專利名稱：用于前列腺癌早期診斷的引物對(duì)、探針和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于前列腺癌早期診斷的引物對(duì)、探針和試劑盒。
背景技術(shù)：
前列腺癌是男性常見病和多發(fā)病。目前常用的前列腺癌早期診斷方法有直腸指診、超聲引導(dǎo)前列腺穿刺活檢和影像學(xué)診斷等，這些方法都存在一定的局限性，直腸指診是一種非特異的檢查方法，只能作為前列腺癌的一種篩查方法；部分穿刺活檢準(zhǔn)確性差，如組織用蘇木精-伊紅染色法檢測(cè)結(jié)果提示腫瘤為陰性而被診斷為前列腺良性病變的患者，實(shí)際卻患有前列腺癌；影像學(xué)診斷同樣存在缺陷，如磁共振成像的相關(guān)檢查技術(shù)費(fèi)用昂貴難以普及應(yīng)用，CT在前列腺癌的早期診斷上沒有特別突出的優(yōu)勢(shì)等。生物指標(biāo)的基因表達(dá)水平現(xiàn)已成為疾病診斷的新方向。臨床上最常用的前列腺癌腫瘤標(biāo)志物是血清前列腺特異抗原(PSA)，盡管血清PSA的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)早期的前列腺癌，但是檢測(cè)血清PSA的方法特異性不高，特別是PSA值處于riOng/mL檢測(cè)灰區(qū)的病人，·活檢陽性率僅有20. 4%。目前，前列腺癌抗原3基因(PCA3)被認(rèn)為是前列腺癌最特異的基因，它在正常前列腺組織中呈低表達(dá)，在前列腺腫瘤中表達(dá)量顯著增高，在其他正常組織、腫瘤組織中均不表達(dá)。另外還有跨膜絲氨酸蛋白酶2基因和成紅細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)化基因相關(guān)基因的融合基因(TMPRSS2:ERG)對(duì)診斷前列腺癌的特異性也很高，只是靈敏度偏低。當(dāng)前，對(duì)于前列腺癌生物指標(biāo)的基因表達(dá)水平的檢測(cè)正由對(duì)特異性不高的PSA基因表達(dá)水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)向?qū)μ禺愋暂^高的PCA3、TMPRSS2:ERG等基因表達(dá)水平的檢測(cè)。但是最常用的仍是實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)，雖然RT-PCR的檢測(cè)靈敏度高，但對(duì)設(shè)備和診斷試劑要求比較苛刻，試劑成本比較高，而且需要具有專業(yè)技能的人員去操作并且解讀結(jié)果，普及性差。而且一般僅以單個(gè)生物指標(biāo)的表達(dá)水平作為前列腺癌診斷依據(jù)。這種單指標(biāo)診斷存在容易漏診或者誤判以及準(zhǔn)確度不高的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于前列腺癌早期診斷的三組引物對(duì)，該三組引物對(duì)用于采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)人體跨膜絲氨酸蛋白酶2基因和成紅細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)化基因相關(guān)基因的融合(TMPRSS2: ERG)、前列腺癌抗原3 (PCA3)、血清前列腺特異抗原(PSA)基因的表達(dá)水平。該三個(gè)生物指標(biāo)聯(lián)合，可以提高前列腺癌早期診斷的準(zhǔn)確率，能克服僅檢測(cè)單個(gè)生物指標(biāo)的基因表達(dá)水平容易出現(xiàn)漏診或者誤判以及準(zhǔn)確率低的問題。本發(fā)明解決以上技術(shù)問題采取的技術(shù)方案是所述用于前列腺癌早期診斷的三組引物對(duì)，其第一組引物對(duì)具有SEQ IDN0:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；第二組引物對(duì)具有SEQ IDN0:2和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；第三組引物對(duì)具有SEQ IDN0:3和SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，所述三組引物對(duì)通過轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)來檢測(cè)人體體內(nèi)TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表達(dá)水平，以判斷前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于前列腺癌早期診斷的三個(gè)DNA探針，用于采用固定化雜交保護(hù)法定量檢測(cè)TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因的表達(dá)水平，以提高前列腺癌早期診斷中生物指標(biāo)表達(dá)水平檢測(cè)的準(zhǔn)確性和操作的方便性。解決以上技術(shù)問題采取的技術(shù)方案是所述前列腺癌早期診斷的三個(gè)DNA探針，在3’端均標(biāo)記有生物素，并且分別具有SEQ IDNO: 7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，且該SEQ IDNO: 7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中*位置接有氨
