專利名稱：鹵醇脫鹵酶、編碼基因、載體、菌株及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鹵醇脫鹵酶、編碼基因及載體，產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的新菌株，以及其在制備環(huán)氧氯丙烷和(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。背景技術(shù)：
鹵醇脫鹵酶，也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶，通過分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化芳香族或者脂肪族鄰鹵醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和鹵化氫，是微生物降解有機(jī)鹵化合物的關(guān)鍵酶之一。根據(jù)其序列同源性分為HheA、HheB、HheC 3類。有機(jī)鹵化合物已成為當(dāng)今重要環(huán)境污染物之一，主要是由于排廢以及人工合成鹵化物的廣泛應(yīng)用造成的。在自然界中，大部分異生質(zhì)鹵化物自降解能力很差，同時許多化合物被疑是致癌或高誘變物質(zhì)。因此，應(yīng)用微生物和脫鹵酶降解有機(jī)鹵化物已引起人們廣泛的關(guān)注，在環(huán)境污染治理，特別是手性環(huán)氧化物合成方面等具有十分重要的作用。
鹵醇脫鹵酶主要通過蛋白結(jié)構(gòu)中保守的絲氨酸與底物羥基氧原子之間形成氫鍵， 穩(wěn)定與底物結(jié)合，通過精氨酸降低絡(luò)氨酸的PKa值，酪氨酸從底物上的氧原子作為親核試劑，進(jìn)攻鄰位鹵素取代的碳原子，進(jìn)而釋放鹵離子，形成環(huán)氧化物。鹵醇脫鹵酶不但可以催化碳-鹵鍵的斷裂進(jìn)行脫鹵反應(yīng)，可以高選擇性地催化接受除了鹵離子以外的一系列非自然親核試劑，如N3_、NO2' CN—等所介導(dǎo)的環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)，用以生成一系列光學(xué)純的 β_取代醇。因此可以用來合成一些非自然手性化合物。
鹵醇脫鹵酶可以廣泛應(yīng)用于環(huán)氧化物以及取代醇。其中疊氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前體；手性氨基醇在生物制藥領(lǐng)域是一類很重要的化合物，可用來合成多種生物活性物質(zhì)。異硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在農(nóng)用化學(xué)試劑、醫(yī)藥和高分子化學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用。
近年，已從多種微生物中發(fā)現(xiàn)了齒醇脫齒酶，如Agrobacterium radiobacter ADl，Agrobacter sp. AD2，Corynebacterium sp. N—1074，Agrobacterium tumefaciens， Arthrobacter erithii HlOa, Alcaligenes sp. DS—K—S38 ， Pseudomonas sp. DS_k_2DI 等。部分鹵醇脫鹵酶的基因已被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)，獲得產(chǎn)酶活力較高的基因工程菌，并應(yīng)用于催化形成環(huán)氧化合物及β-取代醇。但是對已有鹵醇脫鹵酶進(jìn)行研究的同時， 挖掘新的的微生物來源的鹵醇脫鹵酶基因仍是今后研究的熱點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種源自壤霉菌(Agromyces sp.)的鹵醇脫鹵酶、編碼基因及載體，以及其在制備環(huán)氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種鹵醇脫鹵酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
本發(fā)明還涉及編碼所述鹵醇脫鹵酶的基因。所述基因的核苷酸如SEQ ID NO :1所/Jn ο
該鹵醇脫鹵酶基因由如下方法得到利用硫酸銨沉淀和離子交換等分離純化手段從壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC NO M 2012299菌株中分離純化得到脫鹵酶蛋白，經(jīng)過N 端序列測序和肽指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)該酶與Arthrobacter sp. AD2和Corynebacterium sp. N-1074的Haloalcohol Dehalogenase HheA存在同源性，以此設(shè)計引物。利用PCR 技術(shù)，在引物 I (ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC)、引物 2 (TTAGGGCAGATAGCC ACCG)的作用下以來源于壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC NO M 2012299菌株中的總基因組DNA為模板克隆長約O. 75kb的鹵醇脫鹵酶基因片段。將該片段連接到PMD18-T載體上獲得克隆載體 pMD18-T-Deh和轉(zhuǎn)化了 pMD18-T_Deh的重組大腸桿菌。對重組質(zhì)粒測序，并利用軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，該序列含有一個長為735bp的開放閱讀框。該基因核苷酸序列為(SEQ ID NO. I)
