專利名稱：一種檢測CLLU1基因mRNA表達量的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域的熒光定量PCR技術，具體涉及一種檢測CLLUl基因mRNA表達量的試劑盒。
背景技術：
慢性淋巴細胞白血病(Thechronic lymphocytic leukemia upregulated, CLL)是一種成熟B淋巴細胞克隆增殖性腫瘤，以淋巴細胞在外周血、骨髓、脾臟和淋巴結聚集為特征。CLL是成人最常見白血病之一，約占所有白血病的四分之一。CLL在西方國家發(fā)病率較高，男性發(fā)病率可達3/10萬人口以上，女性也接近2/10萬人口，但在我國、日本及東南亞國家發(fā)病率較低。CLL是一種成年人的疾病，但是，在極少數情況下，它可以發(fā)生在青少年中，偶見于兒童。新診斷的CLL患者大多數(>75%)為50歲以上，多數是男性。CLL患者是一 個異質性群體，在發(fā)病的形式、疾病進展、治療反應和生存期方面具有明顯的個體差異。近年來Buhl等人通過差異顯示的方法發(fā)現了位于12q22區(qū)域的新基因慢性淋巴細胞白血病上調基因I (CLL upregulated gene 1，CLLU1)在CLL細胞中呈特異性表達。CLLUl基因被認為是最新的CLL的預后指標，該基因對于CLL顯示出具有特異性，CLLUl基因轉錄產物僅見于CLL細胞中，CLL細胞的CLLUl基因表現出高度的表達水平。目前，對于CLLUl基因的具體功能尚不完全清楚，經研究表明，這種基因的高度表達與治療時間長短以及70歲以下的患者總生存期低密切相關，且CLLUl基因表達水平與已知CLL不良預后因素有密切關系。CLLUl基因表達可以顯著提高其他技術，如FISH (熒光原位雜交)、IgVH突變分析、⑶38和ZAP-70，特別是IgVH突變，來評估CLL患者預后的價值。目前可用探針雜交法、質譜法、定性PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應)法、基因測序法和流式細胞術等方法對CLLUl基因定量的表達進行檢測。探針雜交法假陽性率較高；基因芯片法成本高、制備方法繁瑣；基因測序法的敏感性和特異性高，但價格比較昂貴，而且操作繁瑣，耗時長；流式細胞術涉及多環(huán)節(jié)，操作復雜，分析報告帶有一定的主觀性；定性PCR法具有特異性強和靈敏度高等優(yōu)點。但實時熒光定量PCR技術實現了 PCR從定性到真正意義的定量的飛躍，為人類疾病基因的定量檢測提供了一個行之有效的檢測工具，與普通PCR相比具有特異性增強、靈敏度提高和檢測快速、降低了污染等特點，但目前尚未有實時熒光定量PCR方法檢測慢性淋巴細胞白血病中的CLLUl基因的相關報道。

發(fā)明內容
為了解決現有技術的問題，本發(fā)明實施例提供了一種檢測CLLUl基因mRNA表達量的試劑盒。所述技術方案如下本發(fā)明所提供的檢測AMLl-ETO融合基因mRNA表達量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括CLLUI基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中
CLLUl基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；CLLUl基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；CLLUl基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；ABL基因Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合 液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。進一步地，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、內部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQIDNO:9所示；內部陽性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。進一步地，所述CLLUl基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。具體地，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有CLLUl基因的總RNA樣品。具體地，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/L MgCl2 4uL,10X逆轉錄酶緩沖液 L，IOmmoI/L dNTP 2 y L，RNA 酶抑制劑 0. 5 y L，Oligo (dT) 150. 5 y g，AMV逆轉錄酶 I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 ii L。具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應體系終濃度表示)為1X的PCR預混合液(原液為 2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、
0.2U/ ii L的Taq酶和0. 01-0. 05U/ ii L的UNG酶以及無RNase去離子水。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點和效果如下(I)敏感性高可重復敏感度為0. 01%,即10000個細胞中有一個含CLLUl基因就可以被檢測出。(2)特異性強使用特異性探針對定量分子進行識別，準確性高。同時，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴增和檢測可以在同一管內檢測，不需要開蓋，不易被污染；同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔心放射性污染。(4)全程監(jiān)控本發(fā)明實施例提供的試劑盒引入了內部陽性控制質量控制體系，對檢測過程進行全程質量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小時完成。本發(fā)明的試劑盒能快速、準確、定量檢測CLLUl基因mRNA水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發(fā)生，用于慢性淋巴細胞白血病的治療及預后評價，為慢性淋巴細胞白血病的制定治療方案及預后提供了重要的檢測手段。


為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖IA是本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖；圖IB是由本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內部陽性控制序列標準品的熒光曲線圖得到的標準曲線圖；圖2A是本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品的熒光曲線圖；
圖2B是由本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增
I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標準品熒光曲線圖得到的標準曲線圖。