基酸自由基，并且該氨基酸自由基上接有發(fā)光基團(tuán)。上述發(fā)光基團(tuán)是吖啶酯。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述用于前列腺癌早期診斷的DNA探針的制備方法。解決以上技術(shù)問題采取的技術(shù)方案是在3’端標(biāo)記有生物素、且具有SEQIDNO:7, SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列的DNA探針中*位置的氨基酸自 由基上接上發(fā)光基團(tuán)——吖啶酯，具體步驟如下
第一步，將吖啶酯溶于二甲基亞砜；
第二步，在水的參與下，溶有二甲基亞砜的吖啶酯與干燥的上述3’端標(biāo)記有生物素、且具有SEQ IDNO:7, SEQ ID N0:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的DNA探針在20 45° C、pH6 9條件下反應(yīng)20 60 min，再用賴氨酸中止反應(yīng)。第三步，加入醋酸鈉和糖原，混勻后加入無水乙醇，并在0° C以下反應(yīng)5 HiirTlOh，離心除去上清，保留沉淀物。第四步，沉淀物用水溶解后，用反相高效液相色譜純化。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種前列腺癌早期診斷試劑盒，該試劑盒能夠用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)和固定化雜交保護(hù)法快速地定量檢測(cè)人體體內(nèi)TMPRSS2:ERG和PCA3基因表達(dá)水平。由于TMPRSS2:ERG和PCA3基因均是前列腺癌特異性高的基因，因此利用該雙指標(biāo)聯(lián)合診斷早期前列腺癌能提高前列腺癌早期的診斷準(zhǔn)確率，而利用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)和固定化雜交保護(hù)法檢測(cè)TMPRSS2: ERG和PCA3基因的表達(dá)水平，需要以PSA基因的表達(dá)水平為基準(zhǔn)值，因此本試劑盒中也包括檢測(cè)人體體內(nèi)PSA基因表達(dá)水平的診斷試劑。解決以上技術(shù)問題采取的技術(shù)方案是所述前列腺癌早期診斷試劑盒含有，
容器al，容器al中裝有用于檢測(cè)TMPRSS2:ERG基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子
引物具有SEQ IDNO: I所示的核苷酸序列；
容器a2，容器a2中裝有用于檢測(cè)TMPRSS2: ERG基因表達(dá)水平的反向引物，該反向引物具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
容器b I，容器b I中裝有用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
容器b2，容器b2中裝有用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的反向引物，該反向引物具有SEQID N0:5所示的核苷酸序列；
容器c I，容器c I中裝有用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
容器c2，容器c2中裝有用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的反向引物，該反向引物具有SEQID N0:6所示的核苷酸序列；
容器d，容器d中裝有逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的混合液；以及固相載體，該固相載體上涂有抗生蛋白鏈菌素，該抗生蛋白鏈菌素上接有上述標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針。上述固相載體可以是96孔板。上述試劑盒中還包括容器e，容器e中裝有由已知拷貝數(shù)的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA轉(zhuǎn)錄物組成的標(biāo)準(zhǔn)品。上述試劑盒中還包括容器f，容器f中裝有由已知拷貝數(shù)的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA轉(zhuǎn)錄物組成的對(duì)比品。上述試劑盒中還包括容器g，容器g中裝有mRNA提取液。上述試劑盒中還包括容器h，容器h中裝有雜交液。上述試劑盒中還包括容器i，容器i中裝有選擇液。 上述試劑盒中還包括容器j，容器j中裝有顯色液。該前列腺癌早期診斷試劑盒，利用的是轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)以及固定化雜交保護(hù)法。相比RT-PCR，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)可以在低溫下和一個(gè)試管內(nèi)進(jìn)行高拷貝地?cái)U(kuò)增TMPRSS2: ERG、PCA3 和 PSA 的 mRNA。擴(kuò)增出的 TMPRSS2: ERG、PCA3 和 PSA 的 mRNA 可以又作為下一輪擴(kuò)增的自身模板，這樣在15 30 min內(nèi)可將TMPRSS2:ERG、PCA3和PSA的mRNA擴(kuò)增101°倍左右，從而有利于提高TMPRSS2:ERG和PCA3基因表達(dá)水平的靈敏度。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增后的mRNA通過雜交到標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針上，這樣后續(xù)便非常方便。