專利名稱：抗a、抗b血型定型試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)雜交瘤細胞及由其制備的單克隆抗體和血型定型試劑。
背景技術(shù)：
自Landsteinor (1900)發(fā)現(xiàn)ABO血型以來,血型鑒定試劑主要用人血清,存在著個體間差異較大、質(zhì)量不穩(wěn)定、成本高、需耗用大量人血等問題。多年來各國學(xué)者一直致力尋找一種理想的試劑代替人血清，先后用魚類、蝸牛、扁豆等動植物組織漿液進行研究，但由于種種問題未能普及推廣應(yīng)用。Voak(1980)和Sacks(1981)用淋巴細胞雜交技術(shù)先后建立了分泌抗A型、抗B型單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并將其用于ABO系統(tǒng)血型鑒定。迄今已有幾株具有良好特性的抗A、抗B是可用的，其中1983年英國劍橋醫(yī)學(xué)研究所分子生物 學(xué)實驗室研制的ABO血型系統(tǒng)McAb已達到美國食品和藥品管理局(FDA)的技術(shù)標準，獲準由英國特別生物技術(shù)公司(Celltech)大批生產(chǎn)并銷往西歐、美洲和日本市場；1987年法國(CNTS)和日本出售同類產(chǎn)品。據(jù)美國波士頓生物醫(yī)學(xué)咨詢公司調(diào)查，血液制品的McAb以92%的年增長率遞增，1990年達到I億3千萬美元。如今，在世界各國，ABO血型單克隆抗體試劑已成為常規(guī)試劑，在我國抗A、抗B單克隆抗體血型試劑占所有臨床應(yīng)用的ABO血型試劑總量90%以上。我國是一個13億人口的大國，對血型定型試劑需求量非常大，而目前市場上供應(yīng)的血型定型試劑在質(zhì)量和數(shù)量上不能滿足市場的需求。目前市場上抗A抗B試劑生產(chǎn)用細胞株由于細胞培養(yǎng)分泌上清抗體鹽水凝集效價不夠國家標準，為達到國家標準，在試劑中添加少量腹水，這樣會大大增加成本，而且由于腹水中雜抗體會對試劑結(jié)果產(chǎn)生干擾。由此，開發(fā)安全可靠、性價比高的抗A、抗B單克隆抗體血型試劑具有較大的社會效益和經(jīng)濟效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種交雜瘤細胞，其保藏編號分別為CCTCCC201215和CCTCC C201216 ;分別由人A血型紅細胞、人B血型紅細胞免疫小鼠后制備獲得。本發(fā)明的另一個目的是提供上述雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體，所述單克隆抗體分別為A血型的單克隆抗體和B血型的單克隆抗體。本發(fā)明的又一個目的是提供了包含所述A血型的單克隆抗體和B血型的單克隆抗體的血型定型試劑；進一步提供了包含所述試劑的試劑盒及其使用方法。本發(fā)明的抗A和抗B單抗細胞株由于分泌上清的抗體鹽水凝集效價很高，達到甚至超過國家標準，且經(jīng)實驗證明所述抗A抗B單克隆抗體可完全滿足臨床血型篩查的需求，具有特異性強、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，各項指標達到國內(nèi)外同類產(chǎn)品的水平。生物材料的保藏信息分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株分別命名為9H5和8G9，于2012年9月18日提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC C201215和CCTCC C201216。
具體實施例方式以下實施例有助于進一步了解本發(fā)明的優(yōu)點和特點，不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制。所使用的實驗材料如無特別說明均為普通市售。實施例I抗A抗B血型單克隆抗體的制備_2] I.免疫方法和程序:免疫原分別采用人A血型紅細胞、人B血型紅細胞。免疫動物(湖北省實驗動物中心提供)BALB/C小鼠，雌性，6_8周齡。方法A型或B型紅細胞分別用生理鹽水洗滌兩次并調(diào)制成I億/每毫升濃度；對免疫動物進行多點注射，每隔一周注射一次，第四針加強后三天取脾臟細胞用于細胞融合。
