專利名稱：檢測水稻粒型的分子標記方法、試劑盒和引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻品種資源特性的檢測技術(shù)，特別涉及檢測水稻粒型基因的分子標記標記方法、試劑盒和引物。
背景技術(shù)：
水稻谷粒內(nèi)、外稃的兩緣相互勾合包被著糙米，在籽粒形成中起著重要的作用，一方面合成同化物，另一方面對籽粒進行塑型，影響稻米粒型、灌漿充實度和千粒重等。通過從水稻花發(fā)育突變體中分離克隆到相關(guān)的基因，以及利用已克隆的植物花發(fā)育基因的保守序列為探針從水稻基因組文庫和CDNA文庫篩選分離到與水稻花發(fā)育有關(guān)的A、B、C、D、E類基因。依據(jù)花器官突變體表型與相關(guān)基因的關(guān)系總結(jié)出調(diào)控單子葉植物花形態(tài)建成遺傳控制的AB⑶E模型假說。發(fā)明內(nèi)容
為了能檢測出水稻粒型性狀的基因型，本發(fā)明的第一個目的是提供用于檢測水稻粒型的特異性分子標記，本發(fā)明的第二個目的是提供采用上述的特異性分子標記檢測水稻粒型的分子標記方法，本發(fā)明的第三個目的是提供采用上述的特異性分子標記檢測水稻粒型的分子標記試劑盒。采用上述的特異性分子標記檢測水稻植株粒型性狀的基因型，具有準確性高，操作簡單的特點。
為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案用于檢測水稻粒型的特異性分子標記，該特異性分子標記具有正向引物和反向引物， 正向引物自5'端至:V端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5' 端至3'端的核苷酸序列為TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案 檢測水稻粒型的分子標記方法，該方法按以下步驟進行提取水稻DNA，采用Caps分子標記mg進行PCR擴增，Caps分子標記mg包括正向引物和反向引物，正向引物自5'端至 3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自Y端至3'端的核苷酸序列為TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG，將PCR產(chǎn)物用Bsrh I酶切后，電泳檢測1)檢測水稻粒型性狀顯性純合基因的特異性酶切片段分別為309bp和488bp；2)檢測水稻粒型性狀隱性純合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，488bp；3)檢測水稻粒型性狀雜合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，309bp，488bp。
作為優(yōu)選，上述提取水稻DNA的方法包括以下步驟1)取新鮮水稻葉片3-5cm放入2.OmL離心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；2)加入500 μ I 的 TPS 抽提液，TPS 抽提液包括 IOOmM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH8. O, IM KCl，滅菌后備用，65°C空氣浴中放置lh，每隔30min顛倒混勻離心管中的沉淀；3)12000rpm離心15min，移上清液約350μ L于新離心管中，加入等體積的異丙醇，放入冰箱 IOmin,再 IlOOOrpm 離心 IOmin ；4)棄上清液,再沉淀，加入Iml70%酒精,8000rpm離心5min ；5)棄上清液，室溫下白色的DNA沉淀風干后溶解于100μ L滅菌ddH20，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 作為優(yōu)選，上述的PCR反應體系如下DNA模板I μ I2.5mM dNTPs 5 μ I 10XK0D buffer 12. 5μ I ΙΟμΜ正向引物 Ιμ ΙΟμΜ反向引物 Ιμ IU/ μ I KOD SI O. 5 μ I H2O4 μ Io
作為優(yōu)選，上述的PCR反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性60sec，65°C退火 60sec，72°C延伸120sec，共34個循環(huán);最后72°C延伸IOmin0
為了實現(xiàn)上述的第三個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案檢測水稻粒型的分子標記試劑盒，該試劑盒包括Caps分子標記mg, Caps分子標記mg包括正向引物和反向引物，正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5 '端至3 '端的核苷酸序列為 TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，只采取一次PCR和酶切就能檢測出粒型性狀的基因型，提高了檢測效率，具有準確性高，操作簡單的特點。