當(dāng)標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針和病人體內(nèi)的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因結(jié)合形成雙鏈以后，吖啶酯發(fā)光基團(tuán)被保護(hù)；而沒有進(jìn)行雜交的單鏈記有吖啶酯和生物素的DNA探針上的吖啶酯發(fā)光基團(tuán)被水解，無法再發(fā)光。而且雙鏈上吖啶酯發(fā)光基團(tuán)的光信號(hào)可以被普通光檢測(cè)儀檢測(cè)到，通過發(fā)光信號(hào)強(qiáng)弱的檢測(cè)，以PSA基因表達(dá)水平作為基準(zhǔn)值，可以方便、靈敏、低成本地檢測(cè)病人體內(nèi)的TMPRSS2:ERG和PCA3的基因表達(dá)水平。由于該試劑盒可以同時(shí)診斷PCA3和TMPRSS2:ERG兩個(gè)基因的表達(dá)水平，從而極大提高了前列腺癌的診斷準(zhǔn)確性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本發(fā)明是通過轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)人體內(nèi)的PCA3和TMPRSS2:ERG兩個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)，并以PSA基因的表達(dá)水平為基準(zhǔn)值，為前列腺癌的早期篩查、預(yù)后和制定治療方案提供依據(jù)。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)原理如下
轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)是利用RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶在42等溫反應(yīng)條件下擴(kuò)增RNA，該技術(shù)要針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物一啟動(dòng)子引物和反向引物，其中啟動(dòng)子引物上具有T7RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子引物與靶序列結(jié)合后，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，形成RNA-DNA雜交分子。反轉(zhuǎn)錄酶所具有的核糖核酸酶H活性可以水解RNA-DNA雜交分子，形成單鏈DNA，該單鏈DNA含有T7RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列。然后反向引物與單鏈DNA結(jié)合，通過反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA。T7RNA聚合酶結(jié)合在啟動(dòng)子上，以DNA為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，由一分子DNA模板可以得到10(Γ1000拷貝轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本又進(jìn)入反應(yīng)，作為轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增的起始模板，重復(fù)上述步驟。在轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)中，產(chǎn)物RNA呈指數(shù)增長(zhǎng)，在15 30min內(nèi)可將靶序列擴(kuò)增IOltl倍左右。反應(yīng)完成后，可用雜交保護(hù)試驗(yàn)對(duì)RNA產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法是先用吖啶酯標(biāo)記的DNA探針與產(chǎn)物進(jìn)行雜交，如探針不能和產(chǎn)物雜交，則會(huì)被選擇性除去，所以用光度計(jì)檢測(cè)為陰性，如果探針與產(chǎn)物中的靶序列雜交，則探針上的吖啶酯為DNA雙螺旋所保護(hù)而不被水解，所以光度計(jì)檢測(cè)為陽性，而且雜交探針的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與靶核酸的量成正比，由此可以對(duì)RNA進(jìn)行定量。
實(shí)施例一、引物對(duì)
根據(jù)上述轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)原理，及美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank公開的基因的參考序列，分別設(shè)計(jì)檢測(cè)設(shè)計(jì)的分別用于檢測(cè)TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因的表達(dá)水平的弓丨物對(duì)，均具有啟動(dòng)子引物和反向引物，其中
用于檢測(cè)TMPRSS2:ERG基因表達(dá)水平的引物對(duì)為
啟動(dòng)子引物(SEQ ID NO 1)
AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACGAGCGCGGCAGGAAGCCTTATCAGTT反向引物(SEQ ID NO 4)
AGCCAGGTGTGGCGTTCCGTA用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的引物對(duì)
啟動(dòng)子引物(SEQ ID NO 2)
AAA TTAA TACGACTCACTAT AGGGAGACTCCACACACACAGGAAGCACAA反向引物(SEQ ID NO 5)
