專利名稱：1,2,4-丁三醇的生物合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種1，2，4- 丁三醇的生物合成方法，特別涉及一種利用重組大腸桿菌將蘋果酸及其鹽形式轉(zhuǎn)化為1，2，4- 丁三醇的方法。
背景技術(shù)：
為了滿足人類生產(chǎn)和生活方式不斷進步的各種需求，越來越多的重要化學(xué)品受到了研究者的廣泛關(guān)注。其中，1，2，4-丁三醇是一種在軍工和民用上都具有重要用途的化學(xué)品。它是手性多羥基醇，主要用于合成高能材料1，2，4-丁三醇三硝酸酯，后者可用作飛機、火箭、導(dǎo)彈等軍事武器的推進劑，較傳統(tǒng)的硝化甘油具有沖擊敏感性更低、熱穩(wěn)定性更好、揮發(fā)性更小和加工安全性更高四大優(yōu)點，是硝化甘油理想、安全的替代品。硝化甘油目前在美國雙基推進劑中的用量超過130萬噸/年，若全部被1，2，4_ 丁三醇三硝酸酯替代，則1， 2，4- 丁三醇在美國軍用方面的潛在市場需求量至少為170萬噸/年，按照目前1，2，4- 丁三醇12-19萬元/噸的價格估算，其僅在美國軍用市場上的市值就至少達2，000-3，000億元/年。此外，1,2,4- 丁三醇還可用于制備生物活性劑、醫(yī)藥用緩釋劑、卷煙添加劑、抗菌劑、彩色顯影劑等。目前1，2，4-丁三醇主要以石油化工產(chǎn)品為原料，依靠化學(xué)法在高溫高壓下催化生產(chǎn)。其商業(yè)化的生產(chǎn)方式是，將蘋果酸二甲酯在NaBH4和C2-C6醇的中進行還原反應(yīng)，得率為O. 48g/g。其存在的主要弊端有原料成本高、反應(yīng)能耗大、生產(chǎn)危險性大、副產(chǎn)物多、環(huán)境污染嚴(yán)重等。在當(dāng)今各種全球問題的巨大壓力下，人們更傾向于利用廉價的、可再生的生物質(zhì)資源為原料，通過簡單高效、對環(huán)境友好的生物發(fā)酵過程來生產(chǎn)1，2，4- 丁三醇。但是，由于自然界不存在1，2，4- 丁三醇的天然生物合成途徑，所以生物法生產(chǎn)1，2，4- 丁三醇的研究進展比較緩慢。迄今為止，僅一位美國學(xué)者在政府的大力支持下，先是利用木糖或阿拉伯糖原料，建立了 1，2,4- 丁三醇的生物合成途徑(Niu, ff.，Molefe, M. N.，F(xiàn)rost,J. ff. Microbial synthesis ofthe energeticmaterial precursorl,2, 4-butanetriol.Journal ofthe American Chemical Society. 2003，125 (43) : 12998-12999.),之后經(jīng)過不斷優(yōu)化，提高了木糖途徑的1，2，4- 丁三醇產(chǎn)量，達到35g/L木糖的生產(chǎn)水平(J · W ·佛羅斯特，W ·牛，D-1，2，4-丁三醇的微生物合成，中國專利申請?zhí)?200780032753. 9,申請日:2007年 7 月 19 日；JohnW. Frost, GreenSyntheisofD-l, 2,4ButantetroilfromD-Glucose· 2009Annual Report,GrantNo. N000140710323)。繼而再改造戍糖磷酸途徑，以期利用葡萄糖而非木糖為原料，降低原料成本。截至目前，已通過兩步法的生產(chǎn)方式，實現(xiàn)了以葡萄糖為原料的 1，2，4-丁三醇的生物合成(John ff. Frost, Green Syntheis ofD-1, 2, 4ButantetroilfromD-Glucose. 2009Annual Report, GrantNo. N000140710323):第一步，利用大腸桿菌 WY9/PffYl實現(xiàn)了從葡萄糖到木質(zhì)酸的生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)量為5. 5g/L木質(zhì)酸；第二步，利用大腸桿菌DH5 a /pffN6. 186A實現(xiàn)了從木質(zhì)酸到1，2，4- 丁三醇的生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量均未報道。而將該兩步合在起，將葡萄糖直接轉(zhuǎn)化為1，2，4-丁三醇的一步法生產(chǎn)則未取得成功。究其原因，可能是由于葡萄糖本身在大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中，進入戊糖磷酸途徑的效率并不是很高所致。而葡萄糖經(jīng)糖酵解進入TCA循環(huán)的效率則相對較高。綜上所述，如果能為將來建立一套擁有自主產(chǎn)權(quán)的、原料價格低廉的、合成途徑全新的、轉(zhuǎn)化效率較高的1，2，4_ 丁三醇的生物合成方法，將具有重要意義。目前尚未有以蘋果酸或其鹽類形式為原料生物合成1，2，4- 丁三醇的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種1，2，4- 丁三醇的生物合成方法。本發(fā)明所提供的制備1，2，4- 丁三醇的方法，包括用重組生物細(xì)胞將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1，2，4- 丁三醇的步驟；所述重組生物細(xì)胞表達具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1，2，4-丁三醇功能的酶系統(tǒng)。在上述方法中，所述將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1，2，4_ 丁三醇，具體包括如下步驟
(I)將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A ; (2 )將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛；(3)將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2，4-二羥基丁酸；(4)將所述2，4-二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為
