專利名稱：環(huán)氧化物水解酶基因、編碼酶、載體、工程菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從壤霉菌ZJB120203中提取的環(huán)氧化物水解酶基因、編碼酶、載體、工程菌及應(yīng)用。背景技術(shù)：
環(huán)氧化物水解酶(EC 3. 3. 2. 3)是一組功能相似的酶系，能夠立體選擇性催化環(huán)氧化合物生成光學(xué)活性的環(huán)氧化物和相應(yīng)鄰位二醇。作為一種水解酶它具有一般水解酶的特點(diǎn)如1.反應(yīng)不需要輔酶的協(xié)助。2.具有廣泛的來源。3.在非水溶劑中仍具有催化活力。4.這些反應(yīng)常常顯示出化學(xué)、區(qū)域和立體對映選擇性，能夠?qū)ν愋蛷V泛的底物進(jìn)行作用。
環(huán)氧化物水解酶廣泛存在于自然界中，在哺乳動物、昆蟲、微生物和植物中均有發(fā)現(xiàn)。哺乳動物環(huán)氧化物水解酶參與了體內(nèi)有害異體物質(zhì)的代謝，并有調(diào)控血壓等功能；植物環(huán)氧化物水解酶能參與角質(zhì)以及抗菌物質(zhì)的合成；昆蟲環(huán)氧化物水解酶具有分解代謝昆蟲發(fā)育過程中重要的化合中間體保幼激素以及代謝植物釋放的化學(xué)預(yù)防化合物的重要功能； 而微生物是環(huán)氧化物水解酶的重要的來源。由于微生物種類的多樣性、生長速度快、易于培養(yǎng)和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，從微生物中篩選獲得環(huán)氧化物水解酶是目前主要的途徑。
近年，已從多種微生物中發(fā)現(xiàn)了環(huán)氧化物水解酶，如Rhodococcus equi, Rhodococcus ruber, Mycoplana rubra ， Bacillus megaterium， Diplodia gossipina， Streptomyces striana，Rhodotorula glutinis，Bacillus subtil is，Sphingomonas echinoides ， Rhodotorula araucariae， Rhodosporidium toruloides， Agrobacterium radiobacter, Mycobacter tuberculosis，Aspergillus niger，Caulobacter crescentus， Trichosporon loubierii，Sphingomonas sp，Novosphingobium aromaticivorans， Saccharomyces cerevisiae等。其中部分環(huán)氧化物水解酶的基因已被克隆并在不同的宿主(大腸桿菌、畢赤酵母、耶氏酵母等)中表達(dá)，獲得產(chǎn)酶活力較高的基因工程菌，并應(yīng)用于不對稱拆分外消旋環(huán)氧化物。另外，在手性環(huán)氧氯丙烷的制備和手性苯基環(huán)氧乙烷中也有廣泛應(yīng)用。
手性環(huán)氧氯丙烷和手性苯基環(huán)氧乙烷在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工、材料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。 隨著手性藥物行業(yè)的發(fā)展，使得手性環(huán)氧氯丙烷和苯基環(huán)氧乙烷作為一種重要醫(yī)藥中間體的地位更加突出。目前，合成手性環(huán)氧氯丙烷和苯基環(huán)氧乙烷主要有化學(xué)法和生物法拆分兩大類。生物法拆分法具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，但是具有高效拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷和苯基環(huán)氧乙烷的活性微生物報道較少，因此，篩選高選擇性的新微生物菌株，并通過基因工程技術(shù)獲得能夠選擇性水解外消旋的環(huán)氧氯丙烷和苯基環(huán)氧乙烷的環(huán)氧化物水解酶基因，構(gòu)建高效表達(dá)的基因工程菌有著重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種從壤霉菌ZJB120203中提取的環(huán)氧化物水解酶基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，以及其在制備重組環(huán)氧化物水解酶中的應(yīng)用，重組環(huán)氧化物水解酶制備手性環(huán)氧氯丙烷和手性苯基環(huán)氧乙烷的應(yīng)用。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
本發(fā)明提供一種來源于壤霉菌(Agromyces sp. ) ZJB120203的環(huán)氧化物水解酶基因，所述環(huán)氧化物水解酶基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示，GenBank登錄號 JX467176。
