專利名稱：制備金屬納米顆粒的方法
制備金屬納米顆粒的方法
本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)PCT/EP2007/006145，國(guó)際申請(qǐng)日2007年7月5日，中國(guó)國(guó)家階段申請(qǐng)?zhí)?00780025198. 7，名稱“制備金屬納米顆粒的方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在細(xì)菌膜上制備膠體金屬化合物。本發(fā)明也涉及通過(guò)生物過(guò)程制備銀或金納米顆粒的方法。具體的，本發(fā)明涉及使用益生菌，如乳桿菌(Lactobacillus),在特定條件下產(chǎn)生金屬納米沉淀，尤其是銀或金納米顆粒以提高其抗微生物效率。本發(fā)明還涉及一種包含載體的消毒產(chǎn)品，該載體是用含有所述方法制備的膠體納米銀或納米金的組合物浸潰的。
發(fā)明背景
在處理大量包含微生物的污染材料，如水，特別是家庭或工業(yè)循環(huán)水，以及污水 (如在食品加工業(yè)產(chǎn)生的污水)過(guò)程中需要有效的消毒過(guò)程，因?yàn)樾l(wèi)生、操作或環(huán)境原因， 這些污水在未處理前不能排放或重復(fù)利用。在處理例如建筑物、設(shè)備、容器、空調(diào)系統(tǒng)的表面時(shí)也需要有效的消毒過(guò)程。與環(huán)境相容的消毒過(guò)程主要基于活性氧化合物，如過(guò)氧化氫或季銨化合物單體。
過(guò)氧化氫時(shí)一種具有殺菌特性的活性適當(dāng)?shù)臏睾涂咕鷦?。已知過(guò)氧化氫濃度為 25mg/l時(shí)能抑制一些細(xì)菌的生長(zhǎng)，然而，即便是在更高濃度的過(guò)氧化氫作用下，微生物計(jì)數(shù)的有效減少也需要數(shù)小時(shí)或者還需要紫外照射。而產(chǎn)生紫外線需要昂貴的設(shè)備和大量的電消耗。因此當(dāng)對(duì)大量污染材料如水進(jìn)行消毒時(shí)，例如污水處理廠處理污水并排放時(shí)，此類方法缺乏可行性和/或不經(jīng)濟(jì)。因此，本領(lǐng)域已嘗試不同方法以克服這些劣勢(shì)。
本領(lǐng)域已知銀離子或基于銀的化合物對(duì)于微生物具有高度毒性，因而對(duì)許多常見細(xì)菌種類包括大腸桿菌顯示了強(qiáng)效抗菌作用。已顯示銀納米顆粒和高度分支的兩親大分子的雜交體具有有效的抗微生物表面涂層。發(fā)現(xiàn)無(wú)毒的銀元素水溶膠形式的銀納米顆粒的穩(wěn)定水分散體對(duì)大腸桿菌具有強(qiáng)殺菌作用，50 μ g/cm3濃度能100%抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)銀納米顆?？尚罘e于細(xì)菌膜，以某種方式與細(xì)菌膜的某些結(jié)構(gòu)元件發(fā)生作用，因此導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)變化、降解，最終引起細(xì)胞死亡。報(bào)道稱，由于膜中過(guò)量的羧基和其它基團(tuán)解離，在生物學(xué)PH 值下細(xì)菌表面總體上帶負(fù)電。已表明，因?yàn)榘襁M(jìn)膜碳基質(zhì)的銀納米顆粒在基質(zhì)內(nèi)的運(yùn)動(dòng)和摩擦使其表面帶電，因此靜電力也許是納米顆粒和細(xì)菌之間相互作用的原因。此外，銀趨于具有更高的親和力，與細(xì)菌膜及DNA中含磷和硫的化合物反應(yīng)。第三種可能的作用模式是釋放可能產(chǎn)生銀納米顆粒的殺菌效應(yīng)的銀離子。
已報(bào)道數(shù)種微生物，例如乳桿菌、真菌尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)能將 Ag(I)生物吸附到其細(xì)胞表面，并通過(guò)還原酶作用或電子穿梭醌或兩者同時(shí)作用來(lái)還原成 Ag (O)，從而對(duì)該離子進(jìn)行解毒。
本領(lǐng)域已知一種包含大小范圍I-IOOnm生物學(xué)穩(wěn)定的銀納米顆粒，以及含有所述生物學(xué)穩(wěn)定的納米顆粒且濃度為l_6ppm的載體的無(wú)細(xì)胞毒性的抗微生物制劑。
也已知一種制備膠體銀-生物分子復(fù)合物的方法，該方法包括
-在單一溶液里提供生物分子、銀鹽和鹵離子來(lái)源的混合物；以及
-以可見區(qū)波長(zhǎng)的光照射該混合物，其中銀鹽和鹵離子來(lái)源為水溶性的；生物分子、銀鹽、鹵離子來(lái)源的含量可使照射步驟得到膠體銀-生物分子復(fù)合物。
已公開一種制備納米大小的膠體金屬顆粒的方法，所述方法包括在15_40°C的溫度范圍內(nèi)用金屬離子的溶液處理濕的真菌或真菌提取物2-120小時(shí)，并分離生物物質(zhì)以獲取納米尺寸的膠體金屬顆粒。
常規(guī)制備銀納米顆粒的生產(chǎn)方法有很多劣勢(shì)，如高生產(chǎn)成本、產(chǎn)生顯著比例的副產(chǎn)品或存在獲取納米顆粒濃度的上限。例如，后一種生產(chǎn)方法需要很長(zhǎng)的生產(chǎn)時(shí)間并利用有致病可能的真菌。因此本領(lǐng)域需要一種可靠、廉價(jià)并減少或避免副產(chǎn)品產(chǎn)生的制備銀納米顆粒的方法。
已研究過(guò)，乳桿菌的Ag(I)生物吸附過(guò)程、該過(guò)程在pH范圍2-6中的pH依賴性、 在溫度范圍10-60°C中的溫度依賴性、以及乳桿菌將Ag+還原為Ag°的機(jī)制。
本領(lǐng)域還已知一種通過(guò)生物還原制備銀納米顆粒的方法，即利用氣單胞菌 (Aeromonas sp.)與銀離子、氨及氫氧化鈉混和，60°C反應(yīng)數(shù)小時(shí)。
上述方法的缺陷是需要高溫、酸性pH和/或長(zhǎng)孵育時(shí)間，或由其產(chǎn)生的銀納米顆粒的殺菌活性不足。
因此本領(lǐng)域需要通過(guò)不存在這些劣勢(shì)的方法來(lái)制備銀或金納米顆粒。
