專利名稱：一種蛋白酶生產工藝的制作方法
一種蛋白酶生產工藝技術領域
本發(fā)明屬于酶生產技術領域，具體涉及一種利用地衣芽孢桿菌來生產蛋白酶的工藝。
背景技術：
目前，國內常采用技術水平較落后的固體發(fā)酵法來生產蛋白酶，其存在勞動強度大，生產環(huán)境條件差，染菌率高等弊端，產品多為固體粗制酶，僅能用于皮革、絲綢脫膠等少數(shù)行業(yè)，不能適應食品、飼料、洗滌劑等行業(yè)發(fā)展的需要。因而，食品、飼料、洗滌劑等對蛋白酶質量要求較高的行業(yè)普遍使用的是進口產品，其價格昂貴，增加了企業(yè)的生產成本。發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種蛋白酶生產工藝，該工藝原料利用率高，蛋白酶品質好。
本發(fā)明通過以下技術方案來實現(xiàn)上述目的。
一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟1)種子培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)接入斜面培養(yǎng)基在好氧條件下于30— 37°C培養(yǎng)24—30h，然后將培養(yǎng)好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基中，于30— 37°C恒溫搖床培養(yǎng)32— 37h ;再把培養(yǎng)好的菌種接入一級種子培養(yǎng)基于31 — 38°C培養(yǎng)9. 5 — 13h ；2)發(fā)酵將培養(yǎng)好的一級種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基于32—38°C培養(yǎng)31 — 35h ；3)提取蛋白酶將培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠巖，攪拌均勻，經固液分離、超濾膜超濾處理及噴霧干燥后即得。
具體的，所述步驟I)中，斜面培養(yǎng)基組成為蛋白胨O. 3—0. 5%，牛肉膏O. 2— O. 3%，磷酸二氫鉀O. 2—0. 5%，瓊脂I. 5—1. 7%，pH自然。種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨O. 3— O. 5%，牛肉膏O. 2—0. 3%，磷酸二氫鉀O. 2—0. 5%，pH自然；一級種子培養(yǎng)基組成豆柏3— 5%,薯干粉 2. 4—3. 2%,麩皮 3. 6—3. 9%,磷酸氫二鈉 O. 4—0. 6%,磷酸二氫鉀 O. 03—0. 07%, 菜籽油O. 4一O. 8%, pH自然。
所述步驟2)中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成豆柏3—5%，薯干粉2. 7—3. 5%，麩皮3. 8—4. 3%， 磷酸氫二鈉O. 4—0. 6%，磷酸二氫鉀O. 03—0. 07%，菜籽油O. 4—0. 8%，pH自然。
所述步驟3)中，硅藻土、珍珠巖的添加量均為發(fā)酵液重量的2—6% ;所用超濾膜的截留分子量為10000。
所述的蛋白酶生產工藝,具體步驟如下一、種子培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)接入斜面培養(yǎng)基在30— 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24— 30h，然后將培養(yǎng)好的斜面菌種接入(接種量2 — 5%)裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中， 于 30— 37°C恒溫搖床(轉速 140— 150r/min)培養(yǎng) 32— 37h。
將一級種子培養(yǎng)基投入種子罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)，然后通風降溫到31 — 38°C，將搖瓶培養(yǎng)好的菌種以I一5%的接種量接入一級種子培養(yǎng)基，保證罐壓在O. 05—0. 08Mpa，風量在12 — 26m3/hr (發(fā)酵罐內的空氣需進行殺菌過濾處理);溫度控制在31— 38°C，210— 270 r /min培養(yǎng)9. 5 — 13h，鏡檢，確保成熟無雜菌轉入發(fā)酵罐。
二、發(fā)酵將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐進行滅菌(12fl23°c實消4(Γ45分鐘)，然后通風降溫到 32— 38°C。以5 — 8%的接種量，接入培養(yǎng)好的一級種子進行發(fā)酵，發(fā)酵時間31 — 35小時。
