Alk融合基因檢測(cè)的pcr引物、試劑盒和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測(cè)ALK融合基因的PCR引物、試劑盒和液相芯片。所述液相芯片包括：PCR擴(kuò)增引物；由tag序列和特異性引物組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對(duì)K15;DEL15A20的SEQ?ID?NO.12、針對(duì)K17;A20的SEQ?ID?NO.13、針對(duì)K9;A20的SEQ?IDNO.14、針對(duì)T6;A20的SEQ?ID?NO.15、和/或針對(duì)T3;A20的SEQ?ID?NO.16；微球。本發(fā)明所述的液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，可一步完成5種融合亞型的擴(kuò)增，且特異性引物具有非常好的特異性。
【專利說(shuō)明】ALK融合基因檢測(cè)的PCR引物、試劑盒和液相芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及ALK融合基因檢測(cè)的的PCR引物、試劑盒和液相芯片。
技術(shù)背景
[0002]ALK基因位于染色體2p23位點(diǎn)，正常情況下人源的alk可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大小6222bp的mRNA,由29個(gè)外顯子構(gòu)成，編碼1620個(gè)氨基酸序列200KDa的I型穿膜蛋白ALK，該蛋白為一種受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase, RTK),是RTK胰島素超家族的成員。完整的ALK具有典型的RTK三部分結(jié)構(gòu)，即胞外區(qū)、親脂性穿膜區(qū)和胞漿內(nèi)酪氨酸激酶。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ALK蛋白除在極少部分彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)外，可在60%~85%的原發(fā)性系統(tǒng)性ALCL中表達(dá)，是原發(fā)性系統(tǒng)性ALCL相對(duì)特異的免疫表型特征。ALK在某些ALCL中的異常表達(dá)來(lái)源于不同的染色體易位，每個(gè)易位會(huì)產(chǎn)生不同的融合蛋白質(zhì)，由配偶體的5’端和ALK酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域3’端融合得到。在大部分ALK融合基因中，ALK斷裂點(diǎn)位于第19內(nèi)含子內(nèi)，在mRNA上，斷裂點(diǎn)一般位于第20個(gè)外顯子的第一個(gè)核苷酸上。
[0003]目前，與ALK相關(guān)的融合基因，除了發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因之外，又發(fā)現(xiàn)了KIF5B-ALK.,KLCl-ALK和TFG-ALK融合基因。在腺癌患者檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了兩種KIF5B-ALK基因融合亞型，K15;DEL15A20 和 K17;A20。
[0004]KLCl-ALK融合基因也許并不多見，但是該融合基因在肺腺癌中確實(shí)存在。KLCl與ALK基因發(fā)生融合，與ALK基因發(fā)生t (2; 14) (p23;q32.3)易位產(chǎn)生KLCl-ALK融合基因。這兩個(gè)基因之間，形成框內(nèi)基因 融合。完整KLCl-ALK cDNA可能產(chǎn)生的具有984個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包含KLCl基因三分之二的氨基末端和ALK基因細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，具有這個(gè)融合基因的病人極可能受益于ALK抑制劑治療。另外，KLCl-ALK融合基因從腺癌(原發(fā)生位置細(xì)支氣管肺泡癌)中被發(fā)現(xiàn)。而細(xì)支氣管肺泡癌很少發(fā)現(xiàn)KLCl-ALK融合基因，從病理學(xué)角度出發(fā)，大規(guī)模檢測(cè)細(xì)支氣管肺泡癌個(gè)體以及對(duì)ALK融合基因癌前情況，這是非常有意義的。
[0005]在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中，Rikova等研究發(fā)現(xiàn)了 TFG-ALK融合基因，這個(gè)融合基因有兩種異位的變異型:最近證實(shí)為t (2 ；3) (p23;q35)和inv (2) (p23q25)，兩種不同的融合蛋白 85kDa (TFG-ALK 短的)和 97kDa (TFG-ALK 長(zhǎng)的)是與 t (2 ；3) (p23 ;q25)有關(guān)，這種包括TFG (TRF融合基因)，inv (2) (p23q25)包括ATIC基因(以前稱為pur_T)，是轉(zhuǎn)錄ATIC，其在嘌呤生物合成通路上起著重要作用。
[0006]目前，針對(duì)ALK融合基因的研究大部分采用RT-PCR方法以及非放射性同為雜交FISH方法進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR方法是針對(duì)已知的ALK融合基因的類型以及融合方式來(lái)設(shè)計(jì)引物，將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的片段的方式來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，則存在靈敏度低，樣品易污染、假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn)。非放射性原位雜交技術(shù)FISH法的原理是設(shè)計(jì)與被檢測(cè)的ALK融合基因同源互補(bǔ)的核酸探針，二者經(jīng)過(guò)變性一退火一復(fù)性，即可形成KALK融合基因的DNA與核酸探針的雜交體。用報(bào)告分子(如生物素等)標(biāo)記核酸探針的某一種核酸，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異性堿基之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系的鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性以及相對(duì)定位分析。盡管該法較為直觀，但是試驗(yàn)過(guò)程過(guò)于繁瑣，需要的試劑種類繁多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且試驗(yàn)結(jié)果需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專家來(lái)判讀，結(jié)果判讀存在較大的主觀性，而且其只能檢出融合基因是否存在，不能準(zhǔn)確得出具體的融合類型，且靈敏性較低，因而一定程度上限制了該法的應(yīng)用。鑒于各種融合基因(如ALK融合基因)的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)更為實(shí)用的融合基因檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測(cè)ALK融合基因的PCR引物，所述PCR引物可用于單獨(dú)或并行檢測(cè)KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因的5種基因融合亞型:KIF5B-ALK 的 K15;DEL15A20、K17;A20 ；KLC1-ALK 的 K9;A20 ；TFG-ALK 的 T6;A20、T3;A20。