本領(lǐng)域還需要簡(jiǎn)單、環(huán)境友好的、可重復(fù)的制備具有高抗微生物特性的銀或金納米顆粒的方法。
本領(lǐng)域還需要制備已知可用于某些醫(yī)療應(yīng)用的金或銀納米顆粒的相應(yīng)方法。
本領(lǐng)域還了解，除金或銀之外的金屬和所述金屬的化合物的膠體形式具有有價(jià)值的特性和應(yīng)用。例如，膠體次枸櫞酸鉍為水溶性，尤其在pH范圍為3-8時(shí)，幾十年來(lái)，它與抗生素聯(lián)合用于治療胃和十二指腸潰瘍和幽門螺桿菌感染。外用膠體形式的汞、無(wú)機(jī)汞化合物和金屬汞油膏劑具有各種治療應(yīng)用，包括治療感染性濕疹或膿皰病(汞鹽)、治療梅毒 (甘汞)、治療牛皮癬(氧化汞或氨化汞)。使用鈀和鉬的膠體形式催化多種化學(xué)反應(yīng)，包括有機(jī)還原和氫解等。膠體形式的鉬納米顆粒也用作抗癌藥。任選與水楊酸螯合的膠體銅是強(qiáng)效消炎劑，并且已知膠體銅或膠體鋅的舌下(給藥)形式可對(duì)抗感冒和流感。此外，膠體鋅在抗病毒方面尤其有效。在所有這些不同的領(lǐng)域，長(zhǎng)期需要提供不同形式的膠體金屬或膠體金屬化合物，用以提高其在相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域的功效。
發(fā)明概述
廣義上講，本發(fā)明涉及使用細(xì)菌在細(xì)菌膜上制備膠體金屬化合物，和包被的細(xì)菌作為抗微生物劑的后續(xù)應(yīng)用。具體來(lái)說(shuō)本發(fā)明涉及
·通過(guò)在受控pH下將所述細(xì)菌與金屬鹽或其它鹽的混合物接觸，在細(xì)菌膜上制備膠體金屬化合物，以便使用細(xì)菌制備膠體金屬化合物，和
·使用上述膜上包被金屬化合物的細(xì)菌作為抗微生物劑。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及利用益生菌和其它細(xì)菌制備金屬納米沉淀，所述金屬納米沉淀可用作飲用水、表面涂料和其它材料的抗微生物劑。
更具體來(lái)說(shuō),一些細(xì)菌能夠?qū)g (I)鹽還原為沉淀于細(xì)胞表面形成納米Ag顆粒的膠體Ag (O)。膠體銀或其它金屬納米沉淀包被的生物物質(zhì)易于通過(guò)過(guò)濾或離心從水相收集，并可進(jìn)行沖洗、漂洗和其它處理，且在(稀釋的)懸液中或加工為涂料時(shí)形成具有強(qiáng)抗微生物特性的膠體產(chǎn)物。
有趣的是，多種益生菌，即工業(yè)生產(chǎn)的、當(dāng)出現(xiàn)于人消化道時(shí)有益人體健康的細(xì)菌，顯示了其在細(xì)胞表面產(chǎn)生Ag納米沉淀的能力。此類細(xì)菌包括但不限于益生型發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)菌株。
通過(guò)在濃縮細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物中加入特定鹽的組合(AgN03、NH4C1、NaOH等)并控制 PH，形成具有強(qiáng)抗微生物特性的膠體銀產(chǎn)物，將其它金屬鹽和某些細(xì)菌菌株組合得到具有類似特性的納米沉淀，這也是本發(fā)明的一部分。
通過(guò)調(diào)節(jié)“銀物質(zhì)”和“生物細(xì)胞物質(zhì)”比例(Ag:CDW，其中CDW=細(xì)胞干重)，最終膠體銀產(chǎn)物的反應(yīng)性和特性可能不同，這涉及膠體粒度、膠體顆粒分布和其它特性。
細(xì)菌表面產(chǎn)生的膠體銀化合物具有很廣泛的應(yīng)用，包括但不限于水消毒、用作清潔產(chǎn)品中的消毒劑、用作清潔劑、配制成抗微生物涂料、醫(yī)療應(yīng)用、人消費(fèi)品，用于紡織品、 油膏劑和潤(rùn)滑劑，用作催化劑等。
生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單明了、成本經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)量高、易于規(guī)模化，顆粒的尺寸和分布可控，所產(chǎn)納米銀在極低(PPb)濃度下的抗微生物活性優(yōu)于其它膠體銀產(chǎn)品。而且，該產(chǎn)物可加工成不同形式干燥形式、懸浮形式或“濕的”團(tuán)塊，可配制成不同的應(yīng)用。因?yàn)榭捎眉兯炊粏适Щ钚?，所以最終產(chǎn)物中不出現(xiàn)化學(xué)試劑殘留。
使用益生菌開創(chuàng)了保健和食品工業(yè)中的許多應(yīng)用。包被Ag的細(xì)菌產(chǎn)品尤其適合下列應(yīng)用
·配制成消毒清潔產(chǎn)品(醫(yī)院、實(shí)驗(yàn)室、動(dòng)物生產(chǎn)場(chǎng)地等)
·用于水消毒的陶瓷過(guò)濾器及其它過(guò)濾器，包括飲用水、游泳池水、動(dòng)物生產(chǎn)用水、 水產(chǎn)業(yè)飼養(yǎng)用水等
·用于消毒涂料聚合物、紡織纖維和金屬
·適合配制成消毒皮膚的油膏劑、潤(rùn)滑劑
·用于飲用水的消毒發(fā)展中國(guó)家、背包族、飛機(jī)和許多其它方面(簡(jiǎn)易方法) (easy-drop method),以及
對(duì)抗病原體軍團(tuán)菌(Legionella)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、肝炎病毒 (Hepatitis)、皰疫病毒(Herpes)、假單胞菌(Pseudomonas)、葡萄球菌(Staphylococcus), 不同類型的細(xì)菌、真菌和病毒。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供高品質(zhì)的金或銀納米顆粒。本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供改進(jìn)的制備包含膠體銀或金納米顆粒的組合物的生物學(xué)方法，，所述方法包括使用益生菌， 尤其是乳桿菌種類，如發(fā)酵乳桿菌，并將所述生物物質(zhì)與銀(I)鹽或金(III)鹽的水溶液接觸。本發(fā)明基于意想不到的發(fā)現(xiàn)生物還原制備銀或金納米顆粒的某些具體程序參數(shù)極大影響生產(chǎn)效率和得到納米顆粒的屬性。具體來(lái)說(shuō)本發(fā)明的特定方法極大影響所得含銀納米顆粒組合物的抗微生物活性。