2,4-二羥基丁酰輔酶A ; (5)將所述2，4- 二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為2，4- 二羥基丁醛；(6)將所述2，4- 二羥基丁醛轉(zhuǎn)化為1，2,4- 丁三醇。在上述方法中，所述酶系統(tǒng)具體包括如下(al) - (a5)(al)具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A功能的酶I ;(a2)具有將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛功能的酶2 ； (a3)具有將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2，4- 二羥基丁酸功能的酶3 ; (a4)具有將所述2，4- 二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為2，4- 二羥基丁酰輔酶A功能的酶4 ；(a5)具有將所述2，4- 二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為1，2，4- 丁三醇功能的酶5。具體的，所述酶I為琥珀酰輔酶A合成酶、蘋果酸硫激酶中的至少一種；所述酶2為琥珀酸半醛脫氫酶；所述酶3為4-羥基丁酸脫氫酶；所述酶4為4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、肉桂酰輔酶A:苯乳酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶中的至少一種；所述酶5為雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶。在本發(fā)明的一個實施例中，所述酶系統(tǒng)具體由如下酶I-酶5組成所述酶I為百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti ) MAFF303099的琥拍酰輔酶A合成酶；所述琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基的氨基酸序列如序列表中序列I所示，所述琥珀酰輔酶A合成酶的α亞基的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述酶2為牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的琥拍酸半醒脫氫酶；所述琥珀酸半醛脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述酶3為牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis) W83的4_輕基丁酸脫氫酶；；所述4-羥基丁酸脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述酶4為牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis) W83的4_輕基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶；所述4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述酶5為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) DSM1731的雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶；所述雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列6所
/Jn ο序列I由394個氨基酸組成；序列2由299個氨基酸組成；序列3由451個氨基酸組成；序列4由371個氨基酸組成；序列5由431個氨基酸組成；序列6由858個氨基酸組成。在上述方法中，所述重組生物細(xì)胞是將如上所述酶系統(tǒng)的編碼基因?qū)肽康纳锛?xì)胞后得到的表達所述酶系統(tǒng)的重組生物細(xì)胞如序列表中序列7所示的所述琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基的編碼基因，如序列表中序列8所示的所述琥珀酰輔酶A合成酶的α亞基的編碼基因；如序列表中序列9所示的所述琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因；如序列表中序列10所示的所述4-羥基丁酸脫氫酶的編碼基因；如序列表中序列11所示的所述4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因；
如序列表中序列12所示的所述雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶的編碼基因。在本發(fā)明的一個實施例中，將所述酶系統(tǒng)的編碼基因?qū)肽康纳锛?xì)胞，具體為通過將攜帶并表達所述酶系統(tǒng)的編碼基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入所述目的生物細(xì)胞中實現(xiàn)的。所述重組質(zhì)粒具體為下述重組質(zhì)粒A和下述重組質(zhì)粒B。在上述方法中，所述生物細(xì)胞可為微生物細(xì)胞、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞；在本發(fā)明的一個實施例中，所述生物細(xì)胞具體為大腸桿菌，如大腸桿菌BL21(DE3)。本發(fā)明的再一個目的是提供如下DNA片段中的至少一種(bl)核苷酸序列為序列表中序列7所示的DNA片段(百脈根根瘤菌(Mesorhizobiumloti)MAFF303099的琥珀酰輔酶A合成酶β亞基的優(yōu)化后核苷酸序列)；(b2)核苷酸序列為序列表中序列8所示的DNA片段(百脈根根瘤菌(Mesorhizobiuanloti )MAFF303099的琥珀酰輔酶A合成酶α亞基的優(yōu)化后核苷酸序列)；(b3)核苷酸序列為序列表中序列9所示的DNA片段(牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis) W83的琥拍酸半醒脫氫酶的優(yōu)化后核苷酸序列)；(b4)核苷酸序列為序列表中序列10所示的DNA片段；(牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis) W83的4-輕基丁酸脫氫酶的優(yōu)化后核苷酸序列)(b5)核苷酸序列為序列表中序列11所示的DNA片段(牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis) W83的4-輕基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)化后核苷酸序列)；(b6)核苷酸序列為序列12所示的DNA片段(丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum) DSM1731的雙功能乙醛輔酶A/醇?xì)涿傅膬?yōu)化后核苷酸序列)。