[0008]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0009]一種檢測(cè)ALK融合基因的PCR引物，所述PCR引物為:針對(duì)K15; DEL15A20的SEQIDN0.1 和 SEQ ID N0.2、針對(duì) K17;A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3、針對(duì) K9;A20 的 SEQIDN0.1 和 SEQ ID N0.4、針對(duì) T6;A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.5、和 / 或針對(duì) T3;A20的 SEQID N0.1 和 SEQ ID N0.6。
[0010]本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)ALK融合基因的PCR試劑盒。
[0011]實(shí)現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下:
[0012]一種檢測(cè)ALK融合基因的PCR試劑盒，包括有上述的PCR引物。
[0013]在其中一個(gè)實(shí)施例`中，所述PCR試劑盒還包括有陽(yáng)性對(duì)照品，所述陽(yáng)性對(duì)照品為:針對(duì)K15;DEL15A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.2反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段、針對(duì)K17;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.3反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段、針對(duì)K9;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.4反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段、針對(duì)T6;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.5反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段、和/或針對(duì)T3;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.6反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段。更優(yōu)選地，所述陽(yáng)性對(duì)照品為針對(duì)K15;DEL15A20的SEQ ID N0.7、針對(duì)K17;A20的SEQ ID N0.8、針對(duì) K9;A20 的 SEQID N0.9、針對(duì) T6;A20 的 SEQ ID N0.10、和 / 或針對(duì) T3;A20 的 SEQ IDN0.11。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)ALK融合基因的液相芯片。
[0015]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0016]—種檢測(cè)ALK融合基因的液相芯片,包括有:
[0017](A)上述 PCR 引物；
[0018](B).針對(duì)ALK融合基因不同融合類型分別設(shè)計(jì)的ASPE引物:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的融合類型的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對(duì) K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、針對(duì) K17; A20 的 SEQ ID N0.13、針對(duì) K9; A20 的 SEQIDN0.14、針對(duì) T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或針對(duì) T3;A20 的 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.17—SEQ ID N0.26 ；
[0019](C).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.27—SEQ ID N0.36，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(B)中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)。
[0020]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述ASPE引物為:針對(duì)K15;DEL15A20的由SEQ ID N0.17和SEQID N0.12組成的序列、針對(duì)K17;A20的由SEQ ID N0.18和SEQ ID N0.13組成的序列、針對(duì)K9;A20的由SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.14組成的序列、針對(duì)T6; A20的由SEQID N0.20 和 SEQ ID N0.15 組成的序列、和 / 或針對(duì) T3;A20 的由 SEQ ID N0.21 和 SEQ IDN0.16組成的序列。
[0021]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測(cè)ALK融合基因的特異性引物。
[0022]具體技術(shù)方案如下:
[0023]一種用于檢測(cè)ALK融合基因的特異性引物，所述特異性引物為:針對(duì)K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、針對(duì) K17;A20 的 SEQ ID N0.13、針對(duì) K9;A20 的 SEQ IDN0.14、針對(duì) T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或針對(duì) T3;A20 的 SEQ ID N0.16。