圖1為特異性分子標記mg對“93-11/浙粳月亮型”雜交后F2分離群體的PCR擴增結(jié)果。圖2為PCR產(chǎn)物用沒srb I酶切結(jié)果。圖中，M代表標記(Marker)，93-ll代表水稻品種93-11 ；G代表浙粳月亮型P1代表“93-11/浙粳月亮型”的雜種F1植株；F2代表“93-11/ 浙粳月亮型”的F2植株。
具體實施方式

實施例1用于檢測水稻粒型的特異性分子標記，該特異性分子標記具有正向引物和反向引物， 正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5' 端至3'端的核苷酸序列為TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
實施例2本發(fā)明涉及浙粳月亮型粒型，保藏號CGMCC No. 5554，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏時間為2011年12月31日；分類命名水稻(Orjza saiira );性狀穩(wěn)定。發(fā)明人在研究中將浙粳月亮型穎殼與秈稻品種93-11 (國家水稻中期庫保存號CN20483)配組，構(gòu)建群體， 分析各個株系的基因型。在種植上述93-11與浙粳月亮型穎殼雜交后的F2群體，苗期采用特異性分子標記mg進行水稻粒型基因的檢測。
一、DNA 提取1.取新鮮水稻葉片3-5cm放入2.OmL離心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；2.加入500 μ I 的 TPS 抽提液(IOOmM Tris-HCl，IOmM EDTA, ρΗ8· O, IM KCl，滅菌后備用)，65°C空氣浴中放置lh，每隔30min顛倒混勻離心管中的沉淀；3.12000rpm離心15min，移上清液約350 μ L于新離心管中，加入等體積的異丙醇，放入冰箱 IOmin,再 IlOOOrpm 離心 IOmin ；4.棄上清液，再沉淀，加入Iml70%酒精,8000rpm離心5min ；5.棄上清液，室溫下白色的DNA沉淀風干后溶解于100μ L滅菌ddH20，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 二、PCR 擴增PCR擴增反應在PCR擴增儀上進行。
I PCR反應體系(25 μ I)如下DNA模板I μ IdNTPs (2. 5mM) 5 μ I10XK0D buffer 12. 5μ I mg (正向引物，10 μ Μ) 1μ Img (反向引物，10 μ Μ) I μ IKOD酶(東洋紡公司，IU/ μ I) O. 5 μ IH2O 4 μ I2. PCR反應條件引物mg溫度反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性60sec，65°C退火60sec，72°C延伸120sec，共34個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
三、PCR反應產(chǎn)物檢測將擴增產(chǎn)物，經(jīng)溴化乙錠染色后上樣在1%瓊脂糖凝膠上，電泳，在UVP凝膠成像儀上成像。
在F2分離群體中存在兩種表型的植株，從月亮型粒型表型植株中收獲的種子，只有一種隱性純合的月亮型突變表型植株(aa基因型)，后代不發(fā)生分離，都出現(xiàn)突變表型； 從正常表型植株中收獲的種子，有兩種基因型。一種是顯性純合的正常表型植株(AA基因型)，后代不發(fā)生分離，都出現(xiàn)正常表型；另一種是雜合的植株(Aa基因型)，雖然當代表現(xiàn)為正常表型，但后代發(fā)生分離，出現(xiàn)正常和月亮型粒型兩種表型。
分別對F2分離群體中兩種表型的植株進行檢測，用標記mg擴增后的PCR產(chǎn)物大小為797bp，將PCR產(chǎn)物用Bsrh I酶切后，根據(jù)酶切條帶大小可檢測AA、Aa和aa三種不同的基因型1)檢測水稻粒型性狀顯性純合基因的特異性酶切片段分別為309bp和488bp；2)檢測水稻粒型性狀隱性純合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，488bp；3)檢測水稻粒型性狀雜合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，309bp，488bp。