上述6個DNA片段均為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因；所述優(yōu)化為在不改變相應(yīng)酶的氨基酸序列的前提下，將野生型基因的密碼子替換為大腸桿菌偏好(高頻使用)的密碼子。其中，序列7由1185個核苷酸組成，編碼序列表中序列I所示的蛋白；序列8由900個核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白；序列9由1356個核苷酸組成，編碼序列表中序列3所示的蛋白；序列10由1116個核苷酸組成，編碼序列表中序列4所示的蛋白；序列11由1296個核苷酸組成，編碼序列表中序列5所示的蛋白；序列12由2577個核苷酸組成，編碼序列表中序列6所示的蛋白。本發(fā)明的又一個目的是提供如下(Cl)或(c2)的生物材料(Cl)重組質(zhì)粒A和/或重組質(zhì)粒B :所述重組質(zhì)粒A為攜帶并表達上述(bl)_(b4)中所述DNA片段的重組表達載體；所述重組質(zhì)粒B為攜帶并表達上述(b5)和(b6)中所述DNA片段的重組表達載體；所述重組質(zhì)粒A和所述重組質(zhì)粒B中啟動(bl) - (b6)中所述DNA片段表達的啟動子均為T7啟動子。具體的,所述重組質(zhì)粒A為在質(zhì)粒pET_30a的多克隆位點處插入一個序列7所示DNA片段、一個序列8所示DNA片段、一個序列9所示DNA片段、一個序列10所示DNA片段，和三個序列13所示DNA片段后所形成的重組質(zhì)粒，使所述重組質(zhì)粒A中形成如下1)-4)四個片段單元1)自5’端至3’端依次包含序列13和序列7 ；2)自5’端至3’端依次包含序列13和序列8 ；3)自5’端至3’端依次包含序列13和序列9 ；4)自5’端至3’端依次包含序列13和序列10 ;所述重組質(zhì)粒B為在質(zhì)粒pACYC184的酶切位點處插入一個序列11所示的DNA片段、一個序列12所示的DNA片段、兩個序列13所示的DNA片段，和一個序列14所示的DNA片段后所形成的重組質(zhì)粒，使所述重組質(zhì)粒B中形成如下1)-2)兩個片段單元I)自5’端至3’端依次包含序列13和序列11 ；2)自5’端至3’端依次包含序列13、序列12和序列14 ；其中，序列13為T7啟動子的核苷酸序列；序列14為T7終止子的核苷酸序列。更加具體的，所述重組質(zhì)粒A中，I)中所述片段單元和2)中所述片段單元順次串 聯(lián)位于酶切位點Nde I和BamH I之間；3)中所述片段單元位于酶切位點BamH I和Not I之間；4)中所述片段單元位于酶切位點Not I和Xho I之間。所述重組質(zhì)粒B中，I)中所述片段單元位于酶切位點Ava I和Ahd I之間；2)中所述片段單元位于酶切位點Ahd I和Bcl I之間。(c2)重組大腸桿菌I或/和重組大腸桿菌2或/和重組大腸桿菌3 :所述重組大腸桿菌I為攜帶所述重組質(zhì)粒A和所述重組質(zhì)粒B，并表達(bl) - (b6)中所述DNA片段的大腸桿菌；所述重組大腸桿菌2為攜帶所述重組質(zhì)粒A，并表達(bl) - (b4)中所述DNA片段的大腸桿菌；所述重組大腸桿菌3為攜帶所述重組質(zhì)粒B，并表達(b5)和(b6)中所述DNA片段的大腸桿菌。在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組大腸桿菌I為采用所述重組質(zhì)粒A和所述重組質(zhì)粒B共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，得到的表達所述酶1_酶5的大腸桿菌；所述重組大腸桿菌2為采用所述重組質(zhì)粒A轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)后，得到的表達所述酶1_酶3的大腸桿菌；所述重組大腸桿菌3為采用所述重組質(zhì)粒B轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，得到的表達所述酶4和酶5的大腸桿菌；當(dāng)然，只要是采用本專利所述的蘋果酸途徑的六步反應(yīng)，或是其中的若干步反應(yīng)，來合成1，2，4- 丁三醇，則含有(bl)- (b6)所述DNA片段，或是其中的若干DNA片段的表達盒、重組細(xì)胞系，以及除上述重組大腸桿菌外的其他重組菌也均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明建立了全新的以蘋果酸及其鹽為原料，通過生物合成途徑制備1，2，4-丁三醇的方法。本發(fā)明對建立擁有自主產(chǎn)權(quán)、原料價格低廉、合成途徑全新、轉(zhuǎn)化效率較高的1，2，4-丁三醇生物合成方法具有重要意義。


圖I為1，2，4- 丁三醇的生物合成途徑(蘋果酸途徑)。圖2為重組表達載體PET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD的質(zhì)粒圖譜。其中，1-2代表mtkAB-2 ；2-1 代表 sucD ;3_1 代表 4HbD。圖3為重組表達載體pACYC184/abfT_2/adhE的質(zhì)粒圖譜。其中，4_1代表abfT_2，56~1 代表 adhE。圖 4 為重組菌株 BL21 (DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE及對照菌株BL21 (DE3) /pET_30a/pACYC184的PCR鑒定結(jié)果。其中，A為重組菌株 BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE ;B 為對照菌株BL21(DE3)/pET-30a/pACYC184。A和B中，M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、......表示對應(yīng)的陽