[0024]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0025]1、本發(fā)明所提供的ALK融合基因檢測(cè)液相芯片與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100%。
[0026]2、本發(fā)明的檢測(cè)液相芯片步驟簡(jiǎn)單，使用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，通過(guò)嚴(yán)格篩選的PCR引物，通過(guò)一步PCR即可完成含有5種KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因亞型的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過(guò)程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的定性分析特征。
[0027]3、本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒使用含有目標(biāo)檢測(cè)融合亞型序列的質(zhì)粒載體作為陽(yáng)性對(duì)照品，進(jìn)一步保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0028]4、本發(fā)明所制備的KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因的液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，所設(shè)計(jì)的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，同時(shí)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的融合基因亞型。
[0029]5、本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測(cè)序技術(shù)，特別符合實(shí)際應(yīng)用的需要。
[0030]6、本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測(cè)的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
[0031]說(shuō)明書附圖
[0032]圖1是實(shí)施例2中PCR擴(kuò)增的組I的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員采用的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或按照生產(chǎn)廠商所提供的操作方法來(lái)實(shí)施。
[0034]實(shí)施例1 一 種檢測(cè)ALK融合基因的融合基因檢測(cè)的PCR引物和陽(yáng)性對(duì)照品
[0035]一、RT-PCR 擴(kuò)增
[0036]1、逆轉(zhuǎn)錄[0037]針對(duì)各種目標(biāo)檢測(cè)的KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因亞型，本發(fā)明先使用隨機(jī)引物對(duì)目標(biāo)檢測(cè)樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將樣本中mRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，使用隨機(jī)引物進(jìn)行mRNA的反轉(zhuǎn)錄為常規(guī)操作步驟。
[0038]2、PCR 擴(kuò)增
[0039]表1中的融合類型為本發(fā)明目標(biāo)檢測(cè)的5種ALK融合基因亞型，根據(jù)該融合基因序列的核酸組成特征，利用Primer5.0設(shè)計(jì)正向引物和反向引物。使用步驟I所得的cDNA作為模板，對(duì)5種目標(biāo)檢測(cè)融合基因亞型進(jìn)行并行擴(kuò)增。
[0040]所有引物由Invitrogen公司合成。合成后的每條引物分別用10mmol/L TrisBuffer配制成300pmol/mL的忙存液。
[0041]其中，K9;A20表示KLCl基因的外顯子9和ALK基因的外顯子20發(fā)生融合。
[0042]表1KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因亞型擴(kuò)增引物
融介祛產(chǎn)物大
融介類鹽il-浪引物 (5.-3,)反N引物(5.- 30
H+ (bp)
K15-DEL1GAATCAGAAATCGGCAA
+233
KIF5B- 5A20CTTTA`G ( SEQID N0.2)
ALKCGTATCTCTCAACATGAA
Κ17;Α20 220


GCCAAA (SEQ ID N0.3 )
[0043]----
KI C' 1-4ATAACCTGGCATCCTGCT TGGTCG AGGTG
K9;A20 198
LKATT (SEQIDN0.4)CGGAGCTT

TCCTCAGCAGCTCACCC (SEQ ID N0.1)
T6;A20172
TFG-ALAC (SEQ 丨D N0.5)
KTTGATAGTTCTGACCTTT
T3;A20153

CCTTTGC ( SEQIDN0.6)
[0044]二、陽(yáng)性對(duì)照品
[0045]本發(fā)明根據(jù)目標(biāo)檢測(cè)ALK融合基因的5種亞型的融合序列特征，設(shè)計(jì)核酸片段作為檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照品，該陽(yáng)性對(duì)照品為含有表1中擴(kuò)增引物的正向引物和與反向引物反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段，其正向引物和反向引物反向互補(bǔ)配對(duì)的序列之間的核酸片段可以是人類基因組序列，也可以是來(lái)源于植物、微生物等非人源的核酸序列，且所合成的陽(yáng)性對(duì)照品的片段大小與表1中相應(yīng)的目標(biāo)檢測(cè)融合類型的擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，從而實(shí)現(xiàn)在擴(kuò)增過(guò)程中陽(yáng)性對(duì)照的作用，同時(shí)，實(shí)現(xiàn)其它的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?例如:當(dāng)使用來(lái)源于植物、微生物等非人源的核酸序列時(shí)，可以避免陽(yáng)性對(duì)照品中人類基因組序列對(duì)其它檢測(cè)樣本的陽(yáng)性污染等。)
[0046]本發(fā)明檢測(cè)方法中，針對(duì)各種目標(biāo)檢測(cè)融合基因亞型，采用插入相應(yīng)人類基因組序列作為陽(yáng)性對(duì)照品。具體見表2中的SEQ ID N0.7~SEQ ID N0.11，委托金唯智生物科技(北京)有限公司進(jìn)行目標(biāo)插入序列的合成，將經(jīng)過(guò)純化的合成序列插入到PMD18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，構(gòu)建目標(biāo)檢測(cè)的5種ALK融合基因亞型重組質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì)照品。構(gòu)建的5種重組質(zhì)粒經(jīng)雙向DNA測(cè)序鑒定正確。提取質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)定量，稀釋至5.0X 101°拷貝/毫升于-20° C保存。
