專(zhuān)利名稱(chēng)：MtSKL1蛋白及其編碼基因在控制植物性狀中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種MtSKLl蛋白及其編碼基因在控制植物性狀中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豆科作為重要的作物和牧草資源，為人類(lèi)和動(dòng)物提供了大量的蛋白質(zhì)。但是大多數(shù)豆科栽培植物的基因組大并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，難以進(jìn)行基因水平的分析。與苜蓿等豆科植物遺傳關(guān)系較近的一年生蒺藜苜蓿，具有二倍純合體、基因組小、生長(zhǎng)周期短、易于人工繁殖和基因轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其成為豆科分子生物學(xué)研究的模式植物(陳愛(ài)民等，2006 ;魏臻武和蓋鈞鎰，2008 ;Young and Udvardi，2009)。鑒于豆科植物的重要性和生物固氮研究的需要，法國(guó)等歐盟國(guó)家和美國(guó)先后以蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula)為材料設(shè)立了國(guó)際豆科模式植物基因組研究計(jì)劃，使蔡藜苜猜成為繼擬南芥和水稻之后第三個(gè)完成基因測(cè)序的植物。目前，全球范圍內(nèi)，特別是歐美發(fā)達(dá)國(guó)家正在對(duì)蔡藜苜猜開(kāi)展非常廣泛和深入的研究(Pennycooke et al. , 2008 ；Young andUdvardi, 2009;Zhou et al.，2011)，但我們國(guó)家在這方面的研究?jī)H僅處于起步階段(劉偉等，2010a，b ;謝亞均等，2010)，與該領(lǐng)域的國(guó)際先進(jìn)水平相差甚遠(yuǎn)。干旱、鹽和低溫等是影響植物生長(zhǎng)的主要環(huán)境脅迫因子。對(duì)苜蓿非生物脅迫抗性分子機(jī)理的研究，必定有利于苜?？剐曰蛸Y源的挖掘和利用。但是，近年來(lái)利用蔡藜苜猜的研究主要局限于生物固氮分子機(jī)理的研究(Young and Udvardi, 2009;Zhouet al.，2011),而對(duì)于苜猜非生物脅迫抗性分子機(jī)理的研究卻非常有限(Pennycooke etal.，2008)。利用蒺藜苜蓿遺傳信息對(duì)苜?？剐詸C(jī)理的研究取得了一些進(jìn)展(Wang etal. , 2011; Zhang et al. , 2011; Chen et al. , 2012a, b;王天佐等，2012)。為了研究苜蓿的抗性分子機(jī)理，可采用多種方式尋找苜蓿抗性關(guān)鍵基因。其中對(duì)已知其它功能的苜蓿基因進(jìn)行抗性功能研究就是其中一種篩選方式。研究發(fā)現(xiàn)MtSKLl基因參與調(diào)節(jié)根瘤菌共生作用，MtSKLl基因突變體ski根部極易大量共生根瘤菌(Penmetsaand Cook, 1997)。研究還發(fā)現(xiàn)MtSKLl基因是擬南芥乙烯信號(hào)傳導(dǎo)組分EIN2的同源基因(Penmetsa and Cook，1997)。EIN2基因在擬南芥乙烯信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮非常重要的作用，它可能通過(guò)磷酸化與去磷酸化作用與乙烯受體直接作用，傳導(dǎo)乙烯信號(hào)并調(diào)節(jié)乙烯響應(yīng)下游基因的表達(dá)，產(chǎn)生乙烯響應(yīng)的生理作用(Bisson and Groth，2010; 2011)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供MtSKLl蛋白及其編碼基因在控制植物性狀中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了 MtSKLl蛋白或其編碼基因在調(diào)控植物性狀中的應(yīng)用；所述調(diào)控植物性狀為如下I)-4)中的至少一種I)降低或提高植物耐逆性；2)降低或提高植物中脯氨酸含量；
