專利名稱：建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法
建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物技術(shù)病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明具體涉及一種環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術(shù)檢測李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前對病毒核酸的分子檢測多采用基于PCR反應(yīng)的各類技術(shù)，如常規(guī)PCR、巢式PCR、實時熒光PCR等，不僅需要PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等昂貴的儀器設(shè)備，且操作程序繁瑣復(fù)雜、時間長，對檢測人員較高的技術(shù)要求，大大限制了作為快速診斷方法的使用和推廣。環(huán)介導等溫擴增(LAMP)是Notomi等在2000年開發(fā)的一種恒溫核酸擴增方法，具有特異性強、操作簡單、不需要復(fù)雜的儀器，肉眼可直接觀察檢測結(jié)果，其高效性、簡易性、 成本低廉且檢測周期短等特點非常適合于基層及現(xiàn)場使用；該技術(shù)針對目的基因的6個區(qū)段，設(shè)計4條特異引物并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在一定溫度下對核酸進行等溫擴增；最近幾年已開始應(yīng)用于生物致病病原的檢測。此前，已有應(yīng)用在肺炎鏈球菌、西尼羅病毒、SARS病毒、番茄黃葉病毒、山藥嵌紋病毒、肺炎支原體等病原微生物的檢測以及登革病毒的分型等方面的報道，日前，尚未見利用LAMP技術(shù)檢測李屬壞死環(huán)斑病毒的報道。李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)是《中華人民共和國進境植物檢疫危險性病、蟲、雜草名錄》中二類危險性檢疫對象，也是世界上許多國家進口的檢疫對象。PNRSV屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬(Ilarvirus),粒體形態(tài)為等軸對稱多面體，直徑約為22-23nm，有三種大小的粒子。PNRSV是正單鏈的RNA病毒，核酸大小為8. 056kb，為三分體線形。PNRSV通過種子及苗木等無性繁殖材料進行遠距離傳播，還可以經(jīng)花粉、蟲媒、嫁接、機械接種等迅速傳播蔓延。PNRSV可侵染扁桃、櫻桃、桃、李、杏等多種果樹和西(甜)瓜、棉花、向日葵、菜豆、啤酒花等21個科、47個屬189種植物，具有寄主范圍廣泛、侵染傳播力強、危害嚴重、檢疫和防控難度大等特點。果樹一經(jīng)感染便終生帶毒、逐年加重、持久危害，引起葉片壞死環(huán)斑和穿孔，果實畸形，品質(zhì)下降，腐爛加快，樹體急劇衰退，提早枯死，一般可造成30% 70%的產(chǎn)量損失，嚴重的可導致樹皮壞死、癌腫直至整株絕產(chǎn)、枯死，為果樹生產(chǎn)中的一種毀滅性病害。目前該病害的發(fā)生已遍及歐洲、亞洲、非洲、南美和北美洲及大洋洲的40多個溫帶國家和地區(qū)。在中國PNRSV目前還僅限于個別地區(qū)發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
目前針對現(xiàn)有技術(shù)中未見專門針對環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術(shù)檢測李屬壞死環(huán)斑病毒的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，進行快速、特異、靈敏、簡便的現(xiàn)場檢測，克服已有技術(shù)的不足。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明根據(jù)PNRSV分離物CP基因的保守序列，設(shè)計了 PNRSV RT-LAMP特異性引物，確定反應(yīng)條件和試劑濃度并進行優(yōu)化，建立了 PNRSV的RT-LAMP快速檢測體系，此方法對PNRSV的檢測特異性強，2h即可獲得檢測結(jié)果，具有快速、聞效、簡易的特點。本發(fā)明提供了一種建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，包括以下步驟(I)提供一套用于檢測李屬壞死環(huán)斑病毒的LAMP反應(yīng)特異性引物序列，具體的寡聚核苷酸序列為F3 AATCATACCCACGCTGGTGB3 AATTCGGGGAGGCACATTC FIP TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC-TTGCAAGAAGTGCCATCCGBIP TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-TCACGGTCCAAGTGGTCT (2)提供李屬壞死環(huán)斑病毒的LAMP檢測方法，即首先從待檢測樣品中制備反應(yīng)模板，并配制LAMP反應(yīng)體系，然后通過LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進行擴增。(3)最后根據(jù)反應(yīng)混合物的濁度對檢測結(jié)果進行判斷。