如圖1所示，F(xiàn)2分離群體用標記mg擴增后PCR產(chǎn)物大小無差異。將PCR產(chǎn)物用 Bsrb I酶切后，結(jié)果如圖2所示，泳道3酶切片段與93-11 —致，說明這一植株的基因型為 AA ;泳道1、2、4、5、6、8、9、10、11、12酶切片段與G —致，這些植株的基因型均為aa ;泳道7 與F1—致，說明這些植株的基因型為Aa。與實際相符。這說明，利用分子標記mg能夠準確檢測水稻植株的粒型基因 型。序列表〈110〉浙江省農(nóng)業(yè)科學院〈120〉檢測水稻粒型的分子標記方法、試劑盒和弓I物 <160>2<210>1 〈211〉 25 〈212〉引物 〈213〉人工合成 〈400〉 IAAGAACTCAC GGGATGATGA ACTGC 25<210>2 〈211〉 25 〈212〉引 物 〈213〉人工合成 〈400〉 2TCTTGTGATT CAGGTTGCAT TACGG 2權(quán)利要求
1.檢測水稻粒型的分子標記方法，其特征在于該方法按以下步驟進行提取水稻DNA，采用Caps分子標記mg進行PCR擴增,Caps分子標記mg包括正向引物和反向引物,正向引物自5'端至3,端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5'端至3,端的核苷酸序列為TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGGJf PCR產(chǎn)物用Bsrh I酶切后，電泳檢測 1)檢測水稻粒型性狀顯性純合基因的特異性酶切片段分別為309bp和488bp； 2)檢測水稻粒型性狀隱性純合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，488bp； 3)檢測水稻粒型性狀雜合基因的特異性酶切片段分別為63bp，241bp，309bp，488bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測水稻粒型的分子標記方法，其特征在于提取水稻DNA的方法包括以下的步驟 1)取新鮮水稻葉片3-5cm放入2.OmL離心管中，加入液氮并用竹筷研磨成粉末；2)加入500 ill 的 TPS 抽提液，TPS 抽提液包括 IOOmM Tris-HCl, IOmM EDTA, pH8. 0, IMKCl，滅菌后備用，65°C空氣浴中放置lh，每隔30min顛倒混勻離心管中的沉淀； 3)12000rpm離心15min，移上清液約350y L于新離心管中，加入等體積的異丙醇，放入冰箱 IOmin,再 IlOOOrpm 離心 IOmin ； 4)棄上清液,再沉淀，加入Iml70%酒精,8000rpm離心5min ； 5)棄上清液，室溫下白色的DNA沉淀風干后溶解于IOOiiL滅菌ddH20，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測水稻粒型的分子標記方法，其特征在于PCR反應體系如下 DNA模板I u I 2.5mM dNTPs 5 U IIOXKOD buffer 12. 5u I IOiiM正向引物 IiU IOiiM反向引物 IiU IU/ul KOD SI 0. 5u I H2O4u I0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測水稻粒型的分子標記方法，其特征在于PCR反應條件為94°C預變性5min，94°C變性60sec，65°C退火60sec，72°C延伸120sec，共34個循環(huán)；最后72°C延伸 lOmin。
5.檢測水稻粒型的分子標記試劑盒，其特征在于該試劑盒包括Caps分子標記mg,Caps分子標記mg包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物，正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
6.用于檢測水稻粒型的特異性分子標記，該特異性分子標記具有正向引物和反向引物，正向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5'端至3'端的核苷酸序列為TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻品種資源特性的檢測技術(shù)，特別涉及檢測水稻粒型基因的分子標記標記方法、試劑盒和引物。用于檢測水稻粒型的特異性分子標記，該特異性分子標記具有正向引物和反向引物，正向引物自5′端至3′端的核苷酸序列為AAGAACTCACGGGATGATGAACTGC，反向引物自5′端至3′端的核苷酸序列為TCTTGTGATTCAGGTTGCATTACGG。本發(fā)明只采取一次PCR和酶切就能檢測出粒型性狀的基因型，提高了檢測效率，具有準確性高，操作簡單的特點。
文檔編號C12Q1/68GK102994635SQ20121044324
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者張小明, 周崖, 葉勝海, 金慶生, 吳慶 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院