3)降低或提高植物中可溶性糖含量；4)降低或提高植物抗氧化能力；所述MtSKLl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述應(yīng)用中，所述MtSKLl蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。上述應(yīng)用中，所述耐逆為耐低溫。上述應(yīng)用中，所述降低植物抗氧化能力通過(guò)提高植物過(guò)氧化氫含量和/或提高植物丙二醛含量體現(xiàn)。上述提高植物抗氧化能力通過(guò)降低植物過(guò)氧化氫含量和/或降低植物丙二醛含量體現(xiàn)。
上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物；在本發(fā)明的實(shí)施例中所述雙子葉植物具體
為苜蓿。沉默MtSKLl蛋白編碼基因的表達(dá)的方法在如下I) -4)中的至少一種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍1)提高植物耐逆性；2)提高植物中脯氨酸含量；3)提高植物中可溶性糖含量；4)提高植物抗氧化能力；所述MtSKLl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。沉默MtSKLl蛋白編碼基因的表達(dá)的方法為現(xiàn)有技術(shù)，可采用文獻(xiàn)Penmetsa RV,Cook DR. A legume ethylene-insensitive mutant hyper-infected by its rhizobialsymbiont. Science, 1997，275:527-530 中記載的方法。本發(fā)明通過(guò)對(duì)MtSKLl基因突變體ski與其野生型苜蓿A17進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)MtSKLl基因突變體ski的耐低溫能力、脯氨酸和可溶性糖含量以及對(duì)氧化脅迫的抵御能力均高于野生型；表明，MtSKLl基因突變不僅增強(qiáng)了植物耐低溫脅迫的能力，還增加了脯氨酸和可溶性糖含量的積累，以及提高了植物的抗氧化能力。


圖I為MtSKLl基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)圖2為MtSKLl基因突變體ski中乙烯釋放量的變化圖3為MtSKLl基因突變體ski冷凍半致死溫度圖4為MtSKLl基因突變體ski冷凍存活率圖5為MtSKLl基因突變體ski中脯氨酸合成圖6為MtSKLl基因突變體ski中可溶性糖合成圖7為MtSKLl基因突變體ski中過(guò)氧化氫(H202)含量(A)和丙二醛含量(MDA)(B)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中涉及定量檢測(cè)的，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中所用的MtSKLl基因突變體ski (Penmetsa RV, Cook DR. Alegume ethylene-insensitive mutant hyper-infected by its rhizobial symbiont.Science, 1997，275:527-530 ;公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得；突變體ski為野生型苜蓿A17僅在MtSKLl基因發(fā)生點(diǎn)突變，而其他基因沒(méi)有變化；為沉默或失活MtSKLl基因表達(dá)的苜蓿突變體)。下述實(shí)施例中所用的野生型苜猜A17 (Medicago truncatula Gaertn. cvJemalong)記載在 Penmetsa RV, Cook DR. A legume ethylene-insensitive mutanthyper-infected by its rhizobial symbiont. Science, 1997，275:527-530 ;公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得。下述實(shí)施例中的MtSKLl基因的核苷酸序列為序列表中的序列I ;MtSKLl基因編碼的蛋白MtSKLl的氨基酸序列為序列表中的序列2。實(shí)施例I、MtSKLl基因的研究一、MtSKLl基因在耐低溫脅迫下的表達(dá)量