[0047]表2KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因亞型陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的插入序列
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)ALK融合基因的PCR引物，其特征是，所述PCR引物為:針對(duì)K15; DEL15A20的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2、針對(duì) K17; A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ IDN0.3、針對(duì) K9; A20的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.4、針對(duì) T6;A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ IDN0.5、和 / 或針對(duì)T3;A20 的 SEQ ID N0.1和 SEQ ID N0.6。
2.一種檢測(cè)ALK融合基因的PCR試劑盒，其特征是，包括有權(quán)利要求1所述的PCR引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PCR試劑盒，其特征是，所述PCR試劑盒還包括有陽(yáng)性對(duì)照品，所述陽(yáng)性對(duì)照品為:針對(duì)K15;DEL15A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.2反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段、針對(duì)K17;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.3反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段、針對(duì)K9;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.4反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段、針對(duì)T6;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.5反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段、和/或針對(duì)T3;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.6反向互補(bǔ)配對(duì)的序列的核酸片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PCR試劑盒，其特征是，所述陽(yáng)性對(duì)照品為針對(duì)K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.7、針對(duì)K17; A20 的 SEQ ID N0.8、針對(duì)K9; A20 的 SEQ ID N0.9,針對(duì) T6;A20 的 SEQ ID N0.10、和 / 或針對(duì) T3; A20 的 SEQ ID N0.11。
5.—種檢測(cè)ALK融合基因的液相芯片，其特征是，包括有: (A)權(quán)利要求1所述的PCR引物； (B).針對(duì)ALK融合基因不同融合類型分別設(shè)計(jì)的ASPE引物:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的融合類型的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對(duì) K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、針對(duì) K17;A20 的 SEQ ID N0.13、針對(duì) K9;A20 的 SEQIDN0.14、針對(duì) T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或針對(duì) T3;A20 的 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.17-SEQ ID N0.26 ； (C).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.27-SEQ ID N0.36，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(B)中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)。
6.根據(jù)權(quán)要求5所述的液相芯片，其特征是，所述ASPE引物為:針對(duì)K15;DEL15A20的由 SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.12 組成的序列、針對(duì) K17;A20 的由 SEQ ID N0.18 和 SEQIDN0.13組成的序列、針對(duì)K9;A20的由SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.14組成的序列、針對(duì)T6;A20的由SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.15組成的序列、和/或針對(duì)T3;A20的由SEQ IDN0.21和SEQID N0.16組成的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10個(gè)T。
8.一種用于檢測(cè)ALK融合基因的特異性引物，其特征是，所述特異性引物為:針對(duì) K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、針對(duì) K17; A20 的 SEQ ID N0.13、針對(duì) K9;A20 的 SEQIDN0.14、針對(duì) T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或針對(duì) T3;A20 的 SEQ ID N0.16。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103805687SQ201210448636
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月9日
【發(fā)明者】陳昌華, 陳菲, 許昌有 申請(qǐng)人:益善生物技術(shù)股份有限公司