專利名稱：斑馬魚用于測試安全物質(zhì)的安全性的用途和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及毒性檢測領(lǐng)域，具體涉及一種斑斑馬魚用于測試安全物質(zhì)的安全性的用途和方法。
背景技術(shù)：
隨著自然生產(chǎn)方式的減少，工業(yè)化比重逐漸增加，食品原料在生產(chǎn)、貯存、運輸、力口工等過程中自覺或不自覺地會引入一些化學(xué)物質(zhì)，這給食品安全帶來越來越多的不安全因素?；瘜W(xué)物質(zhì)在食品中的使用歷史悠久，在現(xiàn)代食品的生產(chǎn)、加工、貯運和食用等過程中都有化學(xué)物質(zhì)相伴，也正是這些化學(xué)物質(zhì)在食品中的廣泛使用，才使得食品工業(yè)成為朝陽產(chǎn)業(yè)。但是化學(xué)物質(zhì)的使用也給食品的安全性帶來了不可忽視的影響，其中包括藥物殘·留、重金屬、食品中的天然毒物質(zhì)、食品加工、包裝、儲存對食品安全性的影響。尤其是食品添加劑，為了達到食品滿足某些方面的指標(biāo)，加入了對生物體以及人體安全無法明確定性的物質(zhì)，這些物質(zhì)如果在生物體中測試，則測試周期會比較長，加上人體對不安全物質(zhì)的耐受程度，短期內(nèi)無法看出某種食品添加劑是否對人體具有隱形的危害。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，斑馬魚能夠?qū)ξ粗踩奈镔|(zhì)給出相對準(zhǔn)確的安全預(yù)期。特別是，本發(fā)明通過使用特殊的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚，在培養(yǎng)液中加入待測安全物質(zhì)后，能夠使胚胎對待測安全物質(zhì)的不良反應(yīng)在較短的時間內(nèi)表現(xiàn)出來，大大縮短了檢測周期。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種斑馬魚用于測試安全物質(zhì)的安全性的用途和方法。具體地，本發(fā)明提供了一種斑馬魚用于測試安全物質(zhì)的安全性的方法，其特征在于該方法包含如下步驟配制胚胎培養(yǎng)液，然后向胚胎培養(yǎng)液中加入待測安全物質(zhì)，待測安全物質(zhì)的加入量使得待測物質(zhì)在培養(yǎng)液中的濃度呈梯次分布，用加入了待測安全物質(zhì)的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，然后在4-72小時觀察記錄斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率和死亡率，來判斷待測安全物質(zhì)對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性。其中胚胎培養(yǎng)液用PH為6. 7-8. 5的弱堿性水直接配制，胚胎培養(yǎng)液中含有 5mM NaCl、O. 17mM KCl、O. 43mM CaCl2 和 O. 33mM MgSO4。上述方法中，斑馬魚胚胎通過如下方法選擇采卵前一天將性成熟的斑馬魚，按雌雄為I : 2的比例放入配缸內(nèi)并隔開，次日上午9:00自然交配并收集受精卵，用胚胎培養(yǎng)液清洗兩次收集得到的受精卵，并去除雜質(zhì)和壞卵，之后后置于胚胎培養(yǎng)液中，29. 3°C進行控光培養(yǎng)；當(dāng)2hpf時，在顯微鏡下挑選來自同一親本、正常發(fā)育比率達85%以上且發(fā)育時期一致的斑馬魚胚胎。上述方法中，培養(yǎng)斑馬魚胚胎的方法如下將斑馬魚胚胎用胚胎培養(yǎng)液清洗兩次，然后移入24孔板的樣孔中，每孔20枚，每孔滴加加入了待測安全物質(zhì)的胚胎培養(yǎng)液，每孔4ml,隨后加蓋封閉,置于培養(yǎng)箱中,在29. 3°C培養(yǎng)斑馬魚胚胎。上述方法中，觀察記錄的時間是培養(yǎng)后第4、12、24、48、72小時，記錄畸形率和死亡率。上述方法中，pH為7. 0-7. 8，優(yōu)選地，pH為7. 2?；问侵赴唏R魚體型與正常的相同培養(yǎng)時間單用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)的斑馬魚體型 有差異。死亡是指用攪拌棒觸碰斑馬魚尾部時斑馬魚沒有任何反應(yīng)。