具體實施例方式為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面結合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。實施例I.試劑盒的制備I、特異性的引物和熒光探針的設計根據基因序列(ABL基因序列和CLLUl基因序列來源于美國國家生物技術信息中心核酸數據庫，其中ABL基因ID分別為25，參考序列號為NM_005157.4;AML1基因ID分別為574028，參考序列號為NC_000012. 11)分別設計對上述各基因序列特異的引物和熒光探針。2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分本發(fā)明試劑盒組成如下①RNA 提取試劑Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產品貨號15596_026/100ml)，每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑快速提取慢性淋巴細胞白血病患者骨髓組織RNA。②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，產品貨號K1622):25mmol/LMgCl2 4u L, IOX 逆轉錄酶緩沖液 2u L, I Ommo I/L dNTP 2 u L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)0. 5 u L, Oligo (dT) 15 0. 5 u g, AMV逆轉錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積 11 U L0③引物、探針和標準品包括CLLUl基因引物、內參基因ABL弓丨物、內部陽性控制序列引物及與引物對應的Taqman熒光探針，具體如下CLLUl基因上游引物序列為5’ -GGCTTGTTTTGAGGATGTTCAAC-3’(序列表中序列
I);CLLUl基因下游引物序列為5’-TCTGCGGCAGGTCTGTAAATAG-3，(序列表中序列2);CLLUl 基因 Taqman 熒光探針序列為FAM 5 ’-AATGCTCCTITCAITCC-3 ’ TAMRA (序列表中序列3)；
內部陽性控制序列為5’ GGCUUGUUUUGAGGAUGUACAUCAAAUGCUGCUAUCAUUCCUCUUAUUACAGACCUGCCGCAGA-3，(序列表中序列 7)；內部陽性控制序列上游引物序列為5’-GGCTTGTTTTGAGGATGTACATC-3’(序列表中序列8)；內部陽性控制序列下游引物序列為5’ -TCTGCGGCAGGTCTGTAATAAG-3’(序列表中序列9)；內部陽性控制序列Taqman 熒光探針TET 5’ -AATGCTGCTATCAITCC-3’ TAMRA (序列表中序列10)。ABL 基因序列為5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCC AAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL基因上游引物序列為5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4)；ABL基因下游引物序列為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 熒光探針序列為FAM 5’-TGGTGTGAAGCCC-3’TAMRA (序列表中序列6)。其中，內部陽性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的CLLUl基因序列和一部分人工合成序列；內部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標準品。上述引物序列、控制序列、基因序列、Taqman熒光探針序列均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。④陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有CLLUl基因的總RNA樣品為陽性對照，采用上述實施例I中提供的本發(fā)明試劑盒組成①RNA提取試劑=Trizol試劑(Invitrogen公司，產品貨號15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑的比例，快速提取已經確診的含有CLLUl基因的慢性淋巴細胞白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽性對照。⑤CLLUl基因熒光定量PCR混合液由熒光定量PCR混合液和檢測CLLUl基因的引物、探針組成1X的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212, 2XPCR Premix)、
2.5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/u L 的 Taq 酶和0. 01-0. 05U/ ii L的UNG酶、0. 25pmol/y L的CLLUl基因上游引物(序列表中序列I)、
0.25pmol/ ii L的CLLUl基因下游引物(序列表中序列2)、0. 3pmol/ ii L的CLLUl基因Taqman熒光探針(序列表中序列3)、0. 25pmol/uL的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8),0. 25pmol/uL的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/uL的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。通常取1-2 U L的模板(包括被測樣品RNA反轉錄合成的cDNA和內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA),其余為無RNase去離子水,反應總體積通常為20 u L。⑥ABL基因熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測ABL內參基因的引物、探針組成=IX的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/u L 的 Taq 酶和0. 01-0. 05U/ u L的UNG酶、0. 25pmol/u L的ABL內參基因上游引物(序列表中序列4)、
