專利名稱：太空環(huán)境下的高效重組人干擾素α1b工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及生產(chǎn)重組人干擾素a Ib的工程菌，其制備的產(chǎn)物可廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療。
背景技術(shù)：
生物工程菌菌種傳統(tǒng)的誘變處理方法主要包括以紫外線、X射線、Y射線、激光等作為誘變介質(zhì)的物理誘變方法和以堿基類似物、烷化劑甲基磺酸乙酸等為誘變介質(zhì)的化學(xué)誘變方法，及以噬菌體、轉(zhuǎn)座子為誘變介質(zhì)的生物誘變方法。通過各種誘變手段改變菌體的遺傳性狀后，如何從數(shù)量龐大的菌體族群中篩選到特異性目標(biāo)菌種，是育種上最重要也是最耗時費力的工作，篩選在一定程度上是決定菌種選育效率的關(guān)鍵步驟。在菌種選育中常用的隨機篩選法是逐個檢查、測定經(jīng)誘變處理后的存活菌株的目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量或其他性狀。為加快篩選速度而采用諸如平皿快速檢測法、形態(tài)變異的利用、計算機技術(shù)的應(yīng)用等多種·方法，但是這些方法工作量大、周期長、隨機性大、成本高。隨著航天技術(shù)的發(fā)展，空間誘變?yōu)榫N改良提供了新的手段，對于篩選得到更多高效菌種具有獨特的優(yōu)勢?？臻g生物制藥是當(dāng)代空間技術(shù)發(fā)展的產(chǎn)物。其基本原理是利用空間環(huán)境使相對呈漂浮伸展?fàn)顟B(tài)的生物染色體受到外界因素的沖擊，引起堿基的缺失、置換或插入(如引起生物DNA大分子斷裂，使雙螺旋中的氫鍵斷裂，或斷裂后再交叉聯(lián)接，或促使堿基降解)，從而改變基因內(nèi)部原有的堿基及排列順序，引起表型發(fā)生改變，產(chǎn)生新的遺傳變異，返回后再經(jīng)地面篩選，培養(yǎng)出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的生物新品種、新品系和效價高、品質(zhì)優(yōu)的生物制劑種子。重組人干擾素是一種常用的藥物，在臨床上應(yīng)用十分廣泛。干擾素具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增殖以及提高免疫功能等作用。它與細胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，從而抑制病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制；可通過調(diào)節(jié)免疫功能增強巨噬細胞、淋巴細胞對靶細胞的特異細胞毒作用，有效地遏制病毒侵襲和感染的發(fā)生；增強自然殺傷細胞活性，抑制腫瘤細胞生長，清除早期惡變細胞等。因此，重組人干擾素可用于治療某些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、帶狀皰疹、尖銳濕疣等。也可以用于治療某些腫瘤，如毛細胞性白血病、惡性黑色素瘤、腎細胞癌、喉乳頭狀瘤、卵巢癌等。目前市場上的重組人干擾素價格還相對比較貴，必然增加患者就醫(yī)的負擔(dān)，如果提高生物工程菌的產(chǎn)能，其價格也會相應(yīng)便宜，對于增強企業(yè)的競爭力和惠及患者，有著重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效重組人干擾素a Ib工程菌，提高了生物工程菌的產(chǎn)能，降低其生產(chǎn)成本。本發(fā)明提供的高效重組人干擾素a Ib生物工程菌菌株，其保藏號為CGMCCNO. 6632。所述的一種高效重組人干擾素a Ib工程菌菌株，電泳結(jié)果顯示經(jīng)過30°C誘導(dǎo)的該菌株目的蛋白的純度與對照菌株的比較SDS非還原條件下為1. 28倍，SDS還原條件下為1. 37倍，SDS+Urea非還原條件為1. 35倍，SDS+Urea還原條件為1. 66倍。