其中，在發(fā)酵過程中不同時間點的發(fā)酵溫度如下所述時，效果較好0 — 2h于32— 38°C培養(yǎng)；2—IOh時，每小時升1°C，即到第IOh溫度升至40—46°C;10—20h時，每小時降 1°C，即到第20h溫度降至30—36°C。保證罐壓O. 05—0. 08Mpa ;風量0 7小時190 — 2IOm3/ h,發(fā)酵液與風量比(m3 :m3/min，下同)為I 0. 45—0. 51 ;8 15小時風量250—280m3/h,發(fā)酵液與風量比為I :0. 59 — I. 63。第16小時左右泡沫開始升高，此時調節(jié)風量，16h至發(fā)酵結束，發(fā)酵液與風量比為I :0. 67 — O. 71，風量280— 300m3/小時。發(fā)酵結束時，酶活力最低約達到 32000U/ml。
發(fā)酵過程中，自第10 —12小時開始，每4小時取樣測酶活力、PH、鏡檢菌形；第 23—26小時開始，每2小時一次 取樣測酶活力、PH、鏡檢菌形。連續(xù)兩次檢測酶活力不上升， 鏡檢菌形50— 60%芽孢以上，溫度上升緩慢或無上升趨勢，即可結束發(fā)酵。
三、提取蛋白酶將培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠巖，攪拌均勻，板框過濾，濾液為粗酶液，粗酶液經板框二次過濾處理，進一步除去細菌等雜質，所得濾液再經超濾膜超濾處理及噴霧干燥即可得到純的蛋白酶。
蛋白酶檢測方法依據(jù)GB/T23527-2009蛋白酶制劑進行。
采用本發(fā)明方法，發(fā)酵罐平均發(fā)酵水平37466u/mL，處于國內領先水平。本發(fā)明還把二次過濾和精濾除菌技術應用于酶的分離提取，開發(fā)出精制蛋白酶，填補了國內空白。
和現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明優(yōu)點I)研究開發(fā)了液體發(fā)酵法生產蛋白酶的工藝技術。在發(fā)酵工藝上，對產酶菌株的特性和產酶條件進行深入研究，采用稀醪發(fā)酵等工藝，縮短了發(fā)酵周期，提高了產酶水平，與傳統(tǒng)的固體發(fā)酵工藝相比，該工藝技術具有產率高、原料利用率高、勞動強度小，便于工業(yè)化生產，生產過程不易受雜菌污染，酶系純等顯著優(yōu)點。
2)在分離提取工藝上，采用二濾和精濾技術提高了收率和產品質量，成功開發(fā)出精制蛋白酶產品，填補國內不能生產精制液體蛋白酶的空白，并形成一套完整的深層液體發(fā)酵法生產蛋白酶的先進工藝技術，在35噸發(fā)酵罐的工業(yè)化生產中應用后，達到平均發(fā)酵單位37466u/mL，最高達42356 u/mL，產品總收率達80%以上。
3)采用本發(fā)明工藝所得蛋白酶產品性能穩(wěn)定、質量可靠、價格適當可實現(xiàn)我國蛋白酶產品的升級換代，填補此類產品的空白，替代進口產品，滿足國內市場的需求。
具體實施例方式下面通過優(yōu)選實施例來詳述本發(fā)明技術方案，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。
實施例I一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟一、種子培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis，購自上海市工業(yè)微生物研究所，商品編號B252)接入斜面培養(yǎng)基在30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)26h，然后將培養(yǎng)好的斜面菌種接入(2%) 裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，于30°C恒溫搖床(轉速140r/min)培養(yǎng)37h。
斜面培養(yǎng)基組成為蛋白胨O. 4%，牛肉膏O. 2%，磷酸二氫鉀O. 3%，瓊脂I. 6%，pH 自然。種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨0.4%，牛肉膏0.3%，磷酸二氫鉀0.4%，pH自然。
將一級種子培養(yǎng)基(組成豆柏3%，薯干粉2. 4%，麩皮3. 6%，磷酸氫二鈉O. 4%，磷酸二氫鉀O. 03%，菜籽油O. 5%，pH自然)投入種子罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)， 然后通風降溫到38°C，將搖瓶培養(yǎng)好的菌種以2%的接種量接入一級種子培養(yǎng)基，保證罐壓在O. 05Mpa，風量在12m3/h (發(fā)酵罐內的空氣需進行殺菌過濾處理)；溫度控制在38°C，210 r /min培養(yǎng)10h，鏡檢，確保成熟無雜菌轉入發(fā)酵罐。
二、發(fā)酵將發(fā)酵培養(yǎng)基(組成豆柏3%，薯干粉2. 7%，麩皮3. 8%，磷酸氫二鈉O. 4%，磷酸二氫鉀O.03%，菜籽油O. 5%，pH自然)裝入發(fā)酵罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)，然后通風降溫到38°C。以8%的接種量，接入培養(yǎng)好的一級種子進行發(fā)酵，發(fā)酵33小時。