本發(fā)明具體提供了一種建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，包括以下步驟(I)設(shè)計用于檢測李屬壞死環(huán)斑病毒的的LAMP引物根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)報道及GenBank中公布的PNRSV分離物的CP基因保守序列，利用LAMP引物設(shè)計軟件PrimerExplorer V4設(shè)計I套特異性引物，包括I對外引物和I對內(nèi)引物，引物序列如下(5, -3')F3 AATCATACCCACGCTGGTGB3 AATTCGGGGAGGCACATTCFIP TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC-TTGCAAGAAGTGCCATCCGBIP TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-TCACGGTCCAAGTGGTCT(2)植物總RNA的提取取O. Ig新鮮植物葉片或幼嫩枝條在液氮中研磨至粉末，米用 RNAplant plus Reagen 試劑盒(Plant Genomic DNA Kit, TIANGEN)提取樣品總 RNA,抽提RNA產(chǎn)物加入DEPC-ddH20溶解，_70°C保存?zhèn)溆谩?3)逆轉(zhuǎn)錄以提取的植物總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA序列。20 μ L的反轉(zhuǎn)錄體系為 RNA 模板 2 μ L，IOmmoI/L 的 dNTP I μ L, 50 μ mol/L 的 OligodT I μ L, DEPC_ddH2010 μ L, 65°C下處理 5min,冰上放置 5min,加 A 5 X first-strand Buffer 4 μ L, 200U/ μ L的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶I μ L，40U/ μ L的RNA酶抑制劑I μ L ;反應(yīng)條件在30°C放置lOmin，42°C保溫lh，再于95°C反應(yīng)5min。(4)配制LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)體系為27uL，各組分的用量為10XBuffer緩沖液 2. 5uL,采用步驟(3)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 5. OuL, 2. 5mmol/L 的 dNTP6. OuL, 10 μ mol/L 的引物 F3、B3 各 0. 5uL, 10 μ mol/L 的引物 FIP、BIP 各 4. OuL, 100 μ mol/L 的 Betain 5. OuL,IOOmmoI/L的MgSO4L 5uL,8U/y L的Bst DNA聚合酶I. OuL,同時設(shè)置陰性對照。(5)通過LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進行擴增LAMP反應(yīng)程序95°C加熱5min ;冰上急冷3min，再加l.OyL Bst DNA聚合酶，65°C水浴反應(yīng)I. 5h，80°C滅活2min。(6)LAMP擴增產(chǎn)物的檢測通過上述步驟擴增結(jié)束后肉眼觀察反應(yīng)管濁度的變化；將擴增產(chǎn)物高速離心后觀察管底有無焦磷酸鎂白色沉淀，如出現(xiàn)白色沉淀即判斷檢測結(jié)果為陽性，即樣品中感染有李屬壞死環(huán)斑病毒，反之則為陰性。通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下效果本發(fā)明針對目的基因PNRSV的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫65°C左右,幾十分鐘即可實現(xiàn)核酸的高效擴增；4條引物對靶序列的6個特異序列區(qū)域的識別，保證了 LAMP擴增的高度特異性；LAMP不需要模板的熱變性，長時間溫度循環(huán)，在等溫條件下擴增，不會因溫度改變而造成時間的浪費，使反應(yīng)速度可提高30-50% ;根據(jù)反應(yīng)管中有無肉眼可見的焦磷酸鎂白色沉淀或在產(chǎn)物中加入熒光染料SYBYGreen I，作為判斷核酸是否擴增的簡單方法；該技術(shù)已開始應(yīng)用于植物檢疫、動物疫病的診斷、動物性別鑒定和轉(zhuǎn)基因食品檢測等方面，取得了可喜的成就，顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，具體闡述如下(I)特異性強。所用的特異引物根據(jù)PNRSV殼體蛋白基因中6個不同區(qū)域設(shè)計，特異性超過常規(guī)PCR。 (2)檢測快捷。從RNA的提取，到檢測完畢用時約2h，而RT-PCR需要5h以上，節(jié)省檢測時間。(3)儀器要求簡易。不需要普通PCR所用的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，只要水浴鍋或金屬浴就能完成檢測反應(yīng)。(4)操作簡便、結(jié)果明顯。整個檢測過程不涉及復(fù)雜儀器或設(shè)備，稍具分子生物學基礎(chǔ)的人員即可完成操作；檢測結(jié)果清晰，直接用眼睛觀察就得以判斷。(5)對人和環(huán)境安全。避免了常規(guī)PCR檢測過程使用溴化乙錠等有毒化學藥品，對人和環(huán)境都較為安全。(6)低成本。LAMP檢測總成本大大低于現(xiàn)有的PCR檢測方法?？傊?，該方法具有比現(xiàn)有技術(shù)中報道的普通PCR檢測方法更高的特異性、簡便易行、快捷等優(yōu)點。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，％皆指質(zhì)量百分比。