本發(fā)明的另一方面是在這些具體條件下通過(guò)生物還原獲得的銀或金納米顆粒組合物還可進(jìn)行加工，如從生物物質(zhì)中分離而保持甚至提高其活性或其它相關(guān)特性，如儲(chǔ)存穩(wěn)定性。此外，通過(guò)氧化物質(zhì)如過(guò)氧化物或過(guò)氧酸鹽對(duì)這些具體條件下通過(guò)生物還原獲得的銀或金納米顆粒組合物進(jìn)行后期化學(xué)處理甚至可以增強(qiáng)所得納米顆粒組合物的特性。
本發(fā)明過(guò)程的還有一個(gè)優(yōu)勢(shì)是所得銀或金納米顆粒的尺寸和分布重復(fù)可控。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是所述方法通過(guò)減少對(duì)具有潛在毒性和/或昂貴化學(xué)品的需求，在明顯較短的時(shí)間內(nèi)，以低成本和環(huán)境友好的方式，得到高度可信的結(jié)果。很大程度上本發(fā)明使用的生物物質(zhì)來(lái)自于無(wú)害的微生物，如益生菌，因而本發(fā)明方法得到的組合物中無(wú)有害化學(xué)品殘留。因此本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是該方法提供了一種組合物，該組合物在應(yīng)用于真核有機(jī)體后，基本不影響此類有機(jī)體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了具有高抗微生物活性的組合物,該組合物同樣可抗海洋病原體,而基本不影響真核有機(jī)體。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，本發(fā)明可制備含高濃度納米銀或納米金的組合物，所包含的納米銀或納米金基本由其各自的金屬態(tài)組成，例如，分別的，全部銀成分中包含超過(guò)約95%的Ag°或全部金成分包含超過(guò)約95%的Auci。
本發(fā)明的另一優(yōu)勢(shì)是，所得產(chǎn)物或組合物可簡(jiǎn)單安全的加工并保持甚至提高其活性。組合物可被干燥，或保持為懸浮狀態(tài)或濕的團(tuán)塊，可被制備成不同形式的制劑，如氣溶膠制劑或浸潰到載體上，而因?yàn)榧{米銀顆粒的穩(wěn)定性可不影響其抗微生物活性。
在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及使用按照上述方法制備的膠體銀組合物作為滅藻劑或除草劑。
定義
根據(jù)本發(fā)明目的，本文所用術(shù)語(yǔ)“納米銀”或“納米Ag”指金屬銀(Ag°)的納米顆粒。本發(fā)明的含義之內(nèi)，所述納米顆?？梢曰蚩梢圆怀练e于生物物質(zhì)上。這些納米顆粒尺寸范圍為約O. Inm-約IOOnm,例如范圍為約O. 5nm_約5nm。這些納米顆粒大小在其平均尺寸附近分布。
根據(jù)本發(fā)明目的，本文所用術(shù)語(yǔ)“納米金”或“納米-Au”指金屬金(Au°)的納米顆粒。本發(fā)明的含義之內(nèi)，所述納米顆?？梢曰蚩梢圆怀恋碛谏镂镔|(zhì)上。這些納米顆粒尺寸范圍為約O. Inm-約IOOnm,例如范圍為約O. 5nm_約5nm。
根據(jù)本發(fā)明目的，本文所用術(shù)語(yǔ)“生物物質(zhì)”指包含或起源于用于制備“納米銀”或 “納米金”的細(xì)菌種類的有機(jī)材料。
根據(jù)本發(fā)明目的，本文所用術(shù)語(yǔ)“益生菌”指細(xì)菌，該細(xì)菌在給予足夠量到宿主如哺乳動(dòng)物、海洋動(dòng)物(如魚)或人時(shí)，能夠?qū)λ鏊拗鹘】诞a(chǎn)生有益效應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明目的，本文所用術(shù)語(yǔ)“銀⑴”或“Ag⑴”指單價(jià)帶正電的銀離子或Ag+。
根據(jù)本發(fā)明目的，本文所用術(shù)語(yǔ)“金⑴”或“金(III) ”分別指單價(jià)和三價(jià)帶正電金離子。
附圖
簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖I顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式利用不同濃度納米銀顆粒處理對(duì)總細(xì)胞計(jì)數(shù)和大腸桿菌存活的抗微生物效應(yīng)。
圖2顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式納米銀顆粒的X-射線衍射分析圖。
圖3顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式在制備納米銀顆粒的過(guò)程中銀與細(xì)胞干重比例對(duì)所述顆粒對(duì)抗鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)的抗菌活性的影響。
圖4顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式納米銀顆粒的X-射線衍射分析圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種制備包含膠體納米銀或納米金的組合物的簡(jiǎn)單方法，該方法包括將益生菌與包含至少4mM銀或金鹽的水溶液一起孵育的步驟。