野生型苜蓿Al7播種，培養(yǎng)21天后，經(jīng)過(guò)4°C低溫處理不同時(shí)間(O到72小時(shí))后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，用到的引物序列由 Invitrogen 公司合成，具體如下MtSKLl (MTR_7gl01410)的引物 Upprimer: 5’-CTG ATGACC ACC TTA GCA AAT GA-3’ ；Down primer :5' -TAA TGA AGC CAA CCT GGT ATG TC-3’ ；定量PCR反應(yīng)在Mx3000P Sequence Detection System上進(jìn)行，每個(gè)基因每次設(shè)三個(gè)重復(fù)，定量PCR分析通過(guò)SYBR Green熒光染料與DNA雙鏈(目的片段的PCR產(chǎn)物)結(jié)合，并利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀在72°C步驟檢測(cè)熒光強(qiáng)度，來(lái)判定PCR產(chǎn)物的量。因?yàn)槊總€(gè)樣品中RNA含量不同，樣品中的cDNA的量需用同一個(gè)樣品所檢測(cè)到的Actin cDNA (Actin擴(kuò)增引物Up primer:ACGAGCGTTTCAGATG ；Down primer:ACCTCCGATCCAGACA)的含量來(lái)確定。定量PCR反應(yīng)體系
5 μι第·鏈cDNA模板
I PLI:游引翁I (10 PM)
IML十游引物(10 PM)
12, 5 P-L SYBR GreenI;RTM qPCR Supermi x In i versa I (丨 n\.· i trogen 公
f l)
ddH20 補(bǔ)足到25 μ 反應(yīng)條件為95°CIOmin ；[95°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec] X40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果如圖I所示，可以看出，低溫脅迫迅速抑制MtSKLl基因表達(dá)，低溫處理5小時(shí)后MtSKLl基因的表達(dá)量只有不進(jìn)行低溫處理(低溫處理O小時(shí))的45%，說(shuō)明MtSKLl基因與低溫脅迫有關(guān)。二、MtSKLl基因突變體ski中乙烯釋放量的變化將MtSKLl基因突變體ski和野生型苜蓿A17的地上部稱(chēng)重后放于IOmL小瓶中，自然釋放I小時(shí)后封口，25°C收集I小時(shí)，用微量注射器取瓶中氣體lmL，注入氣相色譜(GC2014,島津)，以乙烯標(biāo)準(zhǔn)氣體做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；具體如下I、氣相色譜(GC2014，島津)使用(I)先開(kāi)N2，H2?？諝?，氮?dú)猓瑲錃庵婚_(kāi)總閥，逆時(shí)針擰為開(kāi)，順時(shí)針關(guān)。
(2)開(kāi)電腦，GC主機(jī),打開(kāi)軟件，file-open method file,打開(kāi)乙烯方法的標(biāo)線(xiàn)，download。(3)點(diǎn)擊 system on DFIDl 高于 150 度點(diǎn) Flame on。(4)主機(jī)上mount鍵，火焰由虛變實(shí)，點(diǎn)火成功。至溫度升至設(shè)定溫度時(shí)，點(diǎn)擊右上角Slop test，值越小越好，不保存，值小于3 000可看做是基線(xiàn)平穩(wěn)，此時(shí)，儀器狀態(tài)準(zhǔn)備就緒，可測(cè)樣。(5)測(cè)樣的空隙,可點(diǎn)擊zero adjust,使基線(xiàn)回歸零點(diǎn)。2、測(cè)樣Single RunSample login選好要測(cè)樣保存的位置,進(jìn)行命名，sample vial的值必須為I,點(diǎn)擊start取樣Iml上樣(快進(jìn)快出),迅速按主機(jī)上的START鍵,開(kāi)始測(cè)樣，看一下每個(gè)樣選擇的測(cè)定時(shí)間，一般乙烯2. Smin出峰，所以選擇4min，如果需要改動(dòng)，則選擇上面菜單欄的acquisition change stop time,修改每個(gè)樣需要的時(shí)間。點(diǎn)擊start后顯示stand by測(cè)樣進(jìn)行中顯示acquire，測(cè)樣完畢時(shí)顯示ready，此時(shí)可進(jìn)行下一個(gè)樣的測(cè)定。3、測(cè)完關(guān)機(jī)system off DFDIl溫度降至100度一下,關(guān)主機(jī)電源,關(guān)氣。4、重要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)DINJl temperature 100 度，L carrier gas N2/air 20ml/min, Column temperature 50 度，DFIDl temperature 250 度。