三、提取蛋白酶將培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉入回收罐并向其中加入娃藻土和珍珠巖(娃藻土、珍珠巖的添加量分別為發(fā)酵液重量的2%和3%)，攪拌均勻，板框過濾，濾液為粗酶液，粗酶液經板框二次過濾處理，進一步除去細菌等雜質，所得濾液再經截留分子量為10000的超濾膜(型號 PES10-8040，下同)超濾處理后噴霧干燥即可得到符合GB/T23527-2009要求、酶活力為 150000u/g左右的蛋白酶。
實施例2一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟一、種子培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis，購自上海市工業(yè)微生物研究所，商品編號 B252)接入斜面培養(yǎng)基在32°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28h，然后將培養(yǎng)好的斜面菌種接入(3%) 裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，于32°C恒溫搖床(轉速145r/min)培養(yǎng)35h。
斜面培養(yǎng)基組成為蛋白胨O. 45%，牛肉膏O. 25%，磷酸二氫鉀O. 4%，瓊脂I. 65%， pH自然。種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨O. 45%，牛肉膏O. 25%，磷酸二氫鉀O. 45%，pH自然。
將一級種子培養(yǎng)基(組成豆柏4%，薯干粉2. 6%，麩皮3. 7%，磷酸氫二鈉O. 5%，磷酸二氫鉀O. 05%，菜籽油O. 6%，pH自然)投入種子罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)， 然后通風降溫到36°C，將搖瓶培養(yǎng)好的菌種以4%的接種量接入一級種子培養(yǎng)基，保證罐壓在O. 06Mpa，風量在18m3/h (發(fā)酵罐內的空氣需進行殺菌過濾處理)；溫度控制在36°C，240 r /min培養(yǎng)12h，鏡檢，確保成熟無雜菌轉入發(fā)酵罐。
二、發(fā)酵將發(fā)酵培養(yǎng)基(組成豆柏4%，薯干粉3. 0%，麩皮4. 0%，磷酸氫二鈉O. 5%，磷酸二氫鉀O.05%，菜籽油O. 6%，pH自然)裝入發(fā)酵罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)，然后通風降溫到36°C。以6%的接種量，接入培養(yǎng)好的一級種子進行發(fā)酵，發(fā)酵34小時。
三、提取蛋白酶將培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉入回收罐并向其中加入娃藻土和珍珠巖(娃藻土、珍珠巖的添加量分別為發(fā)酵液重量的3%和3. 5%)，攪拌混勻后板框過濾，濾液為粗酶液，粗酶液經板框二次過濾處理，進一步除去細菌等雜質，所得濾液再經截留分子量為10000的超濾膜超濾處理及噴霧干燥即可得到符合GB/T23527-2009要求、酶活力為200000u/g左右的蛋白酶。
實施例3一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟一、種子培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis，購自上海市工業(yè)微生物研究所，商品編號 B252)接入斜面培養(yǎng)基在35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30h，然后將培養(yǎng)好的斜面菌種接入(4%) 裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，于35°C恒溫搖床(轉速150r/min)培養(yǎng)32h。
斜面培養(yǎng)基組成為蛋白胨O. 5%，牛肉膏O. 3%，磷酸二氫鉀O. 5%，瓊脂I. 7%，pH 自然。種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨0.5%，牛肉膏0.2%，磷酸二氫鉀0.5%，pH自然。
將一級種子培養(yǎng)基(組成豆柏5%，薯干粉3. 0%，麩皮3. 8%，磷酸氫二鈉O. 6%，磷酸二氫鉀O. 06%，菜籽油O. 7%，pH自然)投入種子罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)， 然后通風降溫到32°C，將搖瓶培養(yǎng)好的菌種以5%的接種量接入一級種子培養(yǎng)基，保證罐壓在O. 08Mpa，風量在24m3/h (發(fā)酵罐內的空氣需進行殺菌過濾處理)；溫度控制在32°C，260 r /min培養(yǎng)13h，鏡檢，確保成熟無雜菌轉入發(fā)酵罐。