TCTAATGTCCTTCCCTCACAAGCG用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的引物對(duì)
啟動(dòng)子引物(SEQ ID NO 3)
AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCCCACTGCATCAGGAACAAA反向引物(SEQ ID NO 6)
AGCTGTGGCTGACCTGAAATACCT二、標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針
發(fā)明人根據(jù)上述轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)原理和固定化雜交保護(hù)法，設(shè)計(jì)了分別用于檢測(cè)TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表達(dá)水平的標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針，分別如下用于檢測(cè)TMPRSS2:ERG基因表達(dá)水平的標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針(SEQ IDNO 7)
GGCAGGAAG*CCTTATCAGTTGTGAGTaaaaaaaaaaaaaaa/iUniAmM//3Bio/
用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的標(biāo)記有AE和生物素的DNA探針(SEQ ID NO 8) AAGGAAGCACAG*AGATCCCTGGGAGAAAaaaaaaaaaaaaaaa/iUniAmM//3Bio/
用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的標(biāo)記有AE和生物素的DNA探針(SEQ ID NO 9) AGCTGCCCACT*GCATCAGGAACAAAAaaaaaaaaaaaaaaa/iUniAmM//3Bio/
上述三個(gè)標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針中的iUiAmM的意思是該核苷酸序列經(jīng)過內(nèi)部氨基酸改性，在序列中*位置接有氨基酸自由基，該自由基上結(jié)合有吖啶酯發(fā)光基團(tuán)。上述三個(gè)標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針中的3Bio意思是在上述DNA探針的核苷酸序列的3’端標(biāo)記有生物素(Biotin)，該生物素可以與涂布在96-孔板上的抗生蛋白鏈菌素結(jié)
口 O三、標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針的制備方法
所述標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針的制備方法，是分別在上述3’端標(biāo)記有生物素、且具有SEQ IDNO:7,SEQ ID N0:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序的DNA分子探針中*位置的氨基酸自由基上接上發(fā)光基團(tuán)吖啶酯，具體步驟如下
第一步，吖啶酯標(biāo)記反應(yīng)
將干燥的3’端標(biāo)記有生物素的DNA探針與3 μ 雙蒸水、I μ lmol/L 4_羥乙基哌嗪乙磺酸(pH 8. O)溶液、4 μ 二甲基亞砜、2 μ 25mmol/L吖啶酯二甲基亞砜溶液一起混勻后，離心2 min,收集的上清液于37 ° C下反應(yīng)20 min后,依次加入3. O μ 25mmol/L吖啶酯二甲基亞砜溶液、I. 5 μ 雙蒸水、O. 5 μ lmol/L 4_羥乙基哌嗪乙磺酸(pH 8.0)， 混勻并離心2 min，收集的上清液在37 C下反應(yīng)20 min后，加入5倍于上述反應(yīng)液體積的賴氨酸溶液，在室溫反應(yīng)5 min以中止吖啶酯標(biāo)記反應(yīng)。上述賴氨酸溶液的配制方法是將賴氨酸用0.1 mol/L 4_羥乙基哌嗪乙磺酸(pH 8. O)配制成O. 125 mol/L的賴氨酸4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液，再與等體積的二甲基亞砜混合。第二步，乙醇初步純化
在上述第一步中用賴氨酸溶液中止反應(yīng)后的終反應(yīng)液中加入30μ 3 mol/L醋酸鈉(pH 5.0),245 μ 純凈水、5 PL糖原，振蕩后再加入640 μ 無水乙醇，置冰上反應(yīng)5 10 min,或者在-20 C放置12 h，再15，000 rpm離心5 min,舍棄上清，加入200 μ 純凈水溶解沉淀物，得到用乙醇初步純化的標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針樣品。第三步，反相高效液相色譜純化
將第~■步收集的初步純化的標(biāo)記有卩「唳酷和生物素的DNA探針樣品用反相聞效液相色譜純化，使用的反相高效液相色譜柱為Vydac C4反相柱，即Vydac公司生產(chǎn)的300Α TP系列色譜柱中的C4鍵合硅膠色譜柱，洗脫緩沖液為0. I mol/L醋酸三乙胺和乙腈，洗脫梯度為10 15% (質(zhì)量百分比濃度)的乙腈以I mL/min的流速洗脫25 min，洗脫液在260 nm檢測(cè)。將上述制備好的標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針固定在涂有抗生蛋白鏈菌素的96孔板上，其方法是將從反相高效液相色譜柱上收集到的標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針樣品用雜交液稀釋100(Γ2000倍，然后按每孔的添加量添加到涂有抗生蛋白鏈菌素的96孔板上，在4 C輕微振蕩40 min，然后再用雜交液沖洗兩次，風(fēng)干即可。上述雜交液為230 mmol/L氫氧化鋰、10 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸、20mmol/L乙二胺四乙酸、100 mmol/L 丁二酸、I. 2 mol/L氯化鋰、2% 二燒基硫酸鋰、15 mmol/L二硫二吡啶(pH 4. 7)。四、試劑盒