IATGCGCATCGCCCTCGTGACTCATGCACGGCATTTTGCAGGCCCCGCCGCCGTCGAGGCG
61CTTACGCGGGATGGCTATACCGTGGTTTGCCACGACGCGAGCTTCGCTGATGCAGCTGM
121CGACAGCGTTTCGAGTCGGAGMCCCGGGCACCATCGCGCTCGCCGAGCAGMGCCCGAG
181CGTCTGGTCGACGCCACGCTGCAGTACGGGGMGCGATCGACACGATCGTCTCGMCGAT
241TACATTCCGCGCCCGATGMTCGGCTCCCGATCGAGGGMCGAGCGAGGCCGACATCCGA
301CAGATGTTCGAGGCGCTCAGCATCTTCCCGATCCTGCTCCTGCAGTCGGCCATCGCGCCG
361CTACGGGCTGCAGGCGGCGCCTCCGTTATCTTCATCACGTCCTCGGTTGGCMGMGCCG
421CTCGCCTACAACCCTCTCTATGGGCCCGCGCGCGCCGCTACCGTCGCGCTTGTCGMTCG
481GCAGCGMGACGCTGTCCCGTGACGGMTCTTGCTCTATGCGATCGGTCCGMCTTCTTC
541MCMCCCGACGTACTTCCCGACGTCGGATTGGGAGMCGACCCCGAGCTCCGGGATCGT
601GTCGAGCGGGACGTGCCGCTCGGTCGCCTCGGCCGTCCGGACGAGATGGGTGCGCTGATC

661 721ACCTTCCTCG GGCTATCTGCCTTCGCGTCG CCTAATGCAGCGCCCATCGTGGGGCAGTTCTTCGCTTTCACCGGT
利用軟件對該基因序列進(jìn)行分析，推知所述鹵醇脫鹵酶基因編碼SEQ 示的氨基酸序列ID NO. 2 所
IMRIALVTHARHFAGPMVEALTRDGYTVVCHDASFADMERQRFESENPGTIALAEQKPE
61RLVDATLQYGEAIDTIVSNDYIPRPMNRLPIEGTSEADIRQMFEALSIFPILLLQSAIAP
121LRMGGASVIFITSSVGKKPLAYNPLYGPARMTVALVESMKTLSRDGILLYAIGPNFF

181 241NNPTYFPTSD GYLPWENDPELRDRVERDVPLGRLGRPDEMGALITFLASRRMPIVGQFFAFTG
本發(fā)明所述基因源自壤霉菌(Agromycessp. ) CCTCC No M 2012299。
本發(fā)明還涉及一株產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的新菌株-壤霉菌(Agromyces sp.)ZJB120203，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC No M 2012299，保藏日期2012年7月25日。
本發(fā)明還涉及一種含有所述鹵醇脫鹵酶基因的重組載體，以及利用該重組載體轉(zhuǎn)化獲得的基因工程菌。
本發(fā)明還涉及所述的基因在制備重組鹵醇脫鹵酶中的應(yīng)用。
本申請發(fā)明人根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計胞內(nèi)表達(dá)引物3 (CGCCATATGCGC ATCGCCCTCGTGACT C)和弓丨物 4 (CCGCTCGAGTTAGGGCAGATA GCCACCG),以克隆載體PMDlS-T-Deh為模板，通過PCR擴(kuò)增得到了用于表達(dá)的鹵醇脫鹵酶基因。將鹵醇脫鹵酶基因同表達(dá)載體pET28b連接，構(gòu)建了含有齒醇脫齒酶基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-Deh。
將胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b_Deh轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株中，獲得含有重組質(zhì)粒pET28b-Deh的重組大腸桿菌BL21/pET28b_Deh，以重組菌為酶源可進(jìn)行生物催化與轉(zhuǎn)化。
具體的，所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有SEQ ID NO 1所示鹵醇脫鹵酶基因的重組載體， 將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及所述鹵醇脫鹵酶在微生物轉(zhuǎn)化1，3- 二氯丙二醇制備環(huán)氧氯丙烷中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及所述鹵醇脫鹵酶(SEQ ID NO 2)在微生物轉(zhuǎn)化(S) _4_氯_3_羥基丁酸乙酯制備(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種來源于壤霉菌(Agromyces sp. )CCTCC No M 2012299的鹵醇脫鹵酶及其編碼基因；該鹵醇脫鹵酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-Deh，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，獲得再分別對應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有齒醇脫齒酶，可以利用重組大腸桿菌為酶源進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化與催化。本發(fā)明鹵醇脫鹵酶作為轉(zhuǎn)化用酶，以1，3-二氯丙二醇、(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯等為底物，可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備環(huán)氧氯丙烷、(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯等。

