專利名稱：一種文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白及其表達(dá)基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白及其表達(dá)基因與應(yīng)用，特別是一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbtSmad6/7及其表達(dá)基因與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)化生長因子家族(TransformingGrowth Factor-beta, TGFβ )參與細(xì)胞分裂、分化、遷移、附著、死亡和免疫應(yīng)答等細(xì)胞活動。TGF-β通過與特異受體結(jié)合行使生理功能。TGF-β配體-受體的相互作用及下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑被廣泛研究。最經(jīng)典的信號通路模式是，TGF-β與活化的TGFR-II結(jié)合，促進TGFR-I的富集和磷酸化?；罨腡GFR-I通過在細(xì)胞內(nèi)憐酸化 R-Smad (receptor-activated members of the Smad)起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。激活的R-Smad與Smad4相互作用并與轉(zhuǎn)錄輔助因子一起轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，異構(gòu)復(fù)合物調(diào)控靶基因的表達(dá)。I-Smad (inhibitory Smad),如 Smad6 或 Smad7,阻止 R-Smad 憐酸化和 R-Smad/Smad4異構(gòu)復(fù)合物向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，從而負(fù)調(diào)控TGF-β的誘導(dǎo)效應(yīng)。在細(xì)胞核內(nèi)，Smad復(fù)合物解體，磷酸化的R-Smad通過核磷酸酶(如PPM1A/PP2C)解磷酸化,使Smad游離并運往細(xì)胞質(zhì)。只要活性受體存在，這種循環(huán)就一直延續(xù)。有目的地調(diào)控和干預(yù)Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有助于促進對創(chuàng)傷愈合與胚胎發(fā)育的理解，加深對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識等。Smad家族成員有3種受體活化型或通路限制型Smad(R-Smad),共同通路型Smad(Co-Smads)和抑制型 Smad (I-Smads) I-Smad (inhibitory Smad),如 Smad6 或 Smad7,阻止R-Smad磷酸化和后續(xù)的R_Smad/Smad4異構(gòu)復(fù)合物的核定位。I-Smad的誘導(dǎo)表達(dá)對TGF- β信號傳導(dǎo)進行負(fù)反饋調(diào)控。I-Smad含有C端ΜΗ2結(jié)構(gòu)域缺少MHl結(jié)構(gòu)域。Smad6通過打破Smadl與Co-Smad間的聯(lián)系阻抑BMP信號通路并形成無活的Smadl/Smad6復(fù)合物。另夕卜，Smad7通過結(jié)合TGF- β、activin和BMP type I receptor阻止R-Smad憐酸化。革巴基因轉(zhuǎn)錄后Smad復(fù)合物從染色質(zhì)上被釋放并經(jīng)歷泛素化(ubiquitination)。我們對文昌魚中的I-Smad基因進行了分離，并將其命名為Bbsmad6/7，并發(fā)現(xiàn)細(xì)菌沖擊后BbSmad6/7基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生上調(diào)，這說明TGF β -SMAD信號通路很可能參與了免疫應(yīng)答。文昌魚既具有脊椎動物的基本特征，又具有許多無脊椎動物的特征。深入開展文昌魚免疫系統(tǒng)的研究不僅有助于闡明脊椎動物和人類免疫性的起源和進化，更可以與其它海洋生物進行縱向比較，幫助我們找到海洋生物特異的防御機制，認(rèn)識和闡明海水養(yǎng)殖動物免疫防御機制對病原感染應(yīng)答的規(guī)律，為海水養(yǎng)殖動物的病害控制提供新思路，為病害的免疫防治技術(shù)提供理論依據(jù)。從而為我國海水養(yǎng)殖業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展提供有力的保障和促進。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白及其表達(dá)基因與應(yīng)用。術(shù)語說明I. PCR技術(shù)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTP進行體外擴增特定DNA片段的技術(shù)。2.⑶D析軟件NCBI網(wǎng)站上提供的一種用來推測和分析特定氨基酸序列形成的結(jié)構(gòu)域信息的軟件。本發(fā)明技術(shù)方案如下一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7的表達(dá)基因，核苷酸序列如SEQID No. I所示。
一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7，氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。一種重組載體，插入了 SEQ ID NO. I所示核苷酸序列。該重組載體由pEASY_T3載體插入SEQ ID NO. I所示核苷酸序列獲得,該表達(dá)載體購自德國Novagen公司。一種重組大腸桿菌，轉(zhuǎn)入了上述SEQ ID No. I所示核苷酸序列或上述重組載體。上述文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7的表達(dá)基因、重組載體或重組大腸桿菌在制備海水養(yǎng)殖免疫防治藥物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明首次從模式動物青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtauense)中克隆并表達(dá)了一個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7的表達(dá)基因并利用該基因表達(dá)了細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7。經(jīng)驗證其在成體文昌魚各組織中廣泛分布，在細(xì)菌沖擊成體文昌魚后表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，從而揭示了其在先天免疫中的作用。本發(fā)明所述的表達(dá)基因有助于從理論上提高對免疫系統(tǒng)構(gòu)成和免疫應(yīng)答機制的認(rèn)識，為在基因水平生產(chǎn)開發(fā)新的細(xì)菌防治藥物奠定基礎(chǔ)，并可為海水養(yǎng)殖動物的病害控制提供新思路，為病害的免疫防治技術(shù)提供理論依據(jù)和基因來源。