試劑盒能夠用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)和固定化雜交保護(hù)法快速地定量檢測(cè)人體體內(nèi)TMPRSS2:ERG和PCA3基因的表達(dá)水平。該試劑盒包括
容器al，容器al中裝有用于檢測(cè)TMPRSS2:ERG基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列；
容器a2，容器a2中裝有用于檢測(cè)TMPRSS2: ERG基因表達(dá)水平的反向引物，該反向引物具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
容器b I，容器b I中裝有用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
容器b2，容器b2中裝有用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的反向引物，該反向引物具有SEQID N0:5所示的核苷酸序列；
容器c I，容器c I中裝有用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物，該啟動(dòng)子引物具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
容器c2，容器c2中裝有用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的反向引物，該反向引物具有SEQID N0:6所示的核苷酸序列；
其中啟動(dòng)子引物以200 nmol/L的濃度混合于TMA混合物I中，該TMA混合物I包括40 mmol/L三輕甲基氨基甲燒-鹽酸(pH7. 5)、20 mmol/L氯化鎂、17. 5 mmol/L氯化鉀、2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸、50 g/L聚維酮。反向引物以I. 2 mmol/L的濃度混合于TMA混合物II中，該TMA混合物II包括80 mmol/L羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 7. 5)、32mmol/L氯化鎂、14. 8 mmol/L氯化鉀、16 mmol/L核糖核苷三磷酸、100 g/L聚維酮。容器d，容器d中裝有逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的混合液，其中逆轉(zhuǎn)錄酶為1000單位的莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA聚合酶為600單位的T7RNA聚合酶；以及
96孔板，該96孔板上涂布有抗生蛋白菌素，該抗生蛋白菌素與標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針相連接。容器e，容器e中裝有由已知拷貝數(shù)的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA轉(zhuǎn)錄物組成的標(biāo)準(zhǔn)品。容器f，容器f中裝有由已知拷貝數(shù)的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA轉(zhuǎn)錄物組成的對(duì)比品。容器g，容器g中裝有mRNA提取液。該mRNA提取液包括Trizol LS液、氯仿、異丙醇、乙醇、DEPC水。其中Trizol LS液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試劑，由苯酹、異硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸鈉、醋酸鈉、檸檬酸鈉配制而成；
DEPC水是本領(lǐng)域公知識(shí)試，“DEPC”即二乙基焦碳酸酯，DEPC水是指含0. 1%DEPC的水，即在IOOOmL雙蒸水中加入DEPC原液lmL，搖勻過夜。容器h,容器h中裝有雜交液,該雜交液為230 mmol/L氫氧化鋰、10 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸、20 mmol/L乙二胺四乙酸、100 mmol/L 丁二酸、I. 2 mol/L氯化鋰、2%二烷基硫酸鋰、15 mmol/L 二硫二吡啶(pH 4.7)。容器i，容器i中裝有選擇液，選擇液為600 mmol/L硼酸、182 mmol/L氫氧化鈉、
1%聚乙二醇辛基苯基醚。容器j,容器j中裝有顯色液,顯色液為0. 1%雙氧水、0. 001 mol/L硝酸、lmol/L氫氧化鈉。使用該試劑盒檢測(cè)人體內(nèi)TMPRSS2:ERG、PCA3基因的表達(dá)水平時(shí)，檢測(cè)樣是尿液，每次檢驗(yàn)均設(shè)陰性和陽性對(duì)照。具體的檢測(cè)方法是
第一步，病人尿液中mRNA的提取在I. 5mL微量離心管中加入病人尿液100 PL 500 μ ,再加入Trizol LS液500 μ L，充分混勻，室溫放置10 min,加入200 μ L氯仿,蓋緊尚心管蓋,用力震蕩尚心管使溶液充分乳化，室溫放置10 min，在4° C、以13000 r/min的速度離心15min，將上層液移入另一干凈的微量離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管以充分混勻，室溫放置10 min,再在4°C、以13000 r/min的速度離心15min,棄去上清,沉淀即為mRNA提取物,該沉淀加