性菌株。圖5 為重組菌株BL21 (DE3)/pET-30a/mtkAB_2/sucD/4HbD 及對照菌株BL21 (DE3 ) /pET-30a 的 PCR 鑒定結(jié)果。其中，A 為重組菌株 BL21 (DE3)/pET-30a/mtkAB_2/sucD/4HbD ；B為對照菌株BL21 (DE3)/pET-30a。A和B中，M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、……表示對應(yīng)的陽性菌株。圖6 為重組菌株 BL21 (DE3) /pACYC184/abf T-2/adhE 及對照菌株 BL21 (DE3) /PACYC184 的 PCR 鑒定結(jié)果。其中，A 為重組菌株 BL21 (DE3)/pACYC184/abfT_2/adhE ；B 為對照菌株BL21(DE3)/pACYC184。A和B中，M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、……表示對應(yīng)的陽性菌株。圖7為從蘋果酸或其鹽到1，2，4_ 丁三醇的蘋果酸途徑六步反應(yīng)的發(fā)酵液的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果。其中，A為1，2，4_ 丁三醇標(biāo)準(zhǔn)品的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果(選擇離子模式檢測)；B 為重組菌 BL21 (DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE 的發(fā)酵濾液的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果(選擇離子模式檢測)。圖8為從蘋果酸或其鹽到1，2，4- 丁三醇的蘋果酸途徑前三步反應(yīng)的發(fā)酵液的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果。其中，A為2，4_ 二羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果(選擇離子模式檢測)；B為重組菌株BL21 (DE3)/pET-30a/mtkAB-2/SucD/4HbD發(fā)酵液的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果(選擇離子模式檢測);C為重組菌株BL21 (DE3) /PET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD發(fā)酵液的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果(全掃描模式檢測)，目標(biāo)峰即為2，4_ 二羥基丁酸山為目標(biāo)峰2，4_ 二羥基丁酸的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。圖9為從2，4- 二羥基丁酸到1，2，4_ 丁三醇的蘋果酸途徑后三步反應(yīng)的發(fā)酵液的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果。其中，A為1，2，4_ 丁三醇標(biāo)準(zhǔn)品的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果(全掃描模式檢測)；B為重組菌株BL21 (DE3) /pACYC184/abfT_2/adhE發(fā)酵液的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果(選擇離子模式檢測)；C為重組菌株BL21 (DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE發(fā)酵液的氣質(zhì)聯(lián)用檢測結(jié)果(全掃描模測)，目標(biāo)峰即為1，2，4_ 丁三醇山為目標(biāo)峰1，2，4_ 丁三醇的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
具體實施主式本發(fā)明中制備1，2，4-丁三醇的方法，是在生物細(xì)胞中通過酶系統(tǒng)將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1，2，4-丁三醇。該方法所涉及的途徑稱為蘋果酸途徑，具體包括如下6步驟(圖
O(I)將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A ; (2 )將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛；(3)將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2，4- 二羥基丁酸；(4)將所述2，4- 二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為
2,4-二羥基丁酰輔酶A ; (5)將所述2，4- 二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為2，4- 二羥基丁醛；(6)將所述2，4- 二羥基丁醛轉(zhuǎn)化為1，2,4- 丁三醇。以上6步反應(yīng)順次所對應(yīng)的酶為如下(al) - (a5)