圖I為克隆載體pMD18-T_Deh物理圖譜；
圖2為pET28b_Deh重組質(zhì)粒物理圖譜；
圖3為鹵醇脫鹵酶基因PCR擴(kuò)增argrose電泳圖；其中，2飛為利用引物I和引物2擴(kuò)增得到的鹵醇脫鹵酶基因片段；1為DL2000 DNA Marker ；
圖4陽性重組質(zhì)粒pET28b_Deh的酶切結(jié)構(gòu)圖；其中，I為λ DNA/Hind III DNA Marker ；2 為 pET28b_Deh/NdeI 樣品；3 為 pET28b_Deh/Xho I 樣品；4 為 pET28b_Deh/Nde I and XhoI 樣品；5 為 DL 2000 DNA Marker 片段。
圖5 為鹵醇脫鹵酶 SDS-PAGE 圖；I :IPTG 誘導(dǎo)的 E.coli BL21/pET28b_Deh ;2 : 未誘導(dǎo)的 E. coli BL21/pET28b-Deh ；3 E. coli BL21, 4 :蛋白質(zhì)分子量 Marker。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實施例I :
用核酸快速提取儀提取壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC No M 2012299菌體的總基因組DNA，以該基因組DNA為模板，在引物I (ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC )和引物2 (TTAGGGCAGATAGCC ACCG)的作用下進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
PCR 反應(yīng)體系各組分加入量(總體積 100 μ L) :10XPfu DNA Polymerase Buffer10 μ L (Mg2+)，IOmM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 2. 5mM)0. 5 μ L，濃度為 50 μ M 的克隆引物I、引物2各0.5 μ L，基因組DNA IyL7Pfu Taq DNA Polymerase I μ L，無核酸水 86. 5 μ L0
采用Biorad的PCR儀，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 3min,然后進(jìn)入溫度循環(huán) 940C 30s, 600C 30 s，72°C I. 5min，共 30 個循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin，終止溫度為 8°C。
取10 μ L PCR反應(yīng)液用O. 9%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖3在750bp左右出現(xiàn)明顯條帶。切膠回收該片段并純化，直接同T載體進(jìn)行連接，得到克隆重組質(zhì)粒pMD18-T-Deh (質(zhì)粒圖譜參見圖I)。將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，利用籃白斑統(tǒng)進(jìn)行篩選， 隨機(jī)挑取白色克隆測序，利用軟件分析測序結(jié)果，結(jié)果表明經(jīng)引物I和引物2擴(kuò)增到的核苷酸序列長度為735bp (SEQ ID NO :1)，該序列編碼一個完整的開放閱讀框。
實施例2:
根據(jù)實施例I分析結(jié)果設(shè)計引物3 (CGCCATATGCGCATCGCCCTC GTGACTC)和引物4 (CCGCTCGAG TTAGGGCAGATAGCCACCG)，并分別在引物3和引物4中引入了 Nde I和XhoI限制性酶切位點。在引物4和引物4的引發(fā)下,利用高保真Pfu DNA聚合酶(fermentas)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長為735bp的鹵醇脫鹵酶基因片段(SEQ ID NO :I)，測序后利用Nde I和XhoI限制性內(nèi)切酶(fermentas)對擴(kuò)增片段進(jìn)行處理，并利用T4 DNA連接酶(TaKaRa)將該片段同用相同的限制性內(nèi)切酶處理的商業(yè)化載體pET28b進(jìn)行連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET28b-Deh。 將構(gòu)建的胞內(nèi)表達(dá)載體pET28b-Deh電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (Invitrogen)中，涂平板37°C 下培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取克隆抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果見圖4。
實施例3