根據(jù)本發(fā)明，合適的益生菌包括但不限于乳桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌、 酵母和桿菌。益生菌可屬于但不限于下述種清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus),乳釀乳桿菌(Lactobacilluscasei),卷曲乳桿菌 (Lactobacillus cripatus),保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillusdelbrueckii subspecies bulgaricus),發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum),格氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri),約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii),副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri),鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus),雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum),短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve),嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis),長(zhǎng)雙岐桿菌(Bifidobacterium longum),乳酸雙岐桿菌(Bifidobacterium lactis)，青春雙岐桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)，大腸桿菌(Escherichia coli) Nissle,酵母益生菌(Saccharomycesboulardii),嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus),屎腸球菌(Enterococcusfaecium),地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis),臘狀芽抱桿菌(Bacilluscereus),枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis), 巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium),嗜酸芽抱桿菌(Bacillus acidophilus),矮小芽抱桿菌(Bacilluspumilus),多發(fā)酵芽抱桿菌(Bacillus polyfermenticus),克勞氏芽抱桿菌(Bacillus clausii),側(cè)抱芽抱桿菌(Bacillus laterosporus),腐敗桿菌(Bacillussporogenes),凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulas)和多粘桿菌(Bacillus polymyxa)。
根據(jù)本發(fā)明方法不同實(shí)施方式的目的，可使用任意水溶性銀鹽。本文所用術(shù)語(yǔ)“銀鹽”也包含此類銀鹽的水合物和其它溶劑合物。通常，本文所定義的水溶性銀鹽是指，在本發(fā)明方法操作的溫度下，如室溫下，水溶性至少為O. lg/L的銀鹽。所述銀鹽包括但不限于無(wú)機(jī)銀鹽或有機(jī)銀鹽，如但不限于醋酸銀、氯化銀、高氯酸銀、氯酸銀、溴化銀、氟化銀、乳酸銀、硝酸銀、硫酸銀或酒石酸銀。
根據(jù)本發(fā)明不同實(shí)施方式的目的，可使用任意水溶性金鹽。本文所用術(shù)語(yǔ)“金鹽” 也包含此類金鹽的水合物和其它溶劑合物。通常，本文所定義的水溶性金鹽是指，在本發(fā)明方法操作的溫度下，如室溫下，水溶性至少為O. lg/L的金鹽。金鹽不限于單價(jià)或三價(jià)。金鹽不限于無(wú)機(jī)金鹽或有機(jī)金鹽或金鹽混合物可以是，例如但不限于氯化金(III)、一水合硫代蘋果酸金鈉、溴化金(III)、碘化金(III)和硝酸金(III)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，將與之孵育的銀或金鹽在水溶液中的起始濃度應(yīng)該為至少4mM，例如至少10mM，或如一個(gè)具體的例子至少為50mM。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述水溶液還可包括其它易影響行為的組分，這些行為尤其是提高所得組合物特性。出于此，在本發(fā)明中需要納米銀的一種實(shí)施方式中，該方法可包括將益生菌(如本文前述定義)與含有至少4mM銀鹽的水溶液孵育的步驟，該水溶液還可包括氨或銨鹽。適合此實(shí)施方式的銨鹽例如但不限于氯化銨、硝酸銨、磷酸銨、硫酸銨、碳酸銨、甲酸銨和溴化銨。本發(fā)明此實(shí)施方式中使用的氨和/或銨鹽的量?jī)?yōu)選足以形成大量的銀-氨或銀-銨復(fù)合物，例如但不限于形如Ag (NH2) +和/或{Ag (NH3) J +的銀⑴-氨復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明此實(shí)施方式的一個(gè)變體，與其孵育的水溶液還可包含合適量的堿金屬氫氧化物，例如但不限于氫氧化鈉或氫氧化鉀。此類合適量可定義為達(dá)到合適的PH范圍， 如下文所釋。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述方法包括將益生菌(如本文前述定義)與含至少4mM金鹽的水溶液孵育的步驟,該水溶液還可包含合適量的堿金屬氫氧化物,例如但不限于在不存在氨和/或銨鹽時(shí)的氫氧化鈉或氫氧化鉀。