儀器設(shè)備植物總RNA提取試劑盒，dNTPs購自北京天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BioTeke super RT Kit)購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。Bst DNA聚合酶大片段為北京紐英倫NEB生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。試驗材料以采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)檢測到的含有PNRSV的扁桃葉片為材料，健康扁桃葉片為陰性對照。本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。實施例一建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，包括以下步驟設(shè)計用于檢測李屬壞死環(huán)斑病毒的的LAMP特異性引物根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)報道及GenBank中公布的PNRSV分離物的CP基因保守序列，利用LAMP引物設(shè)計軟件Primer Explorer V4設(shè)計I套特異性引物,包括I對外引物和I對內(nèi)引物，引物序列如下(5' -3')F3 AATCATACCCACGCTGGTGB3 AATTCGGGGAGGCACATTCFIP TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC-TTGCAAGAAGTGCCATCCGBIP TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-TCACGGTCCAAGTGGTCT(2)植物總RNA的提取取O. Ig新鮮感病扁桃葉片或幼嫩枝條在液氮中研磨至粉末,采用RNAplantplusReagen試劑盒(Plant Genomic DNA Kit, TIANGEN)提取樣品總RNA。抽提RNA產(chǎn)物加入DEPC-ddH20溶解，_70°C保存?zhèn)溆?。以健康扁桃葉片為陰性對照，且設(shè)置已知感染了李屬壞死環(huán)斑病毒的扁桃葉片為陽性對照。
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(3)逆轉(zhuǎn)錄已提取的上述植物總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA序列。20 μ L的反轉(zhuǎn)錄體系為RNA 模板 2μ L，10mmol/L 的 dNTP I μ L，50 μ mol/L 的 OligodT I μ L，DEPC_ddH20 10 μ L,65°C 下處理 5min，冰上放置 5min，加入 5 X f irst-strandBuffer 4μ L,200U/y L 的 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶I μ L,40U/yL的RNA酶抑制劑I μ L ;反應(yīng)條件在30°C放置10min，42°C保溫lh，再于95°C反應(yīng)5min。(4)配制LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)體系為27uL，各組分的用量為=IOXBuffer緩沖液2. 5uL，按照步驟(3)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA5. OuL, 2. 5mmol/L 的 dNTP6. OuL, 10 μ mol/L 的引物 F3、B3 各 0. 5uL, 10 μ mol/L 的引物 FIP,BIP 各 4. OuL, 100 μ mol/L 的 Betain5. OuL, IOOmmoI/L 的 MgSO4L 5uL, 8U/ μ L的Bst DNA聚合酶I. OuL,同時設(shè)置陰性對照。(5)通過LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進行擴增LAMP反應(yīng)程序95°C加熱5min ;冰上急冷3min，再加I. O μ L Bst DNA聚合酶，65°C水浴反應(yīng)I. 5h,80°C滅活2min。(6) LAMP擴增產(chǎn)物的檢測擴增結(jié)束后肉眼觀察反應(yīng)管濁度的變化。將擴增產(chǎn)物高速離心后觀察管底有無焦磷酸鎂白色沉淀。如在被檢測樣品和陽性對照反應(yīng)管中均出現(xiàn)白色沉淀，而陰性對照反應(yīng)管中無白色沉淀，即判斷檢測結(jié)果為陽性，即樣品中感染李屬壞死環(huán)斑病毒；如在被檢測樣品反應(yīng)管中出現(xiàn)白色沉淀，而陽性對照管、陰性對照反應(yīng)管中均未出現(xiàn)白色沉淀，則為假陽性，即樣品中未感染李屬壞死環(huán)斑病毒；如在被檢測樣品、陽性對照管、陰性對照反應(yīng)管中均未出現(xiàn)白色沉淀，則為陰性，即樣品中未感染李屬壞死環(huán)斑病毒。實施例二 LAMP檢測體系的優(yōu)化通過對構(gòu)建體系的主要影響的三個因素BstDNA聚合酶濃度、cDNA加入量、反應(yīng)時間長短進行實驗、篩選，每個影響因素設(shè)置梯度。參見表I。表I Bst DNA聚合酶、cDNA加入量、反應(yīng)時間梯度
權(quán)利要求