二、發(fā)酵將發(fā)酵培養(yǎng)基(組成豆柏5%，薯干粉3. 2%，麩皮4. 2%，磷酸氫二鈉O. 6%，磷酸二氫鉀 O. 06%，菜籽油O. 7%，pH自然)裝入發(fā)酵罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)，然后通風降溫到32°C。以5%的接種量，接入培養(yǎng)好的一級種子進行發(fā)酵，發(fā)酵32小時。
三、提取蛋白酶將培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉入回收罐并向其中加入娃藻土和珍珠巖(娃藻土、珍珠巖的添加量分別為發(fā)酵液重量的5%和4%)，開啟攪拌，混勻后經板框過濾，濾液為粗酶液，粗酶液經板框二次過濾處理，進一步除去細菌等雜質，所得濾液再經截留分子量為10000的超濾膜超濾處理及噴霧干燥即可得到符合GB/T23527-2009要求、酶活力為100000u/g左右的蛋白酶。
權利要求
1.一種蛋白酶生產工藝，其特征在于，包括以下步驟1)種子培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)接入斜面培養(yǎng)基在好氧條件下于30— 37°C培養(yǎng)24— 30h，然后將培養(yǎng)好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基中，于30— 37°C恒溫搖床培養(yǎng)32— 37h ;再把培養(yǎng)好的菌種接入一級種子培養(yǎng)基于31 — 38°C培養(yǎng)9. 5 — 13h ；2)發(fā)酵將培養(yǎng)好的一級種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基于32—38°C培養(yǎng)31—35h ；3)提取蛋白酶將培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠巖，攪拌均勻，經固液分離、超濾膜超濾處理及噴霧干燥即得。
2.如權利要求I所述的蛋白酶生產工藝，其特征在于，所述步驟I)中，斜面培養(yǎng)基組成為蛋白胨O. 3—0. 5%，牛肉膏O. 2—0. 3%，磷酸二氫鉀O. 2—0. 5%，瓊脂I. 5—1. 7%，pH 自然；種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨O. 3—0. 5%，牛肉膏O. 2—0. 3%，磷酸二氫鉀O. 2—0. 5%， pH自然；一級種子培養(yǎng)基組成豆柏3 — 5%，薯干粉2. 4—3. 2%，麩皮3. 6—3. 9%，磷酸氫二鈉 O. 4—0. 6%，磷酸二氫鉀 O. 03—0. 07%，菜籽油 O. 4—0. 8%, pH 自然。
3.如權利要求I所述的蛋白酶生產工藝，其特征在于，所述步驟2)中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成豆柏3 — 5%，薯干粉2. 7—3. 5%，麩皮3. 8—4. 3%，磷酸氫二鈉O. 4—0. 6%，磷酸二氫鉀 O. 03—0. 07%，菜籽油 O. 4—0. 8%, pH 自然。
4.如權利要求I所述的蛋白酶生產工藝，其特征在于，所述步驟3)中，硅藻土、珍珠巖的添加量均為發(fā)酵液重量的2—6% ;所用超濾膜的截留分子量為10000。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟1)種子培養(yǎng)將地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)接入斜面培養(yǎng)基在好氧條件下于30—37℃培養(yǎng)24—30h，然后將培養(yǎng)好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基中，于30—37℃恒溫搖床培養(yǎng)32—37h；再把培養(yǎng)好的菌種接入一級種子培養(yǎng)基于31—38℃培養(yǎng)9.5—13h；2)發(fā)酵將培養(yǎng)好的一級種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基于32—38℃培養(yǎng)31—35h；3)提取蛋白酶將培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉入回收罐并向其中加入硅藻土和珍珠巖，攪拌均勻，經固液分離、超濾膜超濾處理及噴霧干燥即得。采用該工藝收率高，所得蛋白酶品質好。
文檔編號C12N9/56GK102911925SQ20121044598
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權日2012年5月21日
發(fā)明者常東民, 孫利鵬, 管寧 申請人:河南仰韶生化工程有限公司