0.25pmol/ ii L的ABL內參基因下游引物(序列表中序列5)、0. 3pmol/ ii L的ABL基因Taqman熒光探針(序列表中序列6)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。檢測時，加A ABL基因標準品模板2 ii L,反應總體積通常為20 ii L。⑦內部陽性控制序列熒光定量PCR反應液由熒光定量PCR混合液和檢測內部陽性控制序列的引物、探針組成=IX的PCR預混合液(Qiagen公司，產品貨號=210212,2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的Taq酶和0. 01-0. 05U/ U L的UNG酶、0. 25pmol/uL的內部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/u L的內部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/y L的內部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應體系的終濃度)。檢測時，通常取1-2 U L的模板(內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA)， 其余為無RNase去離子水,反應總體積通常為20 u L。3、PCR擴增程序的設定在Iightcycler儀器上先經過50°C 10s, 95°C IOmin,然后再經過95°C 15s，60°C lmin，共40個循環(huán)。實施例2.用實施例I制備的試劑盒檢測CLLUl基因mRNA的表達量以檢測30例慢性淋巴細胞白血病患者骨髓組織標本結果為例。用實施例I提供的本發(fā)明的試劑盒檢測CLLUl基因mRNA表達量的檢測流程為首先根據基因序列設計特異性的引物和熒光探針。其次獲取臨床慢性淋巴細胞白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進行逆轉錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制ABL內參基因和內部陽性控制序列的熒光定量PCR反應液，將內部陽性控制序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內部陽性控制序列標準品的標準曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標準品標準曲線(如圖2A和圖2B所示),然后再配制CLLUl基因熒光定量PCR反應液，進行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數據分析系統(tǒng)中讀出CT值結果。PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進行檢測，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，分別計算CLLUl基因及ABL基因的Ct值，兩者之差即為A Ct值。最后，熒光定量PCR結果采用軟件分析，并標化計算樣本數據。具體步驟如下①慢性淋巴細胞白血病患者骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提慢性淋巴細胞白血病患者骨髓組織樣品的總RNA。提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算RNA的純度與濃度，用0. 1%DEPC處理的水調節(jié)抽提的各樣品RNA至相同濃度。②反轉錄合成cDNA :取2 ii L上述RNA提取液，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4uL,10X逆轉錄酶緩沖液 2iiL，10mmol/L dNTPs 2 y L，RNA 酶抑制劑 0. 5 y L，Oligo (dT) 15 0.5iig 和AMV逆轉錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 ii L,于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應，合成cDNA第一鏈。反應結束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉錄酶，加20 y L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I ii L濃度為2 U g/ml內部陽性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70°C保溫IOmin,隨后加入實施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24ii L，IOX 逆轉錄酶緩沖液 L，10mmol/L dNTPs 2 y L，RNA 酶抑制劑 0. 5 y L，Oligo (dT) 15 0. 5 ii g和AMV逆轉錄酶I. 5U，補加無RNase去離子水至總體積20 y L，于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應,合成cDNA。反應結束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉錄酶，加20 ii L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I ii L濃度為2 U g/ml的陽性對照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4 u L, IOX逆轉錄酶緩沖液 2u L, IOmmoI/L dNTPs 2 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 u L, Oligo (dT) 15 0. 5 y g 和 AMV逆轉錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 ii L,于42°C保溫15min,進行逆轉錄反應，合成cDNA。反應結束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉錄酶，加20 y L無菌水混勻置冰箱-20°C保存。③將內部陽性控制基因序列標準品和ABL標準品分別稀釋至拷貝數/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實施例I提供的內部陽性控制序列和ABL內參基因的熒光定量PCR反應液，分別制作內部陽性控制序列標準品標準曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標準品標準曲線(如圖2A和圖2B所示)。④CLLUl基因熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20iiL:含IXPCR預混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2 XPCR Premix) 10. Ou L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，CLLUl 基因上游引物終濃度0. 2mol/L、CLLUl基因下游引物終濃度0. 2 y mol/L, CLLUl基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 u mol/L,被測樣品RNA反轉錄合成的cDNAl. 0 u L，同時加入內部陽性控制序列上游引物終濃度為0. 2 y mol/L、內部陽性控制序列下游引物終濃度為0. 2mol/L、內部陽性控制序列Taqman熒光探針濃度終濃度為0. 3 U mol/L和終濃度為0. 