(al)具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A功能的酶，如琥珀酰輔酶A合成酶、蘋果酸硫激酶等；(a2)具有將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛功能的酶，如琥珀酸半醛脫氫酶等；(a3)具有將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2，4-二羥基丁酸功能的酶，如4-羥基丁酸脫氫酶等；(a4)具有將所述2，4- 二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為2，4- 二羥基丁酰輔酶A功能的酶，如4羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、肉桂酰輔酶A:苯乳酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶等；(a5)具有將所述2，4-二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為1，2，4- 丁三醇功能的酶，如雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶等。下面結(jié)合具體實施例進步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，下述實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。質(zhì)粒pET_30a N0V0GEN公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pACYC184 :上?？婆d生物科技有限公司；大腸桿菌BL21 (DE3):北京全式金生物技術(shù)有限公司。實施例I、用于生物合成1，2，4-丁三醇的重組大腸桿菌的構(gòu)建
一、重組表達載體 pET-30a/mtkAB_2/sucD/4HbD 的構(gòu)建1、6步催化反應(yīng)中步驟(I) - (3)所用酶基因的選擇及優(yōu)化針對6步反應(yīng)中步驟(I)的催化反應(yīng),選取百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti)MAFF303099的琥珀酰輔酶A合成酶基因(mtkAB-2)，對所述琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基的基因序列和α亞基的基因序列分別進行密碼子優(yōu)化，在不改變相應(yīng)酶的氨基酸序列的前提下，將野生型基因的密碼子替換為大腸桿菌偏好(高頻使用)的密碼子。優(yōu)化后的所述琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基的核苷酸序列如序列表中序列7所示，優(yōu)化后的α亞基的核苷酸序列如序列表中序列8所示。序列7和序列8即分別為百脈根根瘤菌(Mesorhizobiumloti)MAFF303099的琥珀酰輔酶A合成酶β亞基和α亞基的編碼序列，分別編碼序列表中的序列I和序列2所不的蛋白質(zhì)。針對步驟(2)的催化反應(yīng),選取牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的琥珀酸半醛脫氫酶基因(sucD)，對其采用同上的方式進行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的所述琥珀酸半醛脫氫酶基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示。序列9即為牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis) W83的琥酸半醒脫氫酶的編碼序列，編碼序列表中的序列3所示的蛋白質(zhì)。針對步驟(3)的催化反應(yīng),選取牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的4-羥基丁酸脫氫酶基因(4HbD)，對其采用同上的方式進行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的所述4-羥基丁酸脫氫酶基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示。序列10即為牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis) W83的4-輕基丁酸脫氫酶基因的編碼序列,編碼序列表中的序列4所示的蛋白質(zhì)。2、重組表達載體 pET-30a/mtkAB_2/sucD/4HbD 的構(gòu)建DNA片段“β亞基+Τ7啟動子+α亞基”自5’端至3’端，其核苷酸序列依次為GATCAT+ 序列 7+TGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAAT+ 序列 13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATA+ 序列8+GGATCCGAT,下劃線部分依次為限制件內(nèi)切酶Nde I(CATATG，其中ATG來自序列7中的起始密碼子)和BamH I的識別序列，“ + ”表示直接相連。DNA片段“Τ7啟動子+sucD” 自5’端至3’端，其核苷酸序列依次為GATGGATCC+TGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAAT+ 序列 13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAT+CCTAGG+ 序列9+GCGGCCGCGAT,其中下劃線部分依次為限制件內(nèi)切酶BamH I, Avr II和Not I的識別序
列，“ + ”表示直接相連。DNA片段“T7啟動子+4HbD” 自5’端至3’端，其核苷酸序列依次為GATGCGGCCGC+TGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAAT+ 序列 13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAT+ACTAGT+ 序列10+CTCGAGGAT,其中下劃線部分依次為限制件內(nèi)切酶Not I, Spe I和Xho I的識別序列，