ImL 75%乙醇，凍存于-70° C，可保存一年，或者在加I mL 75%乙醇后，繼續(xù)在4° C以8000r/min的速度離心10 min,棄去上清,沉淀在超凈臺(tái)中干燥5min,加入I mL DEPC處理水,于-20°C保存,可保存I個(gè)月左右。上述DEPC處理水也是本領(lǐng)域公知試劑，DEPC處理水指在IL蒸餾水中加入DEPC ImL，配制成含O. 1% DEPC的水，猛烈振搖后，在室溫靜置4小時(shí)，然后高壓滅菌，以除去降解DEPC, DEPC可分解為CO2和乙醇。第二步,轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增mRNA 取第一步中mRNA提取物2 μ ^ΙΟ μ 和48 μ 上述TMA混合物I，TMA混合物I中混合有200 nmol/L TMPRSS2 :ERG、PCA3或PSA基因的啟動(dòng)子引物，然后在20。C反應(yīng)30 min ；加入25 μ 上述TMA混合物ΙΙ，ΤΜΑ混合物II中混合有I. 2 mmol/L TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA基因的反向引物，在94 ° C反應(yīng)5 min，冷卻到室溫，靜置5 min后，加入25 μ 1000單位莫洛尼(氏)鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和600單位Τ7 RNA聚合酶混合液，在40° C擴(kuò)展反應(yīng)75 min。第三步，雜交反應(yīng)
用10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 7. O)按照100 μ /孔的量清洗以上固定有標(biāo)記有吖啶酯和生物素的DNA探針的96孔板，并重復(fù)三次。然后將第二步中擴(kuò)增物和15μ1上述雜交液混合，在60 C靜置15min，然后每個(gè)樣品加入75 μ 選擇液，在60 C靜置10 min,最后在每個(gè)樣品中加入100 μ 顯色液,顯色的信號(hào)通過光度計(jì)記錄。第四步，結(jié)果計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)比品由已知拷貝數(shù)的TMPRSS2:ERG、PCA3以及PSA的mRNA的轉(zhuǎn)錄物組成。為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)濃度的PCA3/PSA，或者TMPRSS2:ERG/PSA都有三個(gè)點(diǎn)，然后取平均。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=a+bX
其中y為光度計(jì)讀數(shù)；X為mRNA的拷貝數(shù)；a和b為常數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)品確定。通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到樣品中的PCA3和TMPRSS2:ERG以及PSA相對(duì)于的mRNA的拷貝數(shù)。再分別用PCA3和TMPRSS2:ERG的mRNA拷貝數(shù)值除于PSA的mRNA拷貝數(shù)值，其比值再乘以1000，即為相應(yīng)的PCA3和TMPRSS2:ERG診斷指標(biāo)，通過這兩個(gè)診斷指標(biāo)的數(shù)值可以判斷病人得前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的高低，即
權(quán)利要求
1.一種用于前列腺癌早期診斷的三組引物對(duì)，其特征在于第一組引物對(duì)具有SEQIDN0:1和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；第二組引物對(duì)具有SEQ IDN0:2和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；第三組引物對(duì)具有SEQ IDN0:3和SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，所述三組引物對(duì)通過轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)來檢測(cè)人體體內(nèi)TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表達(dá)水平，以判斷前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
2.一種用于前列腺癌早期診斷的三個(gè)DNA探針，其特征在于所述三個(gè)DNA探針分別具有 SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:9 所示的核苷酸序列，且所述 SEQ IDNO: 7, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列上的*位置接有氨基酸自由基，所述氨基酸自由基上接有發(fā)光基團(tuán)，所述SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列的3’端標(biāo)記有生物素。
3.如權(quán)利要求2所述的用于前列腺癌早期診斷的三個(gè)DNA探針，其特征在于所述發(fā)光基團(tuán)為吖啶酯。