乙烯標(biāo)準(zhǔn)氣體做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)乙烯(ppm)=0. 92012*峰面積/11898. 3結(jié)果如圖2所示，與野生型苜蓿A17相比，MtSKLL基因突變體ski的乙烯釋放量沒(méi)有明顯改變。實(shí)施例2、MtSKLl基因在調(diào)控植物耐低溫中的應(yīng)用I、冷凍半致死溫度分別選取野生型苜蓿A17和MtSKLl基因突變體ski的第2、3片新展開(kāi)的三出葉打孔，隨機(jī)選取3片葉圓片(直徑8mm)放入15mL玻璃試管中，在低溫循環(huán)水浴裝置中進(jìn)行處理。0°C靜置I小時(shí)后向試管中加入200 μ L的冰晶(PCR管中加入200 μ L的ddH20預(yù)先凍制)，繼續(xù)0°C平衡I小時(shí)后溫度調(diào)至-rC，之后以2°C/h的速率下降至所需溫度，每個(gè)溫度點(diǎn)停留30分鐘，分別在-2、-4、-6、-10、-12°C時(shí)取出5管放于4°C冰柜中恢復(fù)過(guò)夜，次日向每管中加入6mL ddH20，200r/min，25°C條件下?lián)u晃2小時(shí)使之充分搖勻，測(cè)定電導(dǎo)率值(Cl)(雷磁DDS-307電導(dǎo)率儀)，測(cè)畢，將各試管蓋塞封口，置高壓鍋中高壓處理10分鐘殺死植物組織。取出試管后自然冷卻至室溫，搖勻，測(cè)其電導(dǎo)值(C2)。相對(duì)電導(dǎo)率=Cl/C2X 100%。電解質(zhì)泄露50%的電導(dǎo)率值所需要的溫度定義為半致死溫度(LT5tl),用LT5tl來(lái)表示植物對(duì)低溫的抗性，LT50值越低說(shuō)明植物耐低溫能力越強(qiáng)。結(jié)果如圖3所示，野生型苜蓿A17的LT5tl為-6.3°C ;MtSKLl基因突變體的LT5tl為-7. 30C ;可以看出，與野生型相比，MtSKLl基因突變體的半致死溫度比野生型下降1°C。表明，突變MtSKLl基因會(huì)提高植物耐低溫性，而MtSKLl基因會(huì)降低植物耐低溫性。2、存活率將MtSKLl基因突變體ski和野生型苜蓿A17植株播種，培養(yǎng)21天后，放在低溫培養(yǎng)箱中(Tenney Environmental Test Equipment, made in United States)進(jìn)行冷凍處理先在0°C平衡6小時(shí)后，調(diào)至-6度處理10小時(shí)后，再在4°C過(guò)夜恢復(fù)；次日將材料轉(zhuǎn)移到正常條件下繼續(xù)生長(zhǎng)7天后對(duì)存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果如圖4所示，A為ski突變體冷凍存活率，B為存活狀況照片；可以看出，MtSKLl基因突變體ski存活率為52% ;野生型苜蓿A17植株存活率為36% ;突變體ski存活率比野生型增加了近45%。表明，突變MtSKLl基因會(huì)提高 植物耐低溫性，而MtSKLl基因會(huì)降低植物耐低溫性。實(shí)施例3、MtSKLl基因在調(diào)控植物中脯氨酸含量中的應(yīng)用將MtSKLl基因突變體ski和野生型苜蓿A17植株播種，培養(yǎng)21天后，進(jìn)行脯氨酸含量測(cè)定，脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮法；具體操作如下I、稱(chēng)取O. 5g苜蓿葉片放入研缽中，用總量IOmL的80%乙醇水溶液少許研磨成漿，將勻漿移入大試管并用剩余80%乙醇洗研缽，向試管中加入50mg的活性炭，試管加蓋，黑暗浸提I小時(shí)。2、過(guò)濾提取液用濾紙過(guò)濾，室溫(25°C)離心5分鐘(3，OOOrpm)，收集上清液。3、取上清液2mL，加入2mL冰乙酸，2mL茚三酮溶液(2. 5g茚三酮溶于60mL冰醋酸和40mL 6M的磷酸中，不高于70°C的條件下加熱溶解)于試管中，充分混勻，沸水浴20分鐘，冷卻，515nm測(cè)OD值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出待測(cè)樣品中脯氨酸含量。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)取2mL濃度分別為0，2，4，6，8，10 μ g/mL脯氨酸標(biāo)液，按步驟3反應(yīng)后測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。