合適的堿金屬氫氧化物例如但不限于氫氧化鈉或氫氧化鉀，可被加入孵育水溶液中，到濃度高至約1M。優(yōu)選的，在pH至少為8的條件下進(jìn)行孵育，例如在約8-約12的范圍，或在一個(gè)更特定的實(shí)施方式中范圍從約8. 5-約11。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，銀或金的重量與益生菌細(xì)胞干重(下文縮寫為CDW) 的比例至少約為O. 01，例如至少約為O. 05或至少約為O. I。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式， Ag = CDW或Au/CDW重量比不超過(guò)約20，優(yōu)選低于10，例如低于5。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，所述方法的孵育步驟在約5°C -約45°C的條件下進(jìn)行，優(yōu)選約15°C -約35°C，例如室溫。
作為本發(fā)明的另一實(shí)施方式，該方法的孵育步驟可在約I秒-30分鐘的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行，例如約5秒-約20分鐘。熟練技術(shù)人員可利用有限實(shí)驗(yàn)測(cè)定孵育的最佳時(shí)間，這取決于其它方法參數(shù)，例如但不限于，銀或金鹽濃度、孵育溫度、AgiCDff或Au/CDW重量比、 氨或銨鹽出現(xiàn)與否等。如本領(lǐng)域所公知，至少在部分培養(yǎng)時(shí)間在攪動(dòng)條件下進(jìn)行孵育。
本發(fā)明的方法還包括進(jìn)一步處理所得到的含膠體銀或金納米顆粒的組合物的步驟。所述進(jìn)一步處理可包括一個(gè)或多個(gè)步驟，例如但不限于，從銀或金納米顆粒中去除至少部分生物物質(zhì)，或通過(guò)機(jī)械的、酶學(xué)的和/或理化處理如超聲的方法將生物物質(zhì)分離。任意此類去除或分離生物物質(zhì)的方法為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知。另外或此外，所述加工還可包括化學(xué)處理步驟，該步驟用以穩(wěn)定或提高所得含膠體銀或金納米顆粒組合物的某些所需特性。作為此類化學(xué)處理的一個(gè)具體實(shí)施方式
，根據(jù)本發(fā)明所得的金或銀納米顆粒組合物可在孵育后處理，任選用過(guò)氧化物或過(guò)氧酸鹽等氧化物質(zhì)去除生物物質(zhì)，以產(chǎn)生具有提高的穩(wěn)定性和/或(與納米銀相比)更高抗微生物活性的銀或金納米顆粒沉淀。在本發(fā)明的實(shí)施方式范圍內(nèi)，合適的有機(jī)和無(wú)機(jī)過(guò)氧化物包括但不限于過(guò)氧化氫，過(guò)氧乙酸等?？稍诒景l(fā)明的此實(shí)施方式中使用的合適過(guò)氧酸鹽包括但不限于能夠解離后形成過(guò)氧化氫的堿性水溶性鹽，例如，當(dāng)此類鹽溶解于水時(shí)，釋放過(guò)氧化物離子。合適的例子包括與陽(yáng)離子如堿金屬結(jié)合的過(guò)碳酸鹽、過(guò)硼酸鹽、過(guò)氧硅酸鹽和過(guò)磷酸鹽。尤其優(yōu)選的是具有經(jīng)驗(yàn)式 2Na2C03 · 3!1202的過(guò)氧碳酸鈉。為了支持本發(fā)明的該實(shí)施方式，熟練技術(shù)人員了解
-在消毒能力上，此類過(guò)氧酸鹽優(yōu)于過(guò)氧化氫，
-過(guò)氧化氫是弱消毒劑并對(duì)細(xì)菌滲透力差，并且
-當(dāng)過(guò)氧酸鹽溶于水并釋放出過(guò)氧化氫時(shí)，堿金屬?gòu)尼尫诺倪^(guò)氧化氫奪取一個(gè)質(zhì)子形成氫過(guò)氧化物離子，與過(guò)氧化氫相比，該過(guò)氧化物離子是強(qiáng)消毒劑并易于滲透進(jìn)入細(xì)菌。
在本發(fā)明過(guò)程的任意時(shí)間，利用任意本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知方法可將含膠體納米銀或納米金的固體成分與液體成分分離。例如，可通過(guò)離心后傾析或通過(guò)過(guò)濾從液體組分中分離。
在本發(fā)明的方法中，通過(guò)小心調(diào)整一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)操作條件，例如但不限于pH、孵育溫度、鹽類型和鹽濃度將至少部分金或銀鹽替換為銅鹽。在本發(fā)明的方法中，通過(guò)小心調(diào)整一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)操作條件，例如但不限于pH、孵育溫度、鹽類型和(金或銀)鹽濃度將至少部分益生菌種替換為備選微生物或細(xì)菌。此類備選細(xì)菌可選自一般認(rèn)為對(duì)環(huán)境安全的細(xì)菌，更具體是那些已知具有生物還原能力的細(xì)菌。
盡管本發(fā)明的方法在本文中主要參照銀或金加以描述，但并不限制其以最廣義的表述應(yīng)用于其它金屬或金屬化合物，只要對(duì)一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)操作條件，例如但不限于pH、孵育溫度、鹽類型和鹽濃度，作適當(dāng)改變。此類改變是熟練技術(shù)人員的常規(guī)實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，假定常規(guī)教導(dǎo)被納入本文。本發(fā)明范圍內(nèi)的尤其感興趣的的金屬包括鋅、汞、銅、鈀、鉬和鉍。