將實施例2、驗證后的含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b_Deh的重組大腸桿菌BL21/ pET28b-Deh分別用含有50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，再以1%接種量(v/v)接種到新鮮的含有50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌體濃度 OD600約O. 6左右，再向LB液體培養(yǎng)基加入終濃度為O. 5mM的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)IOh后，4°C、 IOOOOrpm離心lOmin，收集含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細(xì)胞。
實施例4
以實施例3中獲得的含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21/pET28b_Deh 濕菌體作為轉(zhuǎn)化用酶，以1，3-二氯丙二醇為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備環(huán)氧氯丙烷。轉(zhuǎn)化體系組成及轉(zhuǎn)化操作如下IOmL磷酸鹽緩沖液(pH 8)中加入O. 2g濕菌體和O. 5% (v/ v)的 I, 3- 二氯丙二醇,30°C搖床150r/min條件下反應(yīng)60 min,加入丙酮中止反應(yīng)。
采用氣相檢測環(huán)氧氯丙烷的濃度，采用氣相色譜Agilent 6890N測定，色譜柱類型BGB-175毛細(xì)管柱；色譜條件柱溫90°C，進(jìn)樣室溫度220°C，F(xiàn)ID檢測器220°C，氦氣流量為1.6mL/min ;分流比為40:1。酶活單位(U)定義為在30°C、pH 8. O條件下，在Imin 內(nèi)催化1，3-二氯丙二醇生成IMfflol環(huán)氧氯丙烷所需要的酶量定義為IU。根據(jù)體系中環(huán)氧氯丙烷的生成量推知重組菌酶活。測定結(jié)果見表I。
表I :以重組大腸桿菌BL21/pET28b_Deh為酶源測定的鹵醇脫鹵酶活力測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鹵醇脫鹵酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.編碼權(quán)利要求I所述鹵醇脫鹵酶的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，特征在于所述基因的核苷酸如SEQID NO. I所示。
4.如權(quán)利要求2所述的基因，特征在于所述基因源自壤霉菌(Agromycessp. ) CCTCCNo M 2012299。
5.壤霉菌(Agromycessp. ) ZJB120203，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC No M 2012299，保藏日期2012年7月25日。
6.一種含有權(quán)利要求2所述鹵醇脫鹵酶基因的重組載體。
7.權(quán)利要求2所述的基因在制備重組鹵醇脫鹵酶中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有SEQID NO. I所示鹵醇脫鹵酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細(xì)胞。
9.權(quán)利要求I所述鹵醇脫鹵酶在微生物轉(zhuǎn)化1，3-二氯丙二醇制備環(huán)氧氯丙烷中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求I所述鹵醇脫鹵酶在微生物轉(zhuǎn)化(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯制備(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種源自壤霉菌(Agromyces sp.)的鹵醇脫鹵酶、編碼基因及載體，以及其在制備環(huán)氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。該鹵醇脫鹵酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其編碼基因序列如如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種來源于壤霉菌(Agromyces sp.)CCTCC NoM 2012299的鹵醇脫鹵酶及其編碼基因；該鹵醇脫鹵酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的表達(dá)重組質(zhì)粒pET28b-Deh，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，獲得再分別對應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌含有鹵醇脫鹵酶，可以利用重組大腸桿菌為酶源進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化與催化。
文檔編號C12N15/63GK102978193SQ20121045531
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者鄭裕國, 薛鋒, 柳志強(qiáng), 萬南微, 高愛存, 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)