2 U mol/L的內部陽性控制序列RNA反轉錄合成的cDNA (②中反轉錄合成的cDNA)，加入超純水至總體積20 ii L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后950C 15s,60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑤ABL內參基因熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 ii L :含2XPCR混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix) 10. Ou L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，ABL 基因上、下游引物終濃度均為0. 2 ii mol/L, ABL基因的Taqman熒光探針終濃度0. 2 y mol/L, ABL基因cDNAl. OuL,加入無RNase去離子水補至總體積20 y L。在Iightcycler突光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin預變性，然后95°C 15s, 60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑥陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴增PCR反應體系為20 ii L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix)10. 0 u L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，CLLUl 基因上、下游引物終濃度均為0. 2 ii mol/L, CLLUl基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 ii mol/L,陽性對照RNA反轉錄合成的cDNA LOuL或者陰性對照去離子水I. 0 y L，加入無RNase去離子水補至總體積20 ii L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應擴增條件為95°C IOmin
預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。⑦數據收集處理和分析PCR擴增結束后，首先分析內部陽性控制序列擴增結果，
如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進行檢測。
當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，得出CLLUl
基因相對于ABL內參基因的相對表達量后再進行統(tǒng)計分析，以比值大于或等于0. 0001為陽
性，小于0. 0001為陰性(具體參見表I)表I為熒光定量PCR分析基因CLLUl在慢性淋巴細胞白血病中的表達
Icllui 模板 Iabl 模板 Icllui/abl
慢性淋巴細胞白血病~ 1443562299888413~ 0. 00481
慢性淋巴細胞白血病~43065213277622201 0. 15512
慢性淋巴細胞白血病~46781199256600473~0. 18231
慢性淋巴細胞白血病~ 29783451309114921 0. 09635
慢性淋巴細胞白血病~ 9957811300199203~ 0. 03317
慢性淋巴細胞白血病~43007892336098231 0. 12796
慢性淋巴細胞白血病~40776245308799237~0. 13205
慢性淋巴細胞白血病~ 98764555210834577~ 0. 46845
慢性淋巴細胞白血病~ 21873341308067623~ 0. 07100
慢性淋巴細胞白血病~44907633289993310~0. 15486
慢性淋巴細胞白血病~ 31455376094234~ 0. 00008
慢性淋巴細胞白血病~ 31056783401843447~ 0. 07729
慢性淋巴細胞白血病~ 28374303741563~ 0. 00009
慢性淋巴細胞白血病~ 259234330972300~ 0. 00078
慢性淋巴細胞白血病~ 21922311298993~ 0. 00007
慢性淋巴細胞白血病~ 3476814318999034~ 0. 01090
慢性淋巴細胞白血病~ 9856538301787623~ 0. 0326權利要求
1.一種檢測CLLUl基因mRNA表達量的試劑盒，包含檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括CLLUl基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中 CLLUl基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所不； CLLUl基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所不； CLLUl基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、內部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內部陽性控制序列如序列表中SEQIDN0:7所示；內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；內部陽性控制序列的Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述CLLUl基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
4.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有CLLUl基因的總RNA樣品。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/LMgCl2 4μ L，IOX 逆轉錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 0. 5 μ g, AMV逆轉錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 μ L。
7.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的PCR 預混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測CLLU1基因mRNA表達量的試劑盒，屬于生物技術領域，所述試劑盒包含檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括CLLU1基因引物、內參基因ABL引物及Taqman熒光探針。CLLU1基因的高度表達與慢性淋巴細胞白血病治療時間長短以及患者總生存期低密切相關，且CLLU1基因的表達水平與已知慢性淋巴細胞白血病不良預后因素有密切關系。采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR技術檢測CLLU1基因mRNA水平，其檢測結果的特異性和敏感度均顯著提高。本發(fā)明實施例提供的試劑盒為預測慢性淋巴細胞白血病的預后以及化療方案的確定提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術。
文檔編號C12Q1/68GK102965432SQ20121044362
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權日2012年9月29日
發(fā)明者李艷, 童永清 申請人:李艷, 童永清