY AQEHTVGYHG CPRRYRCCAL RF 43
其核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示:tatgacacag aaatacaggg atggacttgt ggatctcgag gtctgtgcag gaagcactgc 60tatgcacagg agcatacggt cggttatcat ggatgccctc gaagatacag gtgctgtgct 120ttgcgatttt aa132將編碼成熟防御素蛋白基因bd2的DNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定BD2是一種新的防御素，為其編碼基因的改造并在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供優(yōu)良的基因材料。本發(fā)明還提供了包含上述防御素基因bd2的重組載體，優(yōu)選為pcDNA3.l(+)-bd2-s。將本發(fā)明的基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將防御素基因插入到質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)上的EcoRI和BamHI限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)-bd2。本發(fā)明還提供了包含上述防御素基因bd2的表達(dá)細(xì)胞系，優(yōu)選為HEK293T細(xì)胞系。本發(fā)明還提供了上述防御素BD2用于制備革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種制備上述防御素BD2的方法，包括以下步驟:I)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組質(zhì)粒；2)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，通過(guò)HEK293T細(xì)胞表達(dá)得到防御素BD2。本發(fā)明的防御素對(duì) 嗜水氣單胞菌和枯草芽孢桿菌均具有抗菌作用。作為一種新型的防御素，在水產(chǎn)飼料添加劑和漁藥等行業(yè)都有應(yīng)用價(jià)值。


圖1防御素基因bd2的基因結(jié)構(gòu)圖。圖2防御素基因bd2在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)的RT-PCR分析。圖3本發(fā)明防御素BD2對(duì)嗜水氣單胞菌的活性檢測(cè)。圖4本發(fā)明防御素BD2對(duì)枯草芽孢桿菌的活性檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、魚、載體及細(xì)胞:泥鰍購(gòu)自于北京水產(chǎn)市場(chǎng)，載體pcDNA3.1(+)購(gòu)自于Invitrogen 公司，細(xì)胞系 HEK293T 購(gòu)自于 American type culture collection (ATCC)。2、酶類及其它生化試劑:DNA限制性內(nèi)切酶、連接酶購(gòu)自TakaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR mix購(gòu)自T0Y0B0公司，大提質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，脂質(zhì)體Lipofetmiane2000購(gòu)自Invitrogen公司，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購(gòu)自Invitrogen和Nuck公司。其它都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到)。3、培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)。說(shuō)明:以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)施例1泥嫩防御素編碼基因bd2的克隆
利用TRIZON法提取泥鰍鰓部組織RNA并反轉(zhuǎn)為第一鏈cDNA。根據(jù)發(fā)表的魚類防御素的序列比對(duì)結(jié)果找到兩個(gè)保守氨基酸序列WTCGYRGLC和GCPRRYRCC，并設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并引物bd2-F和bd2-R (引物序列見(jiàn)表1)，以泥鰍的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95°C 5min ；94°C 30sec, 55-50°C 30sec (其中每個(gè)循環(huán)后復(fù)性溫度下降0.5°C )，72°C 30s，10個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入第二個(gè)循環(huán)程序:94°C 30sec,50°C 30sec,72°C 30s, 28個(gè)循環(huán)后；72°C lOmin，瓊脂糖電泳檢測(cè)，得到約IOObp的片段，回收后pGEM_T Easy載體相連并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)檢測(cè)為陽(yáng)性后送測(cè)序。根據(jù)測(cè)定序列結(jié)果，在NCBI 的 GenBank 中利用 BLASTX (http: //www.ncb1.nlm.nih.rov/BLAST)進(jìn)行序列比對(duì)，初步判斷該基因片段是防御素片段，并進(jìn)行該片段的相似性研究。

根據(jù)測(cè)序得到的核甘酸序列，上游和下游分別設(shè)計(jì)三條TAIL-PCR特異性引物和兩條RACE-PCR特異性引物并將它們分別命名為Dl，D2, D3 (上游特異性引物)和Ul，U2 (下游特異性引物)見(jiàn)表I。通過(guò)TAIL-PCR和RACE-PCR分別得到已知基因片段序列的5’端側(cè)翼序列和3’端UTR序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后測(cè)序。將簡(jiǎn)并引物得到的核心片段與經(jīng)TAIL-PCR得到的側(cè)翼序列和經(jīng)RACE-PCR得到的3’端UTR序列進(jìn)行拼接得到bd2全長(zhǎng)基因。結(jié)果表明，該基編碼區(qū)全長(zhǎng)189bp (SEQIDN0.1)，編碼62個(gè)氨基酸(SEQ ID N0.3)和一個(gè)終止密碼子。預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列為前端19個(gè)氨基酸殘基。該編碼基因?yàn)橐粋€(gè)新基因。表1.防御素基因bd2克隆引物
權(quán)利要求
1.一種防御素BD2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.4所示。
2.一種防御素基因bd2，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的防御素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述防御素基因bd2，其特征在于，其堿基序列如SEQID N0.2或SEQ ID N0.3 所示。
4.包含權(quán)利要求2或3所述防御素基因bd2的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pcDNA3.1 (+)-bd2。
6.包含權(quán)利要求2或3所述防御素基因bd2的重組質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的表達(dá)宿主為HEK293T細(xì)胞系。
8.一種制備防御素基因bd2的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組質(zhì)粒； 2)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，通過(guò)HEK293T細(xì)胞表達(dá)得到防御素BD2。
9.權(quán)利要求1所述防御素BD2用于制備革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽(yáng)性菌抑制劑的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，革蘭氏陰性菌為嗜水氣單胞菌，所述革蘭氏陽(yáng)性菌為枯草芽孢桿 菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新型防御素BD2及其基因和應(yīng)用。所述防御素BD2的基因序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示。本發(fā)明的防御素對(duì)嗜水氣單胞菌和枯草芽孢桿菌均具有抗菌作用，其對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌都具有抗菌活性。作為一種新型的防御素,在水產(chǎn)飼料添加劑和漁藥等行業(yè)都有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/12GK103113461SQ201210439359
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者姚斌, 趙珩, 陳葉雨, 羅會(huì)穎, 楊培龍, 孟坤, 王亞茹, 石鵬君, 柏映國(guó), 黃火清 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所