專利名稱：用于hpv檢測的陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多重核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)，尤其涉及一種陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒HPV是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是球形DNA病毒。分高危險型和低危型，低危型HPV如HPV-6，11，13，32，34，40，42，43，44，53，54等與感染生殖器、肛門、口咽部、食道黏膜，特別是HPV6，11，發(fā)生率最為廣泛。高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是引起宮頸癌的主要原因，而其中人乳頭瘤病毒16型、18型是與宮頸癌發(fā)生最密切、致病風(fēng)險最高的2種高危型人乳頭瘤病毒，至少占宮頸癌的40%以上。及時快速地區(qū)分不同類型的重要HPV對于疾病的預(yù)防和治療具有至關(guān)重要的作用，無論對個人還是社會都具有重大的意義。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)最早由日本科學(xué)家發(fā)明，該技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、反應(yīng)速度快、反應(yīng)結(jié)果可以直接肉眼判定等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過近10年的學(xué)術(shù)研究，現(xiàn)以各種檢測試劑盒的形式進(jìn)入市場。但是LAMP反應(yīng)的“等溫模式”和其復(fù)雜的核酸探針使其很難在同一體系中實現(xiàn)一個樣品中多種目標(biāo)物的同時檢測，即多重檢測。微流控技術(shù)是在微米尺度結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積流體的技術(shù)與科學(xué)，在該尺度下大幅度增強(qiáng)的層流效應(yīng)、表面張力效應(yīng)、毛細(xì)效應(yīng)、熱傳導(dǎo)效應(yīng)及擴(kuò)散效應(yīng)，使許多物理和化學(xué)過程發(fā)生了質(zhì)的變化，是當(dāng)前正在急速發(fā)展的高新技術(shù)和科技前沿領(lǐng)域之一，是未來生命科學(xué)、化學(xué)與信息科學(xué)發(fā)展的重要技術(shù)平臺，該技術(shù)的應(yīng)用可以實現(xiàn)LAMP反應(yīng)的多重檢測模式
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種用于高危HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片，它包括毛細(xì)管通道、連接管道、加樣孔、若干擴(kuò)增池和若干探針注入孔，所述加樣孔與毛細(xì)管通道相通，所有擴(kuò)增池的一端均通過連接管道與毛細(xì)管通道連通，另一端各與一探針注入孔連通；其中，一個擴(kuò)增池中置有陽性探針，該陽性探針具有SEQ ID N0.25- SEQID N0.28所示的DNA序列，另一個擴(kuò)增池中置有陰性探針，所述陰性探針為水，所述陽性探針和陰性探針用以提高檢測結(jié)果的可信度；其余擴(kuò)增池I中分別包被上針對目標(biāo)核酸片段的特異性探針；所述針對目標(biāo)核酸片段的特異性探針由針對HPV-6，11的具有SEQ IDN0.1-SEQ ID N0.12 所示的 DNA 序列的探針、針對 HPV-16 的具有 SEQ ID N0.13-SEQ IDN0.18所示的DNA序列的探針和針對HPV-18的具有SEQ ID N0.19- SEQ ID N0.24所示的DNA序列的探針中的一種或多種組成。進(jìn)一步地，所述連接管道呈四棱臺狀，橫截面大的一端與擴(kuò)增池相連，橫截面小的一端與毛細(xì)管通道相連，使微流體從毛細(xì)管通道平穩(wěn)均勻的流入擴(kuò)增池，且不產(chǎn)生氣泡。所述擴(kuò)增池空間尺寸根據(jù)其體積需求，其長度可以隨需求任意改變，寬度和深度的空間尺寸一般￡1_ ;毛細(xì)管通道的寬度和深度一般￡0.3mm都可以。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片可應(yīng)用于快速合并檢測HPV6型和HPVll型的核酸，分型檢測HPV16型和HPV18型的核酸。