基于意想不到的發(fā)現(xiàn)在抗微生物處理中此類納米銀組合物的有效濃度極低，取決于祀細(xì)菌，如約O. 5ppm或更低,例如O. 05ppm或更低，以及另一發(fā)現(xiàn)在有限時(shí)間內(nèi)，如在不多于5小時(shí)內(nèi)觀察到不良細(xì)菌量的大量減少，本發(fā)明的第二個(gè)方面是上述方法制備的納米銀組合物的抗微生物用途。本發(fā)明此方面的合適細(xì)菌靶點(diǎn)包括多數(shù)革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性菌，例如但不限于，綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)(如CMCM-2-22菌株)、洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、成團(tuán)腸桿菌 (Enterobacter agglomerans)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(如 ATCC-10031 菌株)、大腸桿菌(Eschericia coli)、|^鏈球菌(Streptococcusfaecalis)(如ATCC-10541 菌株)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(如 IP 52154 或 ATCC-6538 菌株)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) (ATCC-19659菌株)(均為常見醫(yī)院細(xì)菌菌株)、屎腸球菌(Enterococcus facium)、海氏腸球菌(Enterococcus hirae)、氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans)(如 ATCC 13661 菌株)、乳酸桿菌(Lactobacilli)、嗜熱芽抱桿菌(Thermophilic bacilli)、 指間發(fā)癖菌(Trychophyton interdigitale)(如ATCC-640菌株)、梭狀芽孢桿菌 (Clostridiumsporogenes) (ATCC-3584 菌株)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens) (ATCC-13124菌株)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、單核細(xì)胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes)等。本發(fā)明的納米銀組合物還具有對(duì)抗真菌的活性,包括例如白色念珠菌(Candida albicans)(如APCC-2091菌株)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)(如 IP 7326 菌株)，黑曲霉(Aspergillus niger)(如 218IP 菌株)、撫孢青霉菌(Penicilliumverrucosum)等，也可具有抗寄生蟲活性，對(duì)抗如埃及血吸蟲 (Schistosomahaematobium)和曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)等。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方式，所述抗微生物(或抗真菌或抗寄生蟲或抗病毒)用途可以為液體消毒組合物的形式，其中上述方法所產(chǎn)生的納米銀組合物可與第二抗微生物劑或此類試劑混合物組合。第二抗微生物劑的合適例子包括但不限于過(guò)氧化氫、 季銨鹽、過(guò)氧乙酸和過(guò)氧酸鹽(后者在本文中的本發(fā)明第一個(gè)方面已經(jīng)敘述)，及其任意已知比例的混合物。具體說(shuō)，所述組合可提供抗微生物活性的協(xié)同效應(yīng)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述第二抗微生物劑可為氧化抗微生物劑，例如但不限于，二氧化氯、一氯胺、次氯酸鹽、高錳酸鉀、碘或氯。根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方式，液體消毒組合物還可包含一種或多種穩(wěn)定劑，如磷酸、硝酸、硫酸、氫溴酸或硼酸或其混合物，即為了調(diào)整組合物的PH處于適合處理和使用的范圍。在無(wú)機(jī)酸穩(wěn)定劑中尤其優(yōu)選磷酸。實(shí)踐中，所述酸穩(wěn)定劑通常已經(jīng)以合適量摻入到市售過(guò)氧化氫級(jí)別中。本發(fā)明任選使用的穩(wěn)定劑還可為有機(jī)羧酸，如酒石酸、檸檬酸(或其水合物)、苯甲酸、皮考啉酸、煙堿酸和異煙堿酸。出于同樣目的也考慮使用有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸的混合物。當(dāng)出現(xiàn)時(shí)，所述穩(wěn)定劑的量?jī)?yōu)選能有效調(diào)整液體消毒組合物的PH和 /或長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。本發(fā)明的這些消毒液體組合物還可包含至少一種選自表面活性劑、 防腐劑或香料(香水)的成分。
適合用于本發(fā)明消毒組合物的表面活性劑包括，例如但不限于陽(yáng)離子型、非離子型、兼性的、或兩性離子表面活性化合物，優(yōu)選在相關(guān)濃度適合接觸食品或飲用水的那些化合物及此類化合物的混合物。本文潛在使用的是多種非離子表面活性劑。陰離子表面活性劑的非限制性例子包括，例如，選自聚乙氧基化和/或聚丙氧基化的二醇、C8-C20脂肪酸單酯、失水山梨醇單棕櫚酸酯等。合適的兼性表面活性劑的具體例子包括3-十二烷基氨基丙酸鈉、3-十二烷基氨基丙磺酸鈉、N-烷基牛磺酸和甜菜堿。
獲自本發(fā)明方法的含納米銀的消毒組合物可在生物基質(zhì)中穩(wěn)定，可直接或按照上文所述進(jìn)一步處理后，用于處理、清潔或消除環(huán)境污染。例如納米銀顆粒可分散于必須通過(guò)任意合適方法或應(yīng)用方法去除細(xì)菌的地點(diǎn)或其附近。組合物中的納米銀組分可與細(xì)菌細(xì)胞組分相互作用，從而能有效破壞它們并減少細(xì)菌總細(xì)胞數(shù)至可接受水平。
使用如上述含納米銀的液體組合物可進(jìn)行固體表面或一定體積的氣體或液體的清潔、去污染、消毒或滅菌。當(dāng)所述本發(fā)明液體組合物用于消毒或滅菌組合物時(shí)(如分散進(jìn)入液體或氣體中)，常常在合適條件下，包括濃度和應(yīng)用時(shí)間進(jìn)行應(yīng)用，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過(guò)滅菌和消毒的標(biāo)準(zhǔn)知識(shí)易于確定這些條件。