所述環(huán)氧化物水解酶基因由如下方法得到
利用PCR 技術(shù)，在簡并引物 I (YKSCAYGGYTGGCCMGG)、引物 2 (SARYGCRGCAMGTGTCC) 的作用下以來源于壤霉菌(Agromyces sp. ) ZJB120203菌株中的總基因組DNA為模板克隆長約O. Skb的環(huán)氧化物水解酶基因片段。將該片段連接到PMD18-T載體上，獲得克隆載體 PMD18-T-EHP，將載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得含載體pMD18-T-EHP的重組大腸桿菌。對重組質(zhì)粒測序，并進(jìn)行BLAST比對，根據(jù)同源性較高的環(huán)氧化物水解酶基因序列為參考設(shè)計(jì)引物3和4， 在引物 3 (ATGACCGCGGTGAGTCCCAC)、引物 4(TCATTGTTCAT TTCCTC TCMTTGG)的作用下，以來源于壤霉菌ZJB120203菌株的總基因組DNA為模板克隆長約I. 2kb的環(huán)氧化物水解酶基因片段。將該片段連接到PMD18-T載體上獲得克隆載體pMD18-T-EH和轉(zhuǎn)化了 pMD18-T_EH的重組大腸桿菌。對重組質(zhì)粒測序，并利用軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，該序列含有一個長為U67bp 的開放閱讀框(核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示)。
所述提供環(huán)氧化物水解酶基因的壤霉菌(Agromyces sp. )ZJB120203,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC No M 2012299，保藏日期 2012年7月25日。
所述壤霉菌(Agromyces sp. ) ZJB120203的獲取方法為本發(fā)明從浙江、江蘇、安徽等地采取土樣，共取土樣40份。篩選的具體方法稱取土壤樣品5g，加入50mL無菌水制成土壤懸浮液，取I. OmL上清液,加入到篩選培養(yǎng)基中，于30°C、150rpm/min搖床上振蕩培養(yǎng)4天。之后取該培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，取10_4、10_5、10_6的梯度稀釋液涂布到LB固體培養(yǎng)基上，置30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。挑取生長出的單菌落接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在30°C搖床上培養(yǎng)2天，離心收集菌體，并用磷酸鹽緩沖液洗滌。菌體用于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件如下磷酸鹽緩沖液(200Mm，pH 8. O)中加入菌體，環(huán)氧氯丙烷50mM，置于30°C水浴搖床轉(zhuǎn)化30min,取Iml轉(zhuǎn)化液，乙酸乙酯萃取后，氣相檢測分析。
本發(fā)明篩選得到的壤霉菌ZJB120203菌株，按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(第八版)》的生理生化鑒定，菌株的形態(tài)為短桿狀，掃描電鏡下放大可以清楚地觀察到其大小約為I. (Tl. 2X0. 4^0. 6 μ m，無芽孢，幼齡革蘭氏陽性，老培養(yǎng)物革蘭氏陰性，有鞭毛，在LB平板、牛肉膏蛋白胨平板上30°C培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形光滑狀、濕潤、透明、邊緣整齊、乳白色、易挑取。
16S rDNA序列分析以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用引物:pl6S_8: 5，-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3'和 pl6S_1541: 5' -aag gag gtg ate cag ccg ca-3'擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因，將基因產(chǎn)物同T載體連接，經(jīng)測序確認(rèn)該片段實(shí)際長度為1423bp，將該序列與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析發(fā)現(xiàn),該菌與壤霉菌(Agromyces sp.)的同源性最高(homology, 99%/1423 bps, based on 16S rDNA)。
生理生化鑒定結(jié)合分子鑒定，可確認(rèn)該菌株ZJB120203為壤霉菌(Agromycessp.)