2.單杭制各2. I細胞融合融合用骨髓瘤細胞用小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0 (P2-X_Ag8 · 6 · 5 · 3)(購自中國科學(xué)院武漢病毒研究所病毒保藏中心)，為Ig非分泌型。融合方法(I)制備飼養(yǎng)細胞采用BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞，作為融合時的飼養(yǎng)細胞；取BALB/C小鼠一只，拉頸處死，75 %乙醇浸泡5分鐘，在無菌操作下，用不含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基注入腹腔沖洗，并吸出沖洗液，如此反復(fù)4次，洗液用不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，計數(shù)，用含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制成I. 0X106個/ml的細胞懸液；于96孔板中按50微升/孔滴加。(2)細胞融合取加強免疫后第三天的小鼠，摘眼球放血，拉頸處死，置75%酒精浸泡5分鐘，無菌操作取出脾臟，并用眼科剪刀將其剪成數(shù)段，放入盛有不含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的IOml圓底塑料管中，用外包塑料王的研磨棒擠壓出脾細胞，靜置數(shù)分鐘，取出細胞懸液，并用不含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基混合，離心洗滌兩次，棄上清，計數(shù)，配制成細胞懸液；將SP2/0細胞與免疫脾細胞按I : 5比例混合，于4°C、1400rpm離心10分鐘，吸凈上清，加入50% PEG (Sigma P7181)處理，在5分鐘內(nèi)慢慢加入IOml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在IOOOrpm條件下離心10分鐘，棄上清，加入含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制的HAT (Sigma H0262)中，然后接種到96孔細胞培養(yǎng)板上，于融合后第10-14天挑選有雜交瘤細胞生長的孔，吸取培養(yǎng)上清液進行篩選，并換以HT培養(yǎng)基。2. 2篩詵和克降化篩選采用血凝試管滴定法。方法如下準備一排試管，第一管加入300 μ I生理鹽水和100 μ I上述融合細胞培養(yǎng)上清，其它各管分別加入200 μ I生理鹽水，做倍比稀釋。然后每管中加入200 μ I 2%的紅血球，混勻，室溫18°C -25°c放置15分鐘，IOOOrpm離心I分鐘，觀察結(jié)果。沉淀血塊搖動，有不散的血凝塊判為陽性。如全部散開無血凝塊為陰性。克隆和再克隆采用有限稀釋法，在96孔細胞培養(yǎng)板中進行。取陽性孔細胞計數(shù)，用含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋細胞至含量為5個細胞/ml，接種于一塊96孔板中，每孔O. 2ml，第10-14天采用間接檢測，挑選強陽性孔細胞擴大培養(yǎng)后凍存和再克隆，以連續(xù)兩次克隆陽性率100%為止；其中，A型或B型免疫小鼠與SP2/0骨髓瘤融合經(jīng)初步篩選，滿足以下條件克隆挑出進行再克隆上清只與免疫血型反應(yīng)而與其它血型沒有交叉反應(yīng)，上清凝集效價大于I : 64，結(jié)果分別從A和B融合細胞中篩選出3個和4個符合上述條件的克隆，并制備對應(yīng)腹水測滴度，結(jié)果見下表I和表2所示表I. A型雜交瘤細胞組織培養(yǎng)上清液和對應(yīng)腹水的凝血滴度
權(quán)利要求
1.一種血型定型試劑，包括 抗A型血型定型試劑，所述試劑含有抗A型血紅細胞的單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCC C201215的雜交瘤細胞株制備； 抗B型血型定型試劑，所述試劑含有抗B型血紅細胞的單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCC C201216的雜交瘤細胞株制備。
2.包括權(quán)利要求I所述的血型定型試劑的檢測試劑盒。
3.抗A型血型單克隆抗體，由保藏編號為CCTCCC201215的雜交瘤細胞制備。
4.抗B型血型單克隆抗體，由保藏編號為CCTCCC201216的雜交瘤細胞制備。
5.一種血型定型方法，包括將待測樣品與權(quán)利要求I所述的血型定型試劑接觸，確定所述待測樣品的血型。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗A、抗B血型的單克隆抗體及生成所述單克隆抗體的交雜瘤細胞，其保藏編號分別為CCTCC C201215和CCTCC C201216；所述雜瘤細胞分別由人A血型紅細胞、人B血型紅細胞免疫小鼠后篩選獲得。本發(fā)明還進一步提供了含所述單克隆抗體的試劑及相關(guān)試劑盒。
文檔編號C12N5/20GK102944684SQ201210440828
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者黃韞韜, 嚴兵, 尹娟, 劉非 申請人:武漢康萊博生物科技有限公司