當(dāng)在固體表面上應(yīng)用本發(fā)明包含納米銀的消毒液體組合物時(shí)，為安全規(guī)范起見優(yōu)選使用即用型稀釋配方，該配方通過(guò)下述方法獲得將合適量的濃縮組合物與水混和，然后用所獲稀釋制劑潤(rùn)濕所述固體表面直至固體表面全部變濕(如熟練技術(shù)人員所知，取決于表面的孔隙度)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將知道，根據(jù)固體表面出現(xiàn)的或要處理液體和氣體中出現(xiàn)的微生物類型和量的不同，包含納米銀的消毒液體組合物的優(yōu)選使用量也很大程度不同。
根據(jù)本發(fā)明上述內(nèi)容使用包含納米銀的液體組合物作為消毒劑時(shí)，更特別推薦下述應(yīng)用
-將要處理的產(chǎn)品浸入所述包含納米銀的組合物中，
-將消毒組合物噴霧至要處理的固體表面，及
-將消毒組合物(稀釋的或濃縮的)摻入到要處理的水中(尤其是游泳池水、工業(yè)處理水、廢水等)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的包含納米銀的消毒液體組合物尤其可用于
(a)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)所、工業(yè)場(chǎng)所(如牛奶廠，奶酪廠，麥芽作坊，釀酒廠，礦物水、 酒、酒精、水果和蔬菜汁的生產(chǎn)場(chǎng)所，溫室，牛棚，雞舍和馬廄)；食品、飲料和制藥包裝生產(chǎn)線、飛機(jī)和船的內(nèi)部)以及所述場(chǎng)所的內(nèi)容物，尤其時(shí)所述場(chǎng)所的設(shè)備和儀器的消毒和衛(wèi)生；
(b)無(wú)菌外殼的消毒如未成熟動(dòng)物或無(wú)菌動(dòng)物生長(zhǎng)的培養(yǎng)箱；
(C)空調(diào)系統(tǒng)中軍團(tuán)菌的處理；
(d)儲(chǔ)存容器(尤其是筒倉(cāng))和傳送液體或固體產(chǎn)品如食品(糖、茶、咖啡、谷物、 飲料)和動(dòng)物飼料的管線的消毒和衛(wèi)生；10
(e)游泳池和其它淋浴設(shè)備的消毒和衛(wèi)生，這時(shí)優(yōu)選無(wú)表面活性劑的組合物；
(f)飲用水的生產(chǎn)、運(yùn)送和儲(chǔ)存系統(tǒng)(例如井或者儲(chǔ)存容器)的消毒，這時(shí)優(yōu)選無(wú)表面活性劑的組合物 '及
(g)保護(hù)戶外作物(如谷物、番茄、香蕉園、溶液培養(yǎng)物如苣荬菜、種子和塊莖等) 不受細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲的傷害。
除了廣泛的工業(yè)應(yīng)用外，本發(fā)明方法獲取的選擇性的高抗微生物活性也具有廣泛的家庭用途，例如但不限于水消毒、水中除藻、清潔產(chǎn)品及抗微生物涂層涂料制劑，如用于醫(yī)療用途或處理人用或動(dòng)物用的營(yíng)養(yǎng)或其它材料(特別因?yàn)閷?duì)于真核細(xì)胞或有機(jī)體沒(méi)有影響或影響極小)，用于紡織產(chǎn)品的抗微生物保護(hù)，用于防止暴露組織發(fā)生感染或微生物污染的外用醫(yī)療制劑中，例如，但不限于，乳膏劑、油膏劑或洗劑，或用作化學(xué)或其它轉(zhuǎn)化過(guò)程的催化劑。通過(guò)納米銀懸浮物將納米銀摻入聚合物和/或其它類型涂料中實(shí)現(xiàn)上述各種應(yīng)用。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及用益生菌和其它細(xì)菌制備金屬納米沉淀，令人驚訝的是，該金屬納米沉淀可作為滅藻劑(抗小球藻(Chlorella vulgaris),但不限于此)，用于飲用水、魚池或池塘或游泳池水，淡水或咸水水庫(kù)，聚合物和油漆，表面涂料和其它需要保護(hù)的材料，防止軟垢(美觀方面)或硬垢(材料退化)。本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及用益生菌和其它細(xì)菌制備金屬納米沉淀，令人驚訝的是，該金屬納米沉淀可作為除草劑對(duì)抗雙子葉或單子葉植物或?qū)共煌愋偷牡偷戎参?，如苔蘚，可稀釋在水中或進(jìn)一步用機(jī)械、 酶學(xué)和/或物理化學(xué)的方法處理。據(jù)此目的對(duì)相關(guān)植物進(jìn)行的選擇并非本發(fā)明的關(guān)鍵參數(shù)。以此目的的合適植物包括雙子葉植物如煙草(Nicotianatabacum)、鴨子草(Lamna sp.)、大豆(Glycine max)、蘋果、甜菜、擬南芥、苜猜、矮牽?；?、棉花、胡蘿卜、療菜、甘藍(lán)、黃瓜、胡椒、卡諾拉(canola)、番茄、馬鈴薯、扁豆、亞麻、椰菜、大豆、萵苣、油菜、花椰菜、菠菜、抱子甘藍(lán)、菊芋、豌豆、黃秋葵、南瓜、羽衣甘藍(lán)、茶樹、咖啡和卷柏(Selaginella Iepidophylla)。也可包括單子葉植物,如水稻(rice Oryza sativa)、玉米、大麥、玉蜀黍、 向日葵(Helianthus annuus)、小麥、燕麥、粟、高粱、覓菜、洋蔥、蘆笑和甘鹿。
本發(fā)明的上述方面在如下領(lǐng)域尤其有用
-在以下系統(tǒng)中抑制藻類的生長(zhǎng)魚池水、動(dòng)物和人飲用水分布系統(tǒng)、園藝水分布系統(tǒng)、池塘、游泳池、池塘或游泳池的水處理過(guò)濾系統(tǒng)、或不同類型灑水系統(tǒng)；
-抑制表面，包括與水接觸的表面，如船體的藻類生長(zhǎng)；
-用于處理表面防止水藻，包括防止類似植物的高等生物體表面的藻類生長(zhǎng)的油漆、聚合物和涂料；
-抑制苔蘚或其它不良植物的生長(zhǎng)，包括雙子葉和單子葉植物，具體是將葉、莖或根系統(tǒng)暴露于膠體銀，例如根據(jù)上述生產(chǎn)方法由益生菌生產(chǎn)并沉淀其上的膠體銀；以及