圖1是陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片的結(jié)構(gòu)示意 圖中，擴(kuò)增池1、連接管道2、毛細(xì)管通道3、加樣孔4、探針注入孔5。
具體實施例方式如圖1所示， 本發(fā)明陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片包括毛細(xì)管通道3、加樣孔4、若干擴(kuò)增池I和若干探針注入孔5，加樣孔4與毛細(xì)管通道3相通，所有擴(kuò)增池I的一端均通過連接管道2與毛細(xì)管通道3連通，另一端各與一探針注入孔5連通。一個擴(kuò)增池I中置有陽性探針，該陽性探針具有SEQ ID N0.25- SEQ ID N0.28所示的DNA序列，一個擴(kuò)增池中置有陰性探針，所述陰性探針為水，陽性探針和陰性探針用以提高檢測結(jié)果的可信度。除上述分別置有陽性探針和陰性探針的擴(kuò)增池I外，其余擴(kuò)增池I中分別包被上針對目標(biāo)核酸片段的特異性探針。如針對HPV-6，11的具有SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.12 所示的 DNA 序列的探針，針對 HPV-16 的具有 SEQ ID N0.13- SEQ ID N0.18所示的DNA序列的探針，針對HPV-18的具有SEQ ID N0.19- SEQ ID N0.24所示的DNA序列的探針。擴(kuò)增池I的數(shù)量可以根據(jù)目標(biāo)物檢測的需求設(shè)計，如三重、四重、五重或十重等，不受限制。毛細(xì)管通道3主要是利用其物理限域(低質(zhì)量傳遞系數(shù))的特性限制每個擴(kuò)增池中的特異性核酸探針和反應(yīng)產(chǎn)物在不同池中的交叉污染，同時也利用毛細(xì)管的拉力便于樣品和反應(yīng)液的進(jìn)樣。擴(kuò)增池I和毛細(xì)管通道3之間用連接管道2連通，連接管道2呈四棱臺狀，橫截面大的一端與擴(kuò)增池I相連，橫截面小的一端與毛細(xì)管通道3相連，使微流體從毛細(xì)管通道3平穩(wěn)均勻的流入擴(kuò)增池4，且不產(chǎn)生氣泡。擴(kuò)增池空間尺寸根據(jù)其體積需求，其長度可以隨需求任意改變，寬度和深度的空間尺寸一般￡1_ ;毛細(xì)管通道的寬度和深度一般￡0.3_都可以；連接管道2的空間尺寸根據(jù)擴(kuò)增池I和毛細(xì)管通道3的尺寸來定，主要起到一種均勻連接效果。本發(fā)明陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片通過以下步驟制備得到:
1、芯片模板的制作:利用微加工技術(shù)(MEMS、光刻等)的方法制作芯片模板，模板結(jié)構(gòu)與上述陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片相對應(yīng)，模板材料可以為硅材料。2、芯片澆注，脫氣和固化:將二甲基硅氧烷和固化劑按質(zhì)量比5-12:1混合均勻后，小心傾倒于芯片模板上，真空脫氣30 min后80°C固化2h，所述固化劑是烷氧基硅烷，開加樣孔4和探針注入孔5后，通過等離子處理后，與玻片永久鍵合。3、功能化芯片:將目標(biāo)核酸對應(yīng)的探針，陽性探針和陰性探針分別通過冷凍干燥技術(shù)包被于芯片對應(yīng)的擴(kuò)增池I中，完成功能化芯片，該芯片可以在4°C左右長期保存。實施例我們利用此陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增技術(shù)平臺，開發(fā)了一款五通道的人乳頭瘤HPV病毒6/11，16，18分型的陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片。