專利名稱：用于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種-NH2化學(xué)基團(tuán)修飾的細(xì)胞培養(yǎng)載體及其制備方法，以及所述的細(xì)胞培養(yǎng)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中的應(yīng)用，特別是所述細(xì)胞培養(yǎng)載體在促進(jìn)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的粘附、遷移和分化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells, NSCs)作為種子細(xì)胞聯(lián)合組織技術(shù)是治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性疾病最有前途的方法之一。眾所周知，細(xì)胞的粘附、遷移和分化能力與其所處的周圍微環(huán)境尤其是所用生物材料表面物理化學(xué)特性有著密切的關(guān)系。已有報道表明生物材料表面特性影響微環(huán)境中的蛋白的吸附可引發(fā)不同的細(xì)胞應(yīng)答，因此，一些具有生物活性的片段如肽鏈、多聚氨基酸甚至活性化學(xué)官能基團(tuán)被引入生物材料，并試圖通過控制細(xì)胞與材料表面間的相互作用而達(dá)到控制細(xì)胞行為的目的，而這些片段之所以具有生物活性功能，是由于其功能基團(tuán)如羧基、羥基、氨基(-NH2)與微環(huán)境中利于細(xì)胞生長的粘附分子結(jié)合而發(fā)揮作用。已有報道表明，貼壁粘附是NSCs分化的前提之一，而不同化學(xué)功能基團(tuán)對NSCs的行為具有不同的影響，相對于其他化學(xué)活性基團(tuán)，-NH2能夠明顯促進(jìn)NSCs在經(jīng)化學(xué)修飾后在蓋玻片上粘附和遷移，并似乎能提高神經(jīng)元的分化比例，原因可能是由于細(xì)胞表面帶負(fù)電荷，因此，具有正電荷特性和最大活性的官能基團(tuán)-NH2，可能最適合細(xì)胞粘附。由于細(xì)胞之間信息傳遞對細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞生物學(xué)行為起著非常重要的作用，改變材料和局部接種細(xì)胞的密度可能會影響神經(jīng)干細(xì)胞粘附、遷移、增值和分化。而在以往的報道中，在研究材料表面化學(xué)基團(tuán)與細(xì)胞之間的相互作用時，使用的是含血清培養(yǎng)基或是包含粘附蛋白的培養(yǎng)基，因此，很難區(qū)分是化學(xué)基團(tuán)還是粘附因子的作用改變了細(xì)胞行為
發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，我們將NSCs種植在經(jīng)化學(xué)修飾后具有不同密度的-NH2蓋玻片上，觀察不同密度的-NH2基團(tuán)在無血清培養(yǎng)條件下對NSCs粘附、遷移、增殖和分化等生物學(xué)行為的影響，從而確定-NH2作為一種適合細(xì)胞貼壁的化學(xué)修飾基團(tuán)，對神經(jīng)干細(xì)胞在材料表面的附著密度，及生物學(xué)行為的調(diào)控作用。更具體而言，本發(fā)明涉及一種-NH2化學(xué)基團(tuán)修飾的細(xì)胞培養(yǎng)載體及其制備方法，以及所述的細(xì)胞培養(yǎng)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中的應(yīng)用，特別是所述細(xì)胞培養(yǎng)載體在促進(jìn)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的粘附、遷移和分化中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的-NH2化學(xué)基團(tuán)修飾的細(xì)胞培養(yǎng)載體的制備方法如下:步驟一，將蓋玻片(石英蓋玻片，大小22*22mm)浸泡在I %十二烷基硫酸鈉(Sigma，USA)溶液中30分鐘，隨后再將其浸泡在0.1M鹽酸溶液中30分鐘，然后用雙蒸水洗3遍，吹干，備用;
步驟二，將經(jīng)上述步驟一處理后的得到的潔凈蓋玻片浸泡在> 70%的濃硫酸溶液和30%雙氧水溶液中使之羥基化10分鐘，再浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(Sigma，USA)中化學(xué)連接-NH2，去離子水清洗三遍，75%酒精隔夜清洗消毒，氮氣吹干，即獲得所述的NSCs細(xì)胞培養(yǎng)載體。所述的浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷中化學(xué)連接-NH2的步驟為，連接反應(yīng)時間為2 14小時，優(yōu)選為12小時；反應(yīng)溫度為4 40°C，優(yōu)選為25°C;反應(yīng)底物3-氨基丙基三乙氧基硅烷的濃度為05 20%，優(yōu)選為20%。本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)載體在培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中的應(yīng)用方法如下，培養(yǎng)NSCs前，將所述載體放入培養(yǎng)板(Corning，USA)內(nèi)，75%酒精隔夜消毒后用無菌緩沖磷酸鹽溶液(PBS緩沖液，pH7.2-7.4)徹底清洗后備用。將細(xì)胞系形式增殖的神經(jīng)干細(xì)胞(天壇神經(jīng)外科研究所，干細(xì)胞室提供)在預(yù)冷的Hank’ s平衡鹽液(pH7.2)中吹打成單細(xì)胞懸液，在無血清培養(yǎng)基(DMEN/F12，HyClone)條件下接種于上述放入所述載體的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。需要指出的是，上述細(xì)胞系僅為例舉所用，本發(fā)明所述的載體材料并不僅限于培養(yǎng)所述神經(jīng)干細(xì)胞，申請入的相關(guān)工作表明，本發(fā)明所述的載體材料在培養(yǎng)例如CHB、HUES系列的干細(xì)胞(NIH干細(xì)胞庫來源的干細(xì)胞株,可參見http://stemcells.nih.gov)時也獲得了比較好的結(jié)果。采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)載體，對神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)過程及培養(yǎng)結(jié)果如下:
培養(yǎng)的第I天，有大量的神經(jīng)球貼壁，大量的細(xì)胞從神經(jīng)球中游走出來，并有突起伸出，牢固貼附于載體材料表面。至第5天時，有更多的細(xì)胞遷移出來并網(wǎng)狀交織在一起。神經(jīng)球中遷移出來的細(xì)胞會向神經(jīng)細(xì)胞分化，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。材料表面的-NH2濃度會影響神經(jīng)球中遷移出來細(xì)胞向神經(jīng)元的分化比例。


圖1，修飾后蓋玻片的表面特性檢測結(jié)果:水接觸角(water contact angle,WCA)；圖2，修飾后蓋玻片的表面特性檢測結(jié)果:傅立葉變換紅外光譜(Fouriertransform infrared spectroscopy, FT IR)；圖3,修飾后蓋玻片的表面特性檢測結(jié)果:X光電子能譜(X-ray photoelectronspectroscopy, XPS)；圖4，D組蓋玻片神經(jīng)球細(xì)胞貼壁顯微鏡照片，接種到材料上的神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化圖；圖5，共聚焦顯微鏡觀察分化后的神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光染色的結(jié)果；
具體實施例方式實施例1，-NH2修飾的蓋玻片的制備及表征將蓋玻片(石英蓋玻片22*22mm)浸泡在I %十二烷基硫酸鈉(Sigma，USA)溶液中30分鐘，隨后再將其浸泡在0.1M鹽酸溶液中30分鐘，然后用雙蒸水洗3遍，吹干；
將經(jīng)上述步驟處理后的得到的潔凈蓋玻片浸泡在> 70%的濃硫酸溶液和30%雙氧水溶液中使之羥基化，處理lOmin，再浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(Sigma，USA)中化學(xué)連接-NH2，環(huán)境溫度25°C，反應(yīng)12h，所述的連接反應(yīng)中，3-氨基丙基-三乙氧基硅烷反應(yīng)濃度為，A組:濃度0.5% ;B組:濃度5% ;C組:濃度15% ；D組:濃度20% ;去離子水清洗3遍，75%酒精隔夜消毒，氮氣吹干，即獲得所述-NH2修飾的用于NSCs細(xì)胞的蓋玻片培養(yǎng)載體。衰減全反射紅外光譜法定量表征材料表面蛋白質(zhì)或化學(xué)基團(tuán)具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度。我們選取經(jīng)氨基基團(tuán)化學(xué)修飾過的玻片分成4組檢測紅外光譜。表I表示ABCD4組玻片的紅外光譜數(shù)據(jù)。由于相對于羥基而言，-NH2更疏水。故水接觸角越大，表明-NH2濃度越高。通過控制反應(yīng)時間和反應(yīng)試劑氨基硅烷的濃度，水接觸角測量結(jié)果呈現(xiàn)出上升梯度特征，這表明經(jīng)過-NH2修飾后，蓋玻片表面親疏水性能發(fā)生了巨大的變化。在所有蓋玻片表面接觸角測量數(shù)據(jù)見表I和圖1，D組蓋玻片具有最高的水接觸角。表.1比較不同反應(yīng)濃度在固定時間內(nèi)對接觸角的影響
權(quán)利要求
1.一種-NH2化學(xué)基團(tuán)修飾的細(xì)胞培養(yǎng)載體的其制備方法，所述方法包括如下步驟: (1)將載體材料清洗干凈； (2)對載體材料表面進(jìn)行羥基化； (3)通過3-氨基丙基-三乙氧基硅烷對載體材料進(jìn)行表面處理，化學(xué)連接-NH2基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的羥基化步驟為:依次在濃硫酸溶液和30%雙氧水溶液中浸泡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)的表面處理步驟為，浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷溶液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷溶液中進(jìn)行連接時，連接反應(yīng)時間為2 14小時，優(yōu)選為12小時；反應(yīng)溫度為4 40°C，優(yōu)選為25°C ;反應(yīng)底物3-氨基丙基三乙氧基硅烷的濃度為0.5 20%，優(yōu)選為20%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)載體可以是玻璃或塑料材質(zhì)的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、載玻片、蓋玻片、或其他貼壁型細(xì)胞生長載體。
6.權(quán)利要求1-4所述的方法制備獲得的細(xì)胞培養(yǎng)載體。
7.權(quán)利要求1-4所述的方法制備獲得的細(xì)胞培養(yǎng)載體在培養(yǎng)干細(xì)胞、對干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明一種-NH2化學(xué)基團(tuán)修飾的細(xì)胞培養(yǎng)載體及其制備方法及其應(yīng)用，制備方法為，將載體材料清洗干凈；然后通過濃硫酸溶液，雙氧水溶液使之羥基化；再用3-氨基丙基-三乙氧基硅烷化學(xué)連接-NH2即得。該載體材料在神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化中相比于普通培養(yǎng)材料，有更好的效果。
文檔編號C12N5/079GK103087914SQ201210452188
公開日2013年5月8日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者安沂華, 李海龍, 董健伸, 羅美華 申請人:安沂華