任何對SEQ ID NO :1所示核苷酸序列進(jìn)行一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入處理獲得的核苷酸序列，只要其與該核苷酸具有90%以上的同源性，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明提供一種由所述環(huán)氧化物水解酶基因編碼的環(huán)氧化物水解酶。
進(jìn)一步，所述SEQ ID NO : I所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO : 2所示
I MTAVSPTPFE IAVPDEVLDD LYKRLANTRF PASIEGGGffS YGTDVGYLQR LVDYffRTDFN
61 WREAERRLND LPQYRARIQD VDLHFVHVPG KGPAPTPLLF VHGffPGSFSE VSKIIGPLTD
121PAAHG⑶PENSFSVVAPSLPGFGFSSDIGRPGMNPGTMAEILAELMTDVLGYSEFVGQGG
181DffGSTVLTRLAHAHPDLVTGLHLNYSSVQPSMIDAAPLSAAEQQYLSANQEffSAREGAYN
241SLQSTKPQSLAVALNDSPAGLAAffLVEKYRSffSDCNGDVESSFSSDELLTQVMIYffVTQS
301IGSSSRLYAERAREGffTFPPGEIIDVPTAYARFPAEIRRPPAEffLERMFRLERFTDMPRG
361GHFAALEVPDLLVADLREFQNQLRGNEQ
任何對SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中氨基酸進(jìn)行缺失、插入或替換的處理獲得的多肽片段或其變體，只要其與SEQ ID NO :2所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明涉及含所述環(huán)氧化物水解酶基因的重組載體，及用所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
本發(fā)明根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)胞內(nèi)表達(dá)引物5 (CGCCATATGACCGCGG
TGAGTCCCAC)和引物 6 (ATTTGCGGCCGC TCATTGTTCATTT
CCTCTCAATTGG)，以克隆載體pMD18-T_EH為模板，通過PCR擴(kuò)增得到了用于胞內(nèi)表達(dá)的環(huán)氧化物水解酶基因。本發(fā)明將環(huán)氧化物水解酶基因同表達(dá)載體pET28a連接， 構(gòu)建了含有環(huán)氧化物水解酶基因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-EH。將胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒 pET28a-EH轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株中，獲得含有重組質(zhì)粒pET28a_EH的重組大腸桿菌 BL21/pET28a-EH，以重組基因工程菌為酶源進(jìn)行生物催化和轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明還涉及環(huán)氧化物水解酶基因在制備重組環(huán)氧化物水解酶中的應(yīng)用，具體為構(gòu)建含有所述環(huán)氧化物水解酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)(通常以IPTG為誘導(dǎo)劑)，培養(yǎng)液分離得到含有重組環(huán)氧化物水解酶的菌體細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種含所述環(huán)氧化物水解酶基因的環(huán)氧化物水解酶在制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為以含環(huán)氧化物水解酶的重組基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以外消旋環(huán)氧化物為底物，于PH 6^10緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)， 在20 40°C條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，獲得的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液即為含手性環(huán)氧化物的混合液，將混合液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物。
進(jìn)一步，優(yōu)選所述含所述環(huán)氧化物水解酶基因的環(huán)氧化物水解酶在制備手性環(huán)氧化物中應(yīng)用為以含環(huán)氧化物水解酶的重組基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源， 以外消旋環(huán)氧化物為底物，于PH 6 10緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在20 40°C、 5(T250r/min條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)O. 05 4h，反應(yīng)結(jié)束后，獲得的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液即為含手性環(huán)氧5化物的混合液，將混合液分離純化(所述分離純化方法采用本領(lǐng)域公知的常規(guī)操作即可)， 獲得手性環(huán)氧化物；所述底物的初始濃度為O. 05 80g/L，所述濕菌體的質(zhì)量用量以菌體干重計(jì)為O. 05 0.4g/g底物。
進(jìn)一步，所述底物為外消旋環(huán)氧氯丙烷或外消旋苯基環(huán)氧乙烷。
進(jìn)一步，所述酶源按如下步驟制備將來源于壤霉菌(Agromyces sp. ) ZJB120203 的SEQ ID NO: I所示環(huán)氧化物水解酶基因構(gòu)建載體，再將載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離獲得含環(huán)氧化物水解酶的菌體細(xì)胞，具體為將含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-Hl的重組大腸桿菌BL21/pET28a-EH接種至含有50μ g/ml卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)12h，再以1%接種量(v/v)接種到新鮮的含有50 μ g/ ml卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至菌體濃度0D_約O. 6左右，再向LB液體培養(yǎng)基加入終濃度為O. 5mM的IPTG，28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)IOh后，將培養(yǎng)液在4°C、8000rpm離心 IOmin,棄去上清液，收集沉淀，即獲得含有重組環(huán)氧化物水解酶的濕菌體，即為含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21/pET28a-EH濕菌體。
