專利名稱：一種檢測人結核桿菌相關易感基因cish +1320位點的單核苷酸多態(tài)性的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學分子生物學領域，涉及一種檢測人結核桿菌相關易感基因CISH+1320位點的單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術：
隨著人類基因組測序計劃的完成，人類已進入后基因組時代。該時代的研究重點是個體間的遺傳差異。這種差異最常見的是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism, SNP)，即在基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，它具有密度高、遺傳穩(wěn)定、易于自動化分析等特點，被認為是繼限制性片段長度多態(tài)性、微衛(wèi)星多態(tài)性之后的第三代遺傳標記，可用于基因定位、多態(tài)性分析等方面，是研究疾病易感性、 疾病診斷、藥物篩選等的常用指標。單堿基延伸法(single base primer extension)又稱微測序法、模板介導染料終止劑摻人分析或單核苷酸多態(tài)性鑒定技術(single-nucleotidepolymorphism-identification technology, SNP-IT),是在雙脫氧測序法的基礎上發(fā)展出來的單核苷酸多態(tài)性檢測方法。其原理是首先設計I對PCR引物，從基因組DNA中擴增出含有目的單核苷酸多態(tài)性位點的片段，再設計I條與待測單核苷酸多態(tài)性位點上游序列互補的延伸引物，該引物的3’端最后一個堿基與單核苷酸多態(tài)性位點上游相鄰的I個堿基互補，將延伸引物與PCR產(chǎn)物混合，摻入標記不同熒光染料的ddNTPs進行延伸反應，由于ddNTP的特性，當延伸I個堿基，即加入的ddNTP與單核普酸多態(tài)性位點堿基互補時，反應即終止，通過檢測延伸堿基所發(fā)出的熒光類型來判斷單核苷酸多態(tài)性位點的堿基類型。CISH 基因編碼 Cytokine-inducible SH2_containing protein,可調(diào)節(jié)白細胞介素-2 (IL-2)的信號傳導途徑，其特定的基因型與細菌、病毒、結核桿菌和瘧疾的易感性相關。Khor CC等人通過病例對照研究，分析二十余種免疫相關基因單核苷酸多態(tài)性與細菌、結核和瘧疾感染的相關性。研究發(fā)現(xiàn)，CISH-639、-292、-163、+1320和+3415位點的單核苷酸多態(tài)性與細菌、結核桿菌和瘧疾的易感性相關，其中，CISH+1320位點多態(tài)性與結核桿菌易感性的相關性最強。(Khor CC, et al. CISH and susceptibility toinfectiousdiseases. N Engl J Med. 2010;362(22):2092 - 2101.)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立并優(yōu)化了 PCR-熒光標記單堿基-毛細管電泳分離檢測技術檢測人CISH+1320位點基因型的方法。本發(fā)明所述方法包括以下步驟I、CISH+1320位點擴增引物及延伸引物設計與合成從NCBI Gene bank上下載人CISH基因核酸序列(登錄號NC_000003)，保存成fasta格式。米用 Primer3(http://frodo. wi. mit. edu/)設計引物(見表 I),BLASTChttp://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)驗證所設計引物的特異性。設計好的引物委托上海invitrogen合成，采用HPLC純化。2、基因組DNA樣品制備采集受試者靜脈血2mL，入乙二胺四乙酸二鉀抗凝管，混勻。采用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒(貨號51104)提取人外周血基因組DNA，按說明書操作，具體步驟如下①I. 5mL EP管中依次加入20yL QIAGEN蛋白酶，200 μ L抗凝全血，200 μ L Bufffer AL，室溫下渦旋混勻15秒；②56°C孵育lOmin，瞬時離心；③加入200 μ L無水乙醇，室溫下渦旋混勻15秒，瞬時離心；④將裂解產(chǎn)物轉移至提取柱上，6000g離心I分鐘，棄濾過液；⑤加入500 μ LBuffer Affl,6000g離心I分鐘，棄濾過液;⑥加入500 μ LBuffer AW2，20000g離心3分鐘，棄濾過液;⑦換收集管，加入100 μ LBuffer AE，6000g離心I分鐘洗脫，將DNA溶液置超低溫冰箱保存。3、PCR擴增目的片段按下列反應體系配置PCR反應液,加入O. 2mL PCR管中。


權利要求
1.一種檢測人結核桿菌相關易感基因CISH+1320位點的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征方法在于檢測方法包括如下步驟 (1)設計CISH單核苷酸多態(tài)性位點的擴增引物及延伸引物； (2)制備人全血基因組DNA樣本； (3)PCR擴增靶片段； (4)PCR擴增產(chǎn)物純化； (5)單堿基延伸反應制備CISH1320+位點多態(tài)性的樣本； (6)采用毛細管電泳檢測樣本單核苷酸多態(tài)性位點； (7)采用Fragment程序分析，根據(jù)片段分析結果中單堿基延伸所產(chǎn)生的峰來判讀相應的堿基，確定CISH+1320位點的單核苷酸多態(tài)性。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于可進一步采用測序方法，驗證PCR-單堿基延伸檢測方法的準確性。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于設計的單核苷酸多態(tài)性位點擴增引物的上游引物序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 2所示；延伸引物序列如SEQID NO. 3 所示。
4.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在步驟(3)中的PCR反應體系。
dd H2O27pL IOx PCR緩沖液(不包含Mg2+)5 μ MgCl2 (25mM)3 pL dNTP2 ‘liL 上游引物(ΙΟμΜ)I μ , 下游引物(ΙΟμΜ)IpL。 rTaq 酶I IiL 基因組DNA10 μL 總體積-----------------------------------------------50 μ
5.根據(jù)權利要求I或4所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的PCR循環(huán)條件為94-98°C變性30秒，56-68°C退火60秒，72°C延伸30-180秒，共30-40個循環(huán)；最佳循環(huán)反應條件為94°C 30秒，64°C 30秒，72°C 30秒，共35個循環(huán)。
6.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于根據(jù)BeckmanCEQ8000遺傳分析儀分析軟件(9. O版本)中的片段分析(Fragments)程序的軟件判斷結果,評價人CISH+1320位點的多態(tài)性，或者進一步將該結果和DNA測序的結果進行比較。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學分子生物學領域，公開了一種檢測人結核桿菌相關易感基因CISH+1320位點的單核苷酸多態(tài)性的方法。該方法應用PCR-熒光標記單堿基-毛細管電泳分離檢測技術檢測CISH+1320位點多態(tài)性，具體方法包括人全血基因組DNA提取、單核苷酸多態(tài)性位點擴增引物及延伸引物設計與合成、PCR擴增產(chǎn)物質量驗證、單核苷酸多態(tài)性位點檢測樣本的制備及檢測、數(shù)據(jù)分析、與測序結果的對照評價。本發(fā)明在保證結果可靠性的基礎上，不需要像測序法那樣檢測較長的無關片段，只需要產(chǎn)生單個堿基的信號，避免了無關片段的復雜結構對檢測的干擾，檢測周期和成本均顯著低于測序法，結果可讀性強。
文檔編號C12Q1/68GK102912029SQ20121044095
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權日2012年11月6日
發(fā)明者俞楊, 王自正, 鄔蘭, 焦杰, 杜同信, 瞿衛(wèi), 謝玉為 申請人:俞楊, 王自正, 鄔蘭, 焦杰, 杜同信, 瞿衛(wèi), 謝玉為