“ + ”表示直接相連。首先，將DNA片段“ β亞基+Τ7啟動子α亞基”用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I進行雙酶切，與經(jīng)過同樣酶切的pET-30a載體大片段相連，將經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒 命名為pET-30a/mtkAB-2。接著，將DNA片段“T7啟動子+sucD”用限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I進行雙酶切，與經(jīng)過同樣酶切的pET-30a/mtkAB-2載體大片段相連，將經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-30a/mtkAB-2/sucD。最后，將DNA片段“T7啟動子+4HbD”用限制性內(nèi)切酶Not I和Xho I進行雙酶切，與經(jīng)過同樣酶切的pET-30a/mtkAB-2/sucD載體大片段相連，將經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD (質(zhì)粒圖譜如圖2所示)。二、重組表達載體 pACYC184/abfT_2/adhE 的構(gòu)建1、6步催化反應(yīng)中步驟(4)- (6)所用酶基因的選擇及優(yōu)化針對步驟(4)的催化反應(yīng),選取牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83的4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(abfT-2)，對其采用同步驟中所述的方式進行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的所述4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因基因的核苷酸序列如序列表中序列11所示。序列11即為牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis) W83的4-輕基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼序列，編碼序列表中的序列5所示的蛋白質(zhì)。針對步驟(5)和(6)的催化反應(yīng)，選取丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum) DSM1731的雙功能乙醒輔酶A/醇脫氫酶,對其采用同上的方式進行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的所述雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶基因的核苷酸序列如序列表中序列12所不。序列12即為丙酮丁醇梭菌(Clostridhmacetobutylicum)DSM1731的雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶基因的編碼序列，編碼序列表中的序列6所示的蛋白質(zhì)。2、重組表達載體 pACYC184/abfT_2/adhE 的構(gòu)建DNA片段“T7啟動子+abfT-2”:自5’端至3’端，其核苷酸序列依次為GATCTCGGG+TGCTYAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATGTACACGGCCGCATAATCGAAAT+ 序列 13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATA+CAT+ 序列 11+GACTGAGAGTCGAT。其中下劃線部分依次為限制性內(nèi)切酶Ava I.Nde I (CATATG，其中ATG來自序列11中的起始密碼子)和AhdI的識別序列，“ + ”表示直接相連。DNA片段“T7啟動子+adhE+T7終止子”自5’端至3’端，其核苷酸序列依次為GATGACTGAGAGC+TGCTYAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTAGACGGCCGCATAATCGAAA+ 序列 13+GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAT+GACGTC+ 序列 12+CTGCAG+TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAAC+序列14+CTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT+TGATCAGAT。其中下劃線部分依次為限制性內(nèi)切酶AhdI、AatII、PstI和BclI的識別序列，“ + ”表示直接相連。首先，將DNA片段“T7啟動子+abfT_2”用限制性內(nèi)切酶Aval和AhdI進行雙酶切，與經(jīng)過同樣酶切的PACYC184載體大片段相連，將經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pACYC/abfT-2。接著，將DNA片段“T7啟動子+adhE+T7終止子”用限制性內(nèi)切酶AhdI和BclI進行雙酶切，與經(jīng)過同樣酶切的pACYC/abfT-2載體大片段相連，將經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pACYC/abfT-2/adhE (質(zhì)粒圖譜如圖3所示)。三、用于從蘋果酸或其鹽生物合成1，2，4- 丁三醇的重組大腸桿菌的構(gòu)建將步驟和步驟二中的重組表達載體PET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD和pACYC184/abfT-2/adhE，共轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL21(DE3)中，轉(zhuǎn)化后涂布到含有50μ g/mL卡那霉素 和25 μ g/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上進行壓力篩選，挑取若干個單菌落，接種到含50 μ g/mL卡那霉素和25 μ g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。以菌液為模板，分別用PETup和1-2內(nèi).P2引物對與56-1內(nèi).5P和末2. R引物對，進行PCR擴增，分別能擴增得到大小約為825bp和2210bp的目的條帶(圖4中A)的單克隆菌株為陽性重組菌株，命名為 BL21 (DE3) /pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhEo以pETup和1-2內(nèi).P2引物對，進行PCR反應(yīng)的程序為94°C 3min ；94°C 30S，60°C 30S,72°C 30S，28 個循環(huán)；72°C 7min。