圖I、青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtauense)成體總 RNA提取的電泳圖；其中左側(cè)泳道、青島文昌魚成體總RNA，右側(cè)泳道、DNA分子量標(biāo)記(marker)；圖2、通過PCR擴增克隆的編碼文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7基因片段的電泳圖；其中左側(cè)泳道、擴增的DNA片段，右側(cè)泳道、DNA分子量標(biāo)記(marker)；圖3、文昌魚不同組織中細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7表達(dá)量的柱狀圖；圖4、革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌沖擊成體文昌魚后細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7表達(dá)量的柱狀圖。
具體實施例方式下面結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。
實施例I青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7編碼基因的克隆I. I青島文昌魚總RNA的的提取(提取步驟參照Takara公司的相關(guān)試劑盒說明書)。I)將IOOmg新鮮組織(文昌魚成體)剪碎放入預(yù)I. 5mlep管中。2)加入ImlTrizol試劑,用研磨件快速研磨組織至無大的組織塊,室溫靜置5min,使組織充分裂解。此時樣品可放入_80°C長期保存。3)每ImlTrizol試劑加入O. 2ml的三氯甲烷(氯仿)，加蓋封嚴(yán)，劇烈震蕩15s，室溫靜置15分鐘。4)4°C,1000g,離心15min。此時樣品分為三層下層的紅色有機相，中間層及上層水相，RNA即留在上層水相中。5)將上層水相轉(zhuǎn)移如一干凈的離心管中。6)在水相中按O. 5ml異丙醇/ImlTrinzol加入異丙醇，混勻，室溫放置5min_10mino7)4°C,12000g,離心IOmin,棄上清。RNA沉淀在管底呈凝膠狀。8)按lml75%乙醇(DEPC水配制)/ImlTrizol試劑加入75%乙醇，溫和振蕩，懸浮沉淀。9) 4°C, 8000g,離心 5min,棄上清。10)室溫晾干或真空干燥5-10min。11)用50 μ IDEPC水或TE緩沖液溶解RNA，進行下一步實驗或在_70°C冰箱。12)得到的成體文昌魚總RNA經(jīng)lwt%瓊脂糖凝膠電泳檢測，沒有發(fā)生降解，結(jié)果如圖I所示。I. 2cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)(合成步驟參照TIANGEN公司的相關(guān)試劑盒說明書)。以文昌魚組織中提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)cDNA第一鏈，按以下順序及量加入200 μ IEP 管中25mM MgCl2, 4 μ I ； 10 X buffer, 2 μ I ；dNTP,2y I ；RNase inhibitor,0· 5μ I ;AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0· 6μ I ;01igoT primer，I μ I ;模板，8 μ I ;ddH20 2 μ I 20μ I,42 °C，50 分鐘；經(jīng)PCR擴增，制得第一鏈cDNA。I. 3利用PCR進行基因序列擴增以第一鏈cDNA為模板，做PCR擴增，PCR擴增引物如下BbSmad6/7-F :AACATGTTCCGGTCGCGAAGAT，和BbSmad6/7-R GCCCTCATCGATTGATGTTGAGTAGG ；PCR反應(yīng)條件為98°C，5分鐘；然后94°C，O. 5分鐘；55°C，I. 5分鐘；72°C，2分鐘，35個循環(huán)后，72 °C，延伸10分鐘。對PCR擴增產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明獲得一條約I IOObp的DNA片段。然后用TIANGEN公司的DNA回收試劑盒按照其說明回收擴增DNA片段。結(jié)果如圖2所
/Jn ο實施例2基因序列測定
2. I. DNA片段與克隆載體連接將回收DNA片段連接到Transgene公司的pEASY_T3載體上。連接反應(yīng)體系為連接載體酶混合物1μ 1，外源DNA片段4μ 1，手指輕彈離心管，混勾樣品，尚心2秒鐘，把樣品集中在管底，37 C連接5分鐘。2. 2.按《分子克隆實驗指南》上制備大腸桿菌感受態(tài)的方法制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)。2. 3.按《分子克隆實驗指南》上的熱激轉(zhuǎn)化方法將連接好的重組載體PEASY-T3轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5a感受態(tài)。2. 4.轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5 a涂于含100 μ g/L氨芐青霉素的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 °C過夜培養(yǎng)，挑選白色轉(zhuǎn)化子作為模板，用T7和SP6作為引物，通過菌落PCR驗證白色轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒是否含有PCR擴增的DNA片段；T7和SP6的引物序列如下 Τ7 TAATACGACTCACTATAGGGSP6:ATTTAGGTGACACTATAG2. 