1.一種建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，具體檢測方法步驟如下 (1)設(shè)計用于檢測李屬壞死環(huán)斑病毒的的LAMP引物根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)報道及GenBank中公布的PNRSV分離物的CP基因序列的CP基因保守序列，利用LAMP引物設(shè)計軟件Primer Explorer V4設(shè)計I套特異性引物,包括I對外引物和I對內(nèi)引物，引物序列如下(5, -3')F3 AATCATACCCACGCTGGTGB3 AATTCGGGGAGGCACATTCFIP TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC-TTGCAAGAAGTGCCATCCGBIP TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-TCACGGTCCAAGTGGTCT ； (2)植物總RNA的提取取O.Ig新鮮植物葉片或幼嫩枝條在液氮中研磨至粉末，采用RNAplant plus Reagen試劑盒提取樣品總RNA，通過抽提RNA產(chǎn)物加入DEPC_ddH20溶解，_70°C保存?zhèn)溆茫? (3)逆轉(zhuǎn)錄以提取的植物總RNA為模板，建立反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA序列，.20 μ L的反轉(zhuǎn)錄體系； (4)配制LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)體系為27uL，各組分的用量為=IOXBufTer緩沖液.2.5uL ； (5)通過LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模板進行擴增； (6)通過上述步驟擴增結(jié)束后肉眼觀察反應(yīng)管濁度的變化，進行LAMP擴增產(chǎn)物的檢測。
2.如權(quán)利要求I所述的建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述的反轉(zhuǎn)錄體系為RNA模板2 μ L，I Ommo I/L的dNTP IyL, 50 μ mo I/L的OligodT I μ L，DEPC_ddH20 10 μ L，65°C下處理 5min，冰上放置 5min，加入 5 X f irst-strandBuffer 4 μ L，200U/ μ L的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶I μ L，40U/ μ L的RNA酶抑制劑I μ L ;反應(yīng)條件在30°C放置10min，42°C保溫lh，再于95°C反應(yīng)5min。
3.如權(quán)利要求I所述的建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述的LAMP反應(yīng)體系為，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 5. OuL, 2. 5mmol/L的dNTP6. OuL,10 μ mol/L 的引物 F3、B3 各 O. 5uL, 10 μ mol/L 的引物 FIP、BIP 各 4. OuL, 100 μ mol/L 的Betain5. OuL, IOOmmoI/L 的 MgSO4L 5uL, 8U/ μ L 的 Bst DNA 聚合酶 I. OuL,同時設(shè)置陰性對照。
4.如權(quán)利要求I所述的建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述的LAMP反應(yīng)程序95°C加熱5min ;冰上急冷3min，再加l.OyL Bst DNA聚合酶，65°C水浴反應(yīng)I. 5h，80°C滅活2min。
5.如權(quán)利要求I所述的建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述的根據(jù)反應(yīng)混合物品示的反應(yīng)管濁度的變化對檢測結(jié)果進行判斷，通過擴增結(jié)束后肉眼觀察反應(yīng)管濁度的變化；將擴增產(chǎn)物高速離心后觀察管底有無焦磷酸鎂白色沉淀，如出現(xiàn)白色沉淀即判斷檢測結(jié)果為陽性，即樣品中感染有李屬壞死環(huán)斑病毒，反之則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種建立李屬壞死環(huán)斑病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，本發(fā)明針對目的基因PNRSV的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫65℃左右，幾十分鐘即可實現(xiàn)核酸的高效擴增；4條引物對靶序列的6個特異序列區(qū)域的識別，保證了LAMP擴增的高度特異性；LAMP不需要模板的熱變性，長時間溫度循環(huán)，在等溫條件下擴增，不會因溫度改變而造成時間的浪費，使反應(yīng)速度可提高30-50％；根據(jù)反應(yīng)管中有無肉眼可見的焦磷酸鎂白色沉淀，作為判斷核酸是否擴增的簡單方法；提供的方法對PNRSV的檢測特異性強，具有快速、高效、儀器要求簡易，操作簡便，成本低，易于在基層推廣使用的特點。
文檔編號C12Q1/70GK102925589SQ20121045138
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者羅明, 殷智婷, 韓劍, 周國輝, 張祥林, 董代幸 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學