pETup :5’ -ATGCGTCCGGCGTAGA-3’(pET_30a 載體上的序列)；1-2 內(nèi).P2 :5’ -GAGATTTCCGGACGACGG-3’(序列 7 的第 672-689 位的反向互補序列)。以56-1內(nèi).5P和末2. R引物對，進行PCR反應(yīng)的程序為94°C 3min ；94°C 30S，60°C 30S,72°C 90S, 28 個循環(huán)；72°C 7min。56-1 內(nèi)· 5P :5，-AAACGGTGCTATCAACGC-3，(序列 12 的第 858-875 位)；末2. R :5’-CCGTCTGTGATGGCTTCC-3’(pACYC184 載體上的序列)。同時設(shè)置共轉(zhuǎn)化pET_30a和pACYC184空質(zhì)粒的BL21(DE3)重組菌株，轉(zhuǎn)化后同樣在含50 μ g/mL卡那霉素和25 μ g/mL氯霉素的抗性平板上壓力篩選后，挑取若干個單菌落進行液體培養(yǎng)。以菌液為模板，分別用PET up和T7. R引物對與184末.F和末2. R引物對，進行PCR擴增，分別能擴增得到大小約為400bp和IlOObp (圖4中B)目的條帶的單克隆菌株為陽性對照重組菌株，命名為BL21 (DE3)/pET-30a/pACYC184。以pETup 和 T7. R 引物對，進行 PCR 反應(yīng)的程序為94°C 3min ；94°C 30S，60°C 30S，72 °C 15S，28 個循環(huán)；72°C 7min。pETup :5’ -ATGCGTCCGGCGTAGA-3’(pET_30a 載體上的序列)；Τ7· R :5’ -GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(pET_30a 載體上的序列)。以184末.F和末2. R引物對，進行PCR反應(yīng)的程序為94 °C 3min ；94°C 30S，60°C 30S,72°C 35S，28 個循環(huán)；72°C 7min。184 末· F :5’ -TCGCTAACGGATTCACCAC-3’ (pACYC184 載體上的序列)；末2. R :5’-CCGTCTGTGATGGCTTCC-3’(pACYC184 載體上的序列)。四、用于從蘋果酸或其鹽生物合成2，4- 二羥基丁酸的重組大腸桿菌的構(gòu)建將步驟一中的重組表達載體pET_30a/mtkAB-2/sucD/4HbD轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL21(DE3)中，轉(zhuǎn)化后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上進行壓力篩選，挑取若干個單菌落，接種到含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。以菌液為模板，用3-1P1和3-2P2引物對，進行PCR擴增，能擴增得到大小約為1280bp的目的條帶(圖5中A)的單克隆菌株為陽性重組菌株，命名為BL21(DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD。以3-1P1 和 3-2P2 引物對，進行 PCR 反應(yīng)的程序為94°C 3min ；94°C 30S,60°C 30S,72 °C 45S，28 個循環(huán)；72°C 7min。3-1P1 :5’ -GCGGCCGCTGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCG-3’ (4HbD 的 5，端序列)；3-2P2 :5’ -CTCGAGTTAGTAGAGTCTTCTGTAGA-3’ (4HbD 的 3’ 端反向互補序列)。同時設(shè)置轉(zhuǎn)化pET-30a空質(zhì)粒的BL21 (DE3)重組菌株，轉(zhuǎn)化后同樣在含50 μ g/mL卡那霉素的抗性平板上壓力篩選后，挑取若干個單菌落進行液體培養(yǎng)。以菌液為模板，用 T7. F和T7. R引物對，進行PCR擴增，能擴增得到大小約為370bp (圖5中B)目的條帶的單克隆菌株為陽性對照重組菌株，命名為BL21 (DE3)/pET-30a。以T7. F 和 T7. R 引物對，進行 PCR 反應(yīng)的程序為MV 3min ；94°C 30S，60°C 30S，72 °C 15S，28 個循環(huán)；72°C 7min。Τ7· F :5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’(pET_30a 載體上的序列)；Τ7· R :5’ -GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(pET_30a 載體上的序列)。五、用于從2，4- 二羥基丁酸或其鹽生物合成1，2，4- 丁三醇的重組大腸桿菌的構(gòu)
建將步驟二中的重組表達載體pACYC184/abfT_2/adhE，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL21 (DE3)中，轉(zhuǎn)化后涂布到含有25 μ g/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上進行壓力篩選，挑取若干個單菌落，接種到含25 μ g/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過認(rèn)。以菌液為模板，用56-1P1和56-1P2引物對，進行PCR擴增，能擴增得到大小約為2900bp的目的條帶(圖6中A)的單克隆菌株為陽性重組菌株，命名為BL21 (DE3) /pACYC184/abfT-2/adhEo以56-1P1和56-1P2引物對，進行PCR反應(yīng)的程序為94 V 3min ；94 V 30S，600C 30S,72°C 90S, 28 個循環(huán)；72°C 7min。56-1P1 :5，-GACTGAGAGTCTGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCG-3’ (adhE 的 5，端序列)；56-1P2 :5’ -TGATCAATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’ (adhE 的 3’ 端反向互補序列)。