具體實施例方式下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。重組人干擾素a Ib菌株經(jīng)過神州八號搭載，2011年11月I日從地球出發(fā)，11月17日返回地面，共計空間飛行398小時，1100萬公里。對返回地面的空間誘導(dǎo)后的重組人干擾素a Ib菌株進行篩選，獲得6株太空環(huán)境下較高表達的重組人干擾素a Ib生物工程菌菌株，經(jīng)實驗驗證最終確定有5株正向突變菌種的產(chǎn)生。具體實施實例一重組人干擾素a Ib空間環(huán)境菌種的分離空間環(huán)境育種流程平板分離一抗性平板初篩一試管復(fù)篩一誘導(dǎo)分析一第一輪表達篩選一第二輪表達篩選一獲取高產(chǎn)菌株(I).抗性平板初篩結(jié)果取250 μ I IFNa lb_2LlA菌液接種于裝有750 μ I生理鹽水的試管中，混勻；再取100 μ I稀釋后的菌液接種于裝有900 μ I生理鹽水的試管中，依次稀釋至第5管，取100 μ I涂布于LB平板，37°C靜止培養(yǎng)12-20hr。挑取300個單克隆，分別接種六塊LB-Amp和LB平板。同時對應(yīng)在無抗性培養(yǎng)基上對照接種。37°C靜止培養(yǎng)5-7h。結(jié)果顯示在抗性和非抗性平板均生長的陽性克隆為221株，占73. 7% ;僅在LB平板生長的陰性克隆數(shù)(抗性丟失)79 株，占 26. 3%。(2).第一輪電泳結(jié)果分析對抗性平板初篩結(jié)果陽性克隆中編號在前的144株(克隆號I至194)進行試管復(fù)篩和誘導(dǎo)表達后，再進行電泳檢測和軟件分析。根據(jù)IFNa Ib理論分子量19. 4KD，以及以往經(jīng)驗，按照Ml或者M2的分子量進行計算，以軟件分析IFNa Ib條帶的灰度及純度，其中以灰度代表目的蛋白的總量，總灰度代表菌體總蛋白的量，純度代表目的蛋白占菌體總蛋白的比例。選取每次電泳15個克隆中灰度或純度最高的克隆用于下一輪檢測，灰度及純度最大值與次大值所對應(yīng)的克隆號如表1，其中37、64、93是重復(fù)出現(xiàn)，合并后為26個克隆。電泳圖見

圖1。表I第一輪電泳灰度及純度最大值與次大值所對應(yīng)的克隆號
權(quán)利要求
1.一種太空環(huán)境下的高效重組人干擾素a Ib工程菌菌株，其保藏號為CGMCCNO. 6632。(填寫正確的保藏號)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效重組人干擾素aIb工程菌菌株，其特征在于該菌株在經(jīng)過30°C誘導(dǎo)后目的蛋白的純度與對照菌株的比較為SDS非還原條件下為1. 28倍，SDS還原條件下為1. 37倍，SDS+Urea非還原條件為1. 35倍，SDS+Urea還原條件為1. 66倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及太空環(huán)境中的一種高效重組人干擾素α1b工程菌菌株。對重組人干擾素α1b空間搭載菌種進行平板分離、抗性平板初篩和試管復(fù)篩，然后進行誘導(dǎo)表達，再通過兩輪SDS-PAGE分析獲取高產(chǎn)菌株。將獲得的太空環(huán)境下較高表達的重組人干擾素α1b基因工程菌菌株和原始菌株分別在30℃和37℃溫度下誘導(dǎo)表達并進行比較，確定了正向突變菌株(克隆191)的產(chǎn)生。此種高效重組人干擾素α1b工程菌菌株的成功制備有利于干擾素的工業(yè)生產(chǎn)，造福人類健康。
文檔編號C12N1/21GK102994438SQ20121044464
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者劉長庭, 劉金毅, 王雅娟, 徐晨, 方向群, 王俊鋒, 劉桂東, 郭英華, 常德, 陸小冬 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院, 北京三元基因工程有限公司