更進(jìn)一步，所述含所述環(huán)氧化物水解酶基因的環(huán)氧化物水解酶在制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用為WSEQ ID NO: I所示環(huán)氧化物水解酶基因制備的重組基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以外消旋苯基環(huán)氧乙烷或外消旋環(huán)氧氯丙烷為底物，于PH 7-9的緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在25-35°C、100-200r/min條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)O. l_2h，獲得相應(yīng)的R-苯基環(huán)氧乙烷(ee ^ 99%)或S-環(huán)氧氯丙烷(ee ^ 99%);所述底物初始濃度為l_60g/L，所述酶源的用量以濕菌體的干重計(jì)為O. 1-0. 3g/g底物。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一種來源于壤霉菌(Agromyces sp. ) ZJB120203的環(huán)氧化物水解酶基因，該環(huán)氧化物水解酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-EH，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有重組環(huán)氧化物水解酶，可以利用重組大腸桿菌為酶源，以外消旋環(huán)氧氯丙烷或外消旋的苯基環(huán)氧乙烷為底物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備相應(yīng)高光學(xué)純度的S-環(huán)氧氯丙烷(ee ^ 99%)或R-苯基環(huán)氧乙烷(ee ^ 99%)。

圖I為克隆載體pMD18-T-EH物理圖譜；
圖2為pET28a_EH重組質(zhì)粒物理圖譜；
圖3為環(huán)氧化物水解酶基因PCR擴(kuò)增低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(argrose)電泳圖；其中， 泳道2飛為利用引物I和引物2擴(kuò)增得到的環(huán)氧化物水解酶基因片段，泳道I為DL2000 DNA Marker ；
圖4為環(huán)氧化物水解酶基因PCR擴(kuò)增argrose電泳圖；其中，泳道2 4為利用引物3和引物4擴(kuò)增得到的環(huán)氧化物水解酶基因片段，泳道I為DL2000 DNA Marker ；
圖5陽性重組質(zhì)粒pET28a_EH的酶切結(jié)構(gòu)圖；其中，泳道I為DL 2000 DNA Marker片段；泳道2為環(huán)氧化物水解酶基因；泳道3為pET28a-EH/NdeI樣品；泳道4為 pET28a-EH/Not I 樣品；泳道 5 為 pET28a_EH/Nde I and Not I 樣品;
圖6為環(huán)氧化物水解酶SDS-PAGE圖泳道I為蛋白質(zhì)分子量Marker，泳道2為 E. coli BL21，泳道 3 為未誘導(dǎo)的 E. coli BL21/pET28a_EH，泳道 4 為 IPTG 誘導(dǎo)的 E. coliBL21/pET28a-EH。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例I 壤霉菌(Agromyces sp. ) ZJB120203 的獲取
本發(fā)明從浙江、江蘇、安徽等地取土樣，共取土樣40份。篩選的具體方法稱取土壤樣品5g,加入50mL無菌水制成土壤懸浮液,取I. OmL上清液,加入到篩選培養(yǎng)基中，于 300C、150rpm/min搖床上振蕩培養(yǎng)4天。之后取該培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，取10_4、10_5、10_6的梯度稀釋液涂布到固體培養(yǎng)基上，置30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。挑取生長出的單菌落接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在30°C搖床上培養(yǎng)2天，離心收集菌體，并用磷酸鹽緩沖液洗滌。菌體用于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件如下磷酸鹽緩沖液(200mM，pH 8. O)中加入菌體，環(huán)氧氯丙燒50mM,置于30°C水浴搖床轉(zhuǎn)化30min,取Iml轉(zhuǎn)化液，乙酸乙酯萃取后，氣相檢測分析。
本發(fā)明篩選得到的菌株ZJB120203，按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(第八版)》的生理生化鑒定，菌株的形態(tài)為短桿狀，掃描電鏡下放大可以清楚地觀察到其大小約為I. (Tl. 2Χ0.Γ0. 6 μ m，無芽孢，幼齡革蘭氏陽性，老培養(yǎng)物革蘭氏陰性， 有鞭毛，在LB平板、牛肉膏蛋白胨平板上30°C培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形光滑狀、濕潤、透明、 邊緣整齊、乳白色、易挑取。
所述篩選培養(yǎng)基終濃度組成0. 2% (v/v)環(huán)氧氯丙烷，O. 1%(NH4)S04,0. 1% K2HPO4, O. 1% Na2HPO4 · 2H20,0. 2% NaH2PO4 · 12H20,0. 05% MgSO4 · 7H20, 0. 001% FeSO4 · 7H20,0. 001% CuSO4 · 5Η20，0· 001% MnSO4 · 5H20，溶劑為水，pH 自然；
所述固體LB培養(yǎng)基終濃度組成1%蛋白胨，O. 5%酵母粉，1% NaCl，2%瓊脂，溶劑為水，pH 7. O ；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成1%甘油，O. 5%蛋白胨，1%酵母粉，O. 1% (NH4) SO4, O. 1% K2HPO4,0. 1% Na2HPO4 · 2H20，0. 2% NaH2PO4 · 12Η20，0· 05% MgSO4 · 7Η20，0· 001% FeSO4 7Η20，0· 001% CuSO4 · 5Η20，0· 001% MnSO4 · 5Η20，0· 1% CaCO3，溶劑為水，pH 自然。