在此五槽道陣列式微流控恒溫擴(kuò)增芯片中，我們在I，2，3擴(kuò)增池中包被上針對四種重要HPV目的基因的特異性探針(Probe 6+11，Probe 16和Probe 18)，在擴(kuò)增池4中包被陽性內(nèi)參核酸探針，擴(kuò)增池5中作為陰性內(nèi)參。我們通入2 μ L樣品，再滴入 30 uL LAMP反應(yīng)液，封閉反應(yīng)孔，在63°C下恒溫反應(yīng)I h (LAMP反應(yīng)液成分見表I)。在包被有目標(biāo)物探針的擴(kuò)增池中出現(xiàn)了LAMP信號的肉眼可見的綠色。我們分別用HPV樣品對芯片進(jìn)行驗證。結(jié)果如下:對于樣品HPV6/11, HPV 16和HPV18，在相應(yīng)探針包被的擴(kuò)增池中出現(xiàn)了綠色擴(kuò)增信號，而陰性內(nèi)參對照池中沒有擴(kuò)增信號的出現(xiàn)，結(jié)果符合預(yù)期，且沒有出現(xiàn)擴(kuò)增池之間的交叉污染，檢測結(jié)果可靠。
表I LAMP反應(yīng)液成分
權(quán)利要求
1.一種用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片，其特征在于，它包括毛細(xì)管通道(3)、加樣孔(4)、若干擴(kuò)增池(I)和若干探針注入孔(5)，所述加樣孔(4)與毛細(xì)管通道(3)相通，所有擴(kuò)增池(I)的一端均通過連接管道(2)與毛細(xì)管通道(3)連通，另一端各與一探針注入孔(5)連通；其中，一個擴(kuò)增池(I)中置有陽性探針，該陽性探針具有SEQ IDN0.25- SEQ ID N0.28所示的DNA序列，另一個擴(kuò)增池中置有陰性探針，所述陰性探針為水，所述陽性探針和陰性探針用以提高檢測結(jié)果的可信度；其余擴(kuò)增池I中分別包被上針對目標(biāo)核酸片段的特異性探針；所述針對目標(biāo)核酸片段的特異性探針為針對HPV-6，11的具有SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.12所示的DNA序列的探針、針對HPV-16 的具有 SEQ ID N0.13-SEQID N0.18所示的DNA序列的探針或針對HPV-18的具有SEQ ID N0.19- SEQ ID N0.24所示的DNA序列的探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片，其特征在于，所述連接管道(2)呈四棱臺狀，橫截面大的一端與擴(kuò)增池(I)相連，橫截面小的一端與毛細(xì)管通道(3)相連，使微流體從毛細(xì)管通道(3)平穩(wěn)均勻的流入擴(kuò)增池(I )，且不產(chǎn)生氣泡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片，其特征在于，所述擴(kuò)增池空間尺寸根據(jù)其體積需求，其長度可以隨需求任意改變，寬度和深度的空間尺寸一般￡1_ ;毛細(xì)管通道的寬度和 深度一般￡0.3_都可以。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于HPV檢測的陣列式多重微流體恒溫擴(kuò)增芯片，該芯片以聚二甲基硅氧烷為材料，利用微加工技術(shù)，通過澆注法制備而成。該芯片基本結(jié)構(gòu)由三部分組成擴(kuò)增池，連接管道和毛細(xì)管通道。空間陣列有序排列的系列擴(kuò)增池通過冷凍干燥技術(shù)包被上核酸探針，利用擴(kuò)增信號的空間區(qū)分來實現(xiàn)一個樣品中多重核酸目標(biāo)物的同時檢測；毛細(xì)管通道通過毛細(xì)拉力實現(xiàn)反應(yīng)液和樣品的注入，同時利用其自身的低質(zhì)量傳遞系數(shù)有效阻止核酸探針和擴(kuò)增產(chǎn)物及信號在不同擴(kuò)增池間的相互影響；擴(kuò)增池和毛細(xì)管通道之間用連接管道連通，使流體平穩(wěn)均勻的流入擴(kuò)增池。該芯片制作簡單，操作方便，為LAMP方法實現(xiàn)臨床多種病原體同時檢測提供了有效方案。
文檔編號C12Q1/70GK103114033SQ201210443488
公開日2013年5月22日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者方雪恩, 徐凌佳, 陳旭 申請人:杭州騰越生物科技有限公司