-通過(guò)涂布或其它方式將這些表面暴露于膠體銀抑制某些植物或雜草在表面上的生長(zhǎng)，所述膠體銀包括例如，根據(jù)上述生產(chǎn)方法由細(xì)菌生產(chǎn)并沉淀其上的膠體銀。
下列實(shí)施例用以說(shuō)明本發(fā)明方法和消毒組合物的某些實(shí)施方式，但不作任何限制。
實(shí)施例I—納米銀的制備
發(fā)酵乳酸桿菌Beijerinck 190IAL (ATCC 11976，LMG 8900，來(lái)自8天大母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道)培養(yǎng)物在MRS肉湯(購(gòu)自英國(guó)貝辛斯托克的奧科斯得(Oxoid,Basingstoke, United Kingdom))中微好氧性條件下37°C培養(yǎng)15小時(shí)。3，OOOg 15°C離心10分鐘從MRS中收集細(xì)胞，用milliQ水洗滌兩次，然后重懸于milliQ水中使其最終光密度在600nm(0D_) 為I. 5。將IN氫氧化鈉母液中加入到細(xì)胞懸液中，如終濃度分別為O. 05N NaOH和O. ION NaOH。
在5OmL milliQ 水中制備 425mg AgNO3 和 225mg NH4Cl 的 Ag(I)母液。將 I 體積的這種Ag (I)母液分別加入到含O. 05和O. ION NaOH的10體積細(xì)胞懸液中。25°C將這些混合物在可見光下孵育，溫和攪拌(攪拌器上每分鐘100轉(zhuǎn))30分鐘。獲得5. OmM Ag(O) (535mg Ag(O)/L)沉積于發(fā)酵乳桿菌生物物質(zhì)上的最終溶液，本文稱作“納米銀”或“納米-Ag”。 將包被的發(fā)酵乳桿菌細(xì)胞離心，通過(guò)重復(fù)離心、傾析并將組合物重懸于新鮮milliQ水用 milliQ水洗滌三次去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基殘留和其它添加劑。然后調(diào)整最終的納米Ag濃度。然后根據(jù)需要用milliQ水稀釋組合物或?qū)⑵?，OOOg離心濃縮后重懸于milliQ水中。
實(shí)施例2-納米銀XRD分析
將實(shí)施例I中所得具有銀顆粒的生物物質(zhì)進(jìn)一步30°C干燥后，用配備布拉格-布倫特(Bragg-Brentano)光學(xué)系統(tǒng)的西門子D5000衍射儀(購(gòu)自西門子公司，德國(guó)慕尼黑市)進(jìn)行X-射線衍射(XRD)。X-射線由功率為1.6kW(40kV，40mA)的銅X-射線管產(chǎn)生。在 25-90度2 Θ之間進(jìn)行測(cè)量，“t印時(shí)間” (tep time)為I. 6秒，以O(shè). 02度大小步進(jìn)。所得光譜(未顯示)表明了金屬銀和氧化鈉X-射線衍射圖樣的存在。后者是制備納米銀所使用的氫氧化鈉殘余。
實(shí)施例3-納米銀的EDX分析
將實(shí)施例I中所得具有納米銀的干燥生物物質(zhì)進(jìn)一步30°C干燥后，用配備對(duì)應(yīng)入射能量20. OkeV分辨率的EDX檢測(cè)器的JSM6100掃描電子顯微鏡(購(gòu)自美國(guó)焦耳公司(JE0L USA, Inc.))進(jìn)行能量散射X-射線(EDX)分析。分析結(jié)果如表I所示(同時(shí)表示為質(zhì)量％ 和原子％)，清晰表明主要存在有機(jī)物質(zhì)(因?yàn)樘己脱醯暮扛?和銀，其組合總計(jì)占干物質(zhì)重量的91%。剩余干燥物質(zhì)由痕量元素Ca、Mg、Si、P、S和Cl組成，主要是因?yàn)楦稍锷锘|(zhì)中的礦物質(zhì)殘余。
表I
權(quán)利要求
1.一種用細(xì)菌在細(xì)菌膜上生產(chǎn)膠體金屬或膠體金屬化合物的方法，所述方法是通過(guò)在受控PH下將所述細(xì)菌與所述金屬或金屬化合物接觸。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，所述金屬或金屬化合物中的金屬是銀。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，所述金屬或金屬化合物中的金屬選自金、鋅、汞、銅、鈀、鉬和鉍。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的方法，所述細(xì)菌屬于乳桿菌。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的方法，所述受控pH為8至12。
6.如權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中接觸的時(shí)間為I秒至30分鐘。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，所述金屬化合物是硝酸銀。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，所述金屬化合物氯化金。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過(guò)將金屬或金屬化合物與細(xì)菌接觸制備含有金屬(包括銀、金、鋅、汞、銅、鈀、鉑或鉍)膠體納米顆粒的組合物的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包含將益生菌與含有至少4mM銀或金鹽的水溶液孵育的步驟。所得到的含納米銀的組合物，例如浸漬到載體上時(shí)，可用作高效抗微生物劑、滅藻劑或除草劑。
文檔編號(hào)C12R1/225GK102978241SQ20121044864
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2007年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月5日
發(fā)明者W·德溫特, T·韋科特恩, W·韋斯特雷特 申請(qǐng)人:詹森藥業(yè)有限公司