上述方法中，所述的待測安全物質(zhì)為需要驗證其對生物安全性的任何物質(zhì)，包括有機物或無機物，無論安全物質(zhì)在水中的溶解度如何，都可以作為本發(fā)明的上述方法測量的待測安全物質(zhì)。對于水中溶解度高的物質(zhì)，直接將其按照濃度梯度溶解于胚胎培養(yǎng)液中，對于水中溶解度低的固體物質(zhì)，將其粉碎到500-1000目后加入到胚胎培養(yǎng)液中高速攪拌制成懸浮液。對于水中溶解度低的液體物質(zhì)，將加入到胚胎培養(yǎng)液中高速攪拌制成懸乳液。優(yōu)選地，安全物質(zhì)包括認(rèn)為對人體有毒的物質(zhì)和一般認(rèn)為對生物無毒卻可能有毒的安全物質(zhì)。尤其優(yōu)選地，安全物質(zhì)例如為谷氨酸鈉、三聚氰胺、酒石黃、苯甲酸鈉、亞硝酸鈉等食品添加劑。本發(fā)明還提供了斑馬魚用于測試待測安全物質(zhì)毒性的用途，其特征在于向胚胎培養(yǎng)液中加入待測安全物質(zhì)，待測安全物質(zhì)的加入量使得待測物質(zhì)在培養(yǎng)液中的濃度呈梯次分布，用加入了待測安全物質(zhì)的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，然后在4-72小時觀察記錄斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率和死亡率，來判斷待測安全物質(zhì)對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性。其中胚胎培養(yǎng)液用PH為6. 7-8. 5的弱堿性水直接配制，胚胎培養(yǎng)液中含有5mM NaCUO. 17mMKCl、0· 43mM CaCl2 和 0. 33mMMgS04。本發(fā)明配制胚胎培養(yǎng)液所用的氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂以及弱堿性水等均為市購，其中無機鹽均為AR級；需要特別說明的是，弱堿性水可以采用任何通過光電催化電解水獲得的弱堿性水，該弱堿性水的PH為6. 7-8. 5，可以通過市場上的弱堿性水制備裝置制備，也可以自行通過電解的方式制備，需要注意的是本發(fā)明的弱堿性水并不是通過在水中加入化學(xué)物質(zhì)制備得到的弱堿性水，任何通過加入化學(xué)物質(zhì)到水中制備的弱堿性水不是本發(fā)明所說的弱堿性水。弱堿性水的PH可以在制備中調(diào)節(jié)，而不是通過加入化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)pH。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明使用弱堿性水配制的胚胎培養(yǎng)液來作為測試待測安全物質(zhì)毒性的培養(yǎng)液，其不僅因為培養(yǎng)液中的水為弱堿性水，還因為培養(yǎng)液中的無機鹽的特定組成，使得斑馬魚胚胎能夠快速測試待測安全物質(zhì)的綜合毒性，縮短了檢測周期。
具體實施例方式為了理解本發(fā)明，下面以實施例進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限制于此。實施例I最佳胚胎培養(yǎng)液的篩選I. I不同配方的胚胎培養(yǎng)液的配制及培養(yǎng)斑馬魚的效果A用普通水配制包含以下濃度無機鹽的胚胎培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH為7. 2，培養(yǎng)斑馬魚胚胎72小時，觀察斑馬魚的透明度和存活率。具體結(jié)果見表I :
表I普通水配制的胚胎培養(yǎng)液對斑馬魚胚胎的影響
權(quán)利要求
1.一種斑馬魚用于測試安全物質(zhì)的安全性的方法，其特征在于包含如下步驟 配制胚胎培養(yǎng)液，然后向胚胎培養(yǎng)液中加入待測安全物質(zhì)，待測安全物質(zhì)的加入量使得待測物質(zhì)在培養(yǎng)液中的濃度呈梯次分布，用加入了待測安全物質(zhì)的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，然后在4-72小時觀察記錄斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率和死亡率，來判斷待測安全物質(zhì)對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性，其中胚胎培養(yǎng)液用pH為6. 