4.如權(quán)利要求3所述的用于前列腺癌早期診斷的三個(gè)DNA探針的制備方法，其特征在于在3’端標(biāo)記有生物素、且具有SEQ IDNO:7,SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列的DNA探針中*位置的氨基酸自由基上接上吖啶酯，具體步驟如下 第一步，將吖啶酯溶于二甲基亞砜； 第二步，在水的參與下，所述溶于二甲基亞砜的吖啶酯與干燥的所述3’端標(biāo)記有生物素、且具有SEQ IDNO:7,SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列的DNA探針在20 45° C、pH6 9條件下反應(yīng)20 60 min，再用賴氨酸中止反應(yīng)； 第三步，在第二步的所述用賴氨酸中止反應(yīng)后的溶液中加入醋酸鈉和糖原，混勻所述醋酸鈉和糖原后，于加入無水乙醇，并在0° C以下反應(yīng)5 miiTlO h，離心除去上清，保留沉淀物； 第四步，所述沉淀物用水溶解后，用反相高效液相色譜純化。
5.一種前列腺癌早期診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有 容器al，容器al中裝有具有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列、用于檢測(cè)TMPRSS2:ERG基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物； 容器a2，容器a2中裝有具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列、用于檢測(cè)TMPRSS2:ERG基因表達(dá)水平的反向引物； 容器bl，容器bl中裝有具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列、用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物； 容器b2，容器b2中裝有具有SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列、用于檢測(cè)PCA3基因表達(dá)水平的反向引物； 容器Cl，容器Cl中裝有具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列、用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的啟動(dòng)子引物； 容器c2，容器c2中裝有具有SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列、用于檢測(cè)PSA基因表達(dá)水平的反向引物； 容器d，容器d中裝有逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的混合液；以及 固相載體，所述固相載體上涂有抗生蛋白鏈菌素，所述抗生蛋白鏈菌素上接有如權(quán)利要求2所述的DNA探針。
6.如權(quán)利要求5所述的前列腺癌早期診斷試劑盒，其特征在于所述固相載體為96孔板。
7.如權(quán)利要求5所述的前列腺癌早期診斷試劑盒，其特征在于所述抗生蛋白鏈菌素上接有如權(quán)利要求3所述的DNA探針。
8.如權(quán)利要求5所述的前列腺癌早期診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括 容器e，容器e中裝有由已知拷貝數(shù)的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA轉(zhuǎn)錄物組成的標(biāo)準(zhǔn)品；和 容器f，容器f中裝有由已知拷貝數(shù)的TMPRSS2:ERG、PCA3或PSA的mRNA轉(zhuǎn)錄物組成的對(duì)比品。
9.如權(quán)利要求5所述的前列腺癌早期診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括 容器g，容器g中裝有mRNA提取液。
10.如權(quán)利要求5所述的前列腺癌早期診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括 容器h，容器h中裝有雜交液； 容器i，容器i中裝有選擇液； 容器j，容器j中裝有顯色液。
全文摘要
本發(fā)明屬免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于前列腺癌早期診斷的三組引物對(duì)、三個(gè)DNA探針和試劑盒。所述三組引物對(duì)分別具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。三個(gè)DNA探針在3’端均標(biāo)記有生物素，并且分別具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，序列中*位置上的氨基酸自由基上接有發(fā)光基團(tuán)。所述前列腺癌早期診斷試劑盒含有上述三組引物對(duì)、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶以及其上涂布有抗生蛋白鏈菌素，且該抗生蛋白鏈菌素上接有上述DNA探針的固相載體。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)人體TMPRSS2:ERG、PCA3、PSA基因的表達(dá)水平，以判斷前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102912030SQ20121044250
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者端鵬, 葉欣, 李博 申請(qǐng)人:端鵬, 葉欣, 李博