5、計(jì)算結(jié)果脯氨酸含量(yg/gFff) = (CX5)/ff ；C :查得樣品的脯氨酸含量(μ g)；1:樣品鮮重(8);5 :提取液IOmL與測(cè)定樣品液體積2mL比。結(jié)果如圖5所示，MtSKLl基因突變體ski中脯氨酸含量為207 μ g g—1 Fff ;野生型苜蓿A17中脯氨酸含量為132 μ g g—1 FW5MtSKLl基因突變體ski比野生型苜蓿A17增加了大約56%。表明，突變MtSKLl基因會(huì)提高苜蓿中的脯氨酸含量，而MtSKLl基因會(huì)降低苜蓿中的脯氨酸含量。實(shí)施例4、MtSKLl基因在調(diào)控植物中可溶性糖含量中的應(yīng)用將MtSKLl基因突變體ski和野生型苜蓿A17植株播種，培養(yǎng)21天后，進(jìn)行可溶性糖含量測(cè)定，可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法(Bailey 1958);具體操作如下I、稱(chēng)取O. 5g苜蓿葉片，放入離心管，加入IOmL 80%乙醇水溶液，80°C提取30分鐘，活性炭脫色30分鐘，離心取上清液為待測(cè)液。吸取待測(cè)液lmL、蒽酮試劑5mL于20mL試管中，充分振蕩后立即將試管放入沸水中，準(zhǔn)確保溫15分鐘，取出后冰浴，測(cè)定630nm處OD值。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作取6支大試管,從0-5分別編號(hào),按下表I加入各試劑。表I為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作的添加量
權(quán)利要求
1.MtSKLl蛋白或其編碼基因在調(diào)控植物性狀中的應(yīng)用；所述調(diào)控植物性狀為如下I) -4)中的至少一種 O降低或提高植物耐逆性； 2)降低或提高植物中脯氨酸含量； 3)降低或提高植物中可溶性糖含量； 4)降低或提高植物抗氧化能力； 所述MtSKLl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述MtSKLl蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于 所述耐逆為耐低溫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于 所述降低植物抗氧化能力通過(guò)提高植物過(guò)氧化氫含量和/或提高植物丙二醛含量體現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述雙子葉植物為苜蓿。
7.沉默MtSKLl蛋白編碼基因的表達(dá)的方法在如下I)-4)中的至少一種中的應(yīng)用 1)提高植物耐逆性； 2)提高植物中脯氨酸含量； 3)提高植物中可溶性糖含量； 4)提高植物抗氧化能力； 所述MtSKLl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種MtSKL1蛋白及其編碼基因在控制植物性狀中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了MtSKL1蛋白或其編碼基因在調(diào)控植物性狀中的應(yīng)用；所述調(diào)控植物性狀為如下1)-4)中的至少一種1)降低植物耐逆性；2)降低植物中脯氨酸含量；3)降低植物中可溶性糖含量；4)降低植物抗氧化能力；所述MtSKL1蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過(guò)對(duì)MtSKL1基因突變體sk1與其野生型苜蓿A17進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MtSKL1基因突變體sk1的耐低溫能力、脯氨酸含量和可溶性糖含量、抗氧化能力均高于野生型；表明，MtSKL1基因可以調(diào)節(jié)植物耐低溫能力、產(chǎn)生脯氨酸和可溶性糖含量的能力以及改變抗氧化的能力。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102942622SQ201210457468
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者張文浩, 趙敏桂, 劉文景 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所