5.將質(zhì)粒含有PCR擴增的DNA片段的轉(zhuǎn)化子送上海博尚生物技術(shù)公司測序。因此，獲得青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7的序列(序列如SEQ ID NO. I所示)。通過NCBI網(wǎng)站的blastX軟件分析發(fā)現(xiàn)其中含有一個1185bp的編碼青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7的開放閱讀框架，共編碼394個氨基酸(序列如SEQ ID NO. 2所示)。實施例3青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7成體表達(dá)模式研究3. I青島文昌魚新鮮成體組織/器官(鰓、肝盲囊、腸、表皮、肌肉、卵巢、精巢)RNA的提取。具體步驟同1.1。3. 2cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)。具體步驟同I. 2。3. 3Real_Time PCR將10μ I SYBR Premix Ex Taq(2χ),O. 4 μ I PCR Forward Primer(10 μ Μ),0. 4 μ IPCRReverse Primer (10 μ Μ), 2 μ I DNA template (成體文昌魚免疫沖擊前后各組織 cDNA)和 6. 8 μ I Sterilized ddH20 混勻。微離心。按照如下程序運行real-time PCR :95。C30s，I 個循環(huán)一95。C5s，60。C30s，40個循環(huán)一95。C15s，60° Clmin，95° C15s，l 個循環(huán)。3. 4對PCR產(chǎn)物濃度作定量分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7在成體文昌魚的肝盲囊、表皮、肌肉、鰓、腸、卵巢和精巢中都有不同程度的表達(dá)。如圖3所示。實施例4青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7免疫沖擊前后表達(dá)模式研究4. I免疫沖擊將成體文昌魚(Branchiostomabelchri tsingtauense)培養(yǎng)在 IO7 大腸桿菌(E.coli)或金黃色葡萄球菌(S. aureus)中。等量PBS溶液作為對照。第0/2/4/8/12/24小時取適量文昌魚進行組織分離。4. 2組織進行RNA提取。具體步驟同I. I。4. 3cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)。具體步驟同I. 2。4. 4Real-Time PCR0 具體步驟同 3. 3。
4. 5對PCR產(chǎn)物濃度作定量分析，分析結(jié)果顯示大腸桿菌沖擊4h時細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7表達(dá)增加；12h時轉(zhuǎn)錄約為正常水平的3倍；沖擊24h時表達(dá)水平下降，但仍高于正常水平。金葡菌沖擊后細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7的表達(dá)變化與大腸桿菌沖擊后的應(yīng)答模式相似。如圖4所示。實驗結(jié)果顯示青島文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7在成體文昌魚各組織中廣泛分布以及在細(xì)菌沖擊成體文昌魚后表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，從而揭示了其在先天免疫中發(fā)揮作用的可能。
權(quán)利要求
1.一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7的表達(dá)基因，核苷酸序列如 SEQ ID No. I 所示。
2.一種海洋模式生物文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7，氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。
3.一種重組載體，插入了 SEQ ID NO. I所示核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的重組載體，該重組載體由pEASY-T3載體插入SEQID NO. I所示核苷酸序列獲得。
5.一種重組大腸桿菌，轉(zhuǎn)入了 SEQ ID No. I所示核苷酸序列或含有權(quán)利要求3所述的重組載體。
6.權(quán)利要求I所述文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7的表達(dá)基因、權(quán)利要求3所述重組載體或權(quán)利要求5所述的重組大腸桿菌在制備海水養(yǎng)殖免疫防治藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白及其表達(dá)基因與應(yīng)用，文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7的表達(dá)基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；該文昌魚細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白BbSmad6/7，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明所述的表達(dá)基因有助于從理論上提高對免疫系統(tǒng)構(gòu)成和免疫應(yīng)答機制的認(rèn)識，為在基因水平生產(chǎn)開發(fā)新的細(xì)菌防治藥物奠定基礎(chǔ)，并可為海水養(yǎng)殖動物的病害控制提供新思路，為病害的免疫防治技術(shù)提供理論依據(jù)和基因來源。
文檔編號C12N1/21GK102925449SQ201210441928
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者馮力駿, 張妍, 孔雨, 張長青, 董璇, 閆杰, 荊韌威, 李開霖, 劉歡歡, 劉凱興 申請人:山東大學(xué)