篩選得到的菌株ZJB120203，進(jìn)行生理生化及BIOLOG鑒定(見表I和表2)，并按精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南方法提取染色體DNA，以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用引物pl6S_8: 5，-aga gtt tga tcc tgg ctc ag_3，和 pl6S_1541: 5' -aag gag gtg ate cag ccg ca-3’擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因，將基因產(chǎn)物同T載體連接后，委托上海生工對該菌16S rDNA擴(kuò)增及測序，得到該菌株的16S rDNA序列后，在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢索GenBank中相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，并進(jìn)行同源性比對?；谛螒B(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析等方面的鑒定，確定該菌為壤霉菌，擬命名為壤霉菌 (Agromyces sp. ) ZJB120203，此株菌已于2012年7月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No M 2012299。
表I.菌株對Biolog GEN III板上71種碳源的利用能力
權(quán)利要求
1.一種環(huán)氧化物水解酶基因，其特征在于所述環(huán)氧化物水解酶基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 1 所示。
2.一種由權(quán)利要求I所述環(huán)氧化物水解酶基因編碼的環(huán)氧化物水解酶。
3.如權(quán)利要求2所述的環(huán)氧化物水解酶，其特征在于所述環(huán)氧化物水解酶的氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示。
4.一種含權(quán)利要求I所述環(huán)氧化物水解酶基因的重組載體。
5.一種由權(quán)利要求4所述重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
6.一種權(quán)利要求I所述環(huán)氧化物水解酶基因在制備重組環(huán)氧化物水解酶中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為將含所述環(huán)氧化物水解酶基因構(gòu)建載體，再將載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離獲得含環(huán)氧化物水解酶的菌體細(xì)胞。
8.一種含權(quán)利要求2所述環(huán)氧化物水解酶基因的環(huán)氧化物水解酶在制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以含環(huán)氧化物水解酶的重組基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以外消旋環(huán)氧化物為底物，于PH 6^10緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在20 40°C條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，獲得的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液即為含手性環(huán)氧化物的混合液，將混合液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物。
9.如權(quán)利要求8所述含權(quán)利要求I所述環(huán)氧化物水解酶基因的環(huán)氧化物水解酶在制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以含環(huán)氧化物水解酶的重組基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以外消旋環(huán)氧化物為底物，于PH 6^10緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在20 40°C、5(T250r/min條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)O. 05 4h，反應(yīng)結(jié)束后，獲得的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液即為含手性環(huán)氧化物的混合液，將混合液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物；所述底物的初始濃度為O. 05 80g/L，所述濕菌體的質(zhì)量用量以菌體干重計(jì)為O. 05 O. 4g/g底物。
10.如權(quán)利要求8或9所述含權(quán)利要求I所述環(huán)氧化物水解酶基因的環(huán)氧化物水解酶在制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用，其特征在于所述底物為外消旋環(huán)氧氯丙烷或外消旋苯基環(huán)氧こ烷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種源自于壤霉菌ZJB120203的環(huán)氧化物水解酶基因、編碼酶、載體、重組基因工程菌，以及在制備重組環(huán)氧化物水解酶中的應(yīng)用；本發(fā)明環(huán)氧化物水解酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-EH，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有重組環(huán)氧化物水解酶，可以利用重組大腸桿菌為酶源，以外消旋環(huán)氧氯丙烷、外消旋的苯基環(huán)氧乙烷為底物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備高光學(xué)純度的S-環(huán)氧氯丙烷和R-苯基環(huán)氧乙烷。
文檔編號C12N9/14GK102978220SQ20121045507
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者鄭裕國, 薛鋒, 柳志強(qiáng), 鄒樹平, 胡忠策, 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)