7-8. 5的弱堿性水直接配制，胚胎培養(yǎng)液中含有 5mM NaCl、O. 17mM KCl、O. 43mM CaCl 2 和 O. 33mM MgSO4。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中斑馬魚胚胎通過如下方法選擇 采卵前一天將性成熟的斑馬魚，按雌雄為I : 2的比例放入配缸內(nèi)并隔開，次日上午9:00自然交配并收集受精卵,用胚胎培養(yǎng)液清洗兩次收集得到的受精卵，并去除雜質(zhì)和壞卵，之后后置于胚胎培養(yǎng)液中，29. 3°C進行控光培養(yǎng)；當(dāng)2hpf時,在顯微鏡下挑選來自同一親本、正常發(fā)育比率達85%以上且發(fā)育時期一致的斑馬魚胚胎。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中培養(yǎng)斑馬魚胚胎的方法如下將斑馬魚胚胎用胚胎培養(yǎng)液清洗兩次，然后移入24孔板的樣孔中，每孔20枚，每孔滴加加入了待測安全物質(zhì)的胚胎培養(yǎng)液，每孔4ml，隨后加蓋封閉，置于培養(yǎng)箱中，在29. 3°C培養(yǎng)斑馬魚胚胎。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中觀察記錄的時間是培養(yǎng)后第4、12、24、48、72小時，記錄畸形率和死亡率。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中pH為7.0-7. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中pH為7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其中所述的待測安全物質(zhì)為谷氨酸鈉、三聚氰胺、酒石黃、苯甲酸鈉或亞硝酸鈉。
8.一種斑馬魚用于測試待測安全物質(zhì)毒性的用途，其特征在于向胚胎培養(yǎng)液中加入待測安全物質(zhì)，待測安全物質(zhì)的加入量使得待測物質(zhì)在培養(yǎng)液中的濃度呈梯次分布，用加入了待測安全物質(zhì)的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，然后在4-72小時觀察記錄斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率和死亡率，來判斷待測安全物質(zhì)對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性，其中胚胎培養(yǎng)液用pH為6. 7-8. 5的弱堿性水直接配制，胚胎培養(yǎng)液中含有5mM NaCUO. 17mM KCl、0. 43mMCaCl2 和 0. 33mM MgSO4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種斑馬魚用于測試安全物質(zhì)的安全性的用途和方法。其特征在于方法包含如下步驟配制胚胎培養(yǎng)液，然后向胚胎培養(yǎng)液中加入待測安全物質(zhì)，待測安全物質(zhì)的加入量使得待測物質(zhì)在培養(yǎng)液中的濃度呈梯次分布，用加入了待測安全物質(zhì)的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，然后在4-72小時觀察記錄斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率和死亡率，來判斷待測安全物質(zhì)對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性。其中胚胎培養(yǎng)液用pH為6.7-8.5的弱堿性水直接配制，胚胎培養(yǎng)液中含有5mM NaCl、0.17mM KCl、0.43mM CaCl2和0.33mM MgSO4。本發(fā)明使用弱堿性水配制的胚胎培養(yǎng)液使得斑馬魚胚胎能夠快速測試待測安全物質(zhì)的綜合毒性，縮短了檢測周期。
文檔編號C12Q1/02GK102899385SQ20121045534
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者陳 峰 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所, 陳 峰