同時設(shè)置轉(zhuǎn)化pACYC184空質(zhì)粒的BL21(DE3)重組菌株，轉(zhuǎn)化后同樣在含25 μ g/mL氯霉素的抗性平板上壓力篩選后，挑取若干個單菌落進行液體培養(yǎng)。以菌液為模板，用步驟三中所述184末.F和末2. R引物對，進行PCR擴增，能擴增得到大小約為IlOObp (圖6中B)目的條帶的單克隆菌株為陽性對照重組菌株，命名為BL21 (DE3)/pACYC184。以184末.F和末2. R引物對，進行PCR反應(yīng)的程序為94 °C 3min ；94°C 30S，60°C 30S,72°C 35S, 28 個循環(huán)；72°C 7min。實施例2、以蘋果酸或其鹽為底物的1，2，4-丁三醇的生物合成及檢測一、通過生物發(fā)酵將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為I，2，4- 丁三醇M9發(fā)酵培養(yǎng)基(各組分的濃度為在培養(yǎng)基中的終濃度)6. 78g/L Na2HPO4, 3. Og/L KH2PO4,0. 5g/LNaCl, I. 0g/LNH4Cl, ImM MgSO4,0. ImM CaCl2, IOmMNaHCO3, 20g/LD_ 葡萄糖，IOOmM MOPS, 10 μ g/ml維生素BI, 50 μ g/ml卡那霉素和25 μ g/ml氯霉素。其中，D-葡萄糖，維生素BI，卡那霉素和氯霉素均經(jīng)O. 22 μ m過膜后，加入到經(jīng)高溫滅菌的含有其他成份的培養(yǎng)基中。取5ml M9發(fā)酵培養(yǎng)基，接種100 μ I能同時表達蘋果酸途徑六步反應(yīng)的酶蛋白的BL21 (DE3) /pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE 重組菌，37°C，200rpm,好氧培養(yǎng)(搖瓶培養(yǎng)，透氣不密封)過夜。取2ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入到20mlM9發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，200rpm,微耗氧培養(yǎng)至OD6tltl=O. 6，加入IPTG至終濃度為O. 25mM,加入蘋果酸或其二鈉鹽至終濃度為lOOmM?？刂苝H為6. 5-7. 0，誘導(dǎo)24h后取發(fā)酵液進行產(chǎn)物檢測。其中，微耗養(yǎng)培養(yǎng)即在厭氧瓶瓶蓋上插入一根Iml注射器的針頭。對照菌株BL21 (DE3)/pET_30a/PACYC184以相同方法進行發(fā)酵測試。實驗重復(fù)三次。二、目標(biāo)產(chǎn)物1，2，4- 丁三醇的檢測
將步驟一所獲得的發(fā)酵液用O. 22 μ m濾膜過濾，取100 μ I發(fā)酵濾液，真空離心干燥，加入20μ I濃度為IOmM的環(huán)己醇內(nèi)標(biāo)溶液(所用溶劑是二甲基甲酰胺(DMF))懸浮，力口入100 μ I “N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(體積百分含量為99%) +三甲基氯硅烷(體積百分含量為1%)”娃烷化試劑，混勻后70°C放置30min。離心5min，取上清，過O. 22 μ m濾膜，濾液用于氣質(zhì)聯(lián)用檢測。以二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑，配制濃度為IOmM的1，2，4-丁二醇標(biāo)準(zhǔn)品。取20 μ IlOmM的1，2,4_ 丁二醇標(biāo)準(zhǔn)品,加入娃燒化試劑后按同樣方法進行娃烷化處理。氣質(zhì)聯(lián)用條件ΗΡ-5柱子(柱長為30米)，不設(shè)分流比，進樣量2μ1，質(zhì)荷比范圍30-500。進樣口溫度設(shè)置為280°C。以氦氣為載體，流速設(shè)置為1.0mL/min。氣質(zhì)升溫程序設(shè)置為80°C保持I. 5min ;以3°C /min的速率升溫至140°C，保持Omin ;以50°C /min的速率升溫至280°C，保持lOmin。目標(biāo)產(chǎn)物僅用選擇離子模式檢測，選擇離子設(shè)定為103m/z，129m/z,219m/z,232m/z。經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用分析，并與1，2，4_ 丁三醇標(biāo)準(zhǔn)品(圖7中A)作比較，結(jié)果表明，重組菌株 BL21 (DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE 的發(fā)酵濾液中含有與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間高度一致的、含有標(biāo)準(zhǔn)品特征離子譜的目標(biāo)峰(圖7中B)。而對照菌株BL21 (DE3)/pET-30a/pACYC184的發(fā)酵濾液中則沒有該目標(biāo)峰。表明重組菌株BL21 (DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD/pACYC184/abfT-2/adhE 的發(fā)酵濾液中的目標(biāo)峰可能即為1，2，4-丁三醇，初步判斷蘋果酸途徑可能已經(jīng)打通。進一步完全鑒定的方法和結(jié)果，見實施例3和實施例4。實施例3、以蘋果酸或其鹽為底物的2，4- 二羥基丁酸的生物合成及檢測一、通過生物發(fā)酵將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為2，4- 二羥基丁酸M9發(fā)酵培養(yǎng)基除不加氯霉素外，其他組成成份、終濃度及配制方法同實施例2步驟一。取5ml M9發(fā)酵培養(yǎng)基，接種100 μ I能同時表達蘋果酸途徑前三步反應(yīng)的酶蛋白的 BL21 (DE3) /pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD 重組菌，37°C，200rpm,好氧培養(yǎng)(搖瓶培養(yǎng),透氣不密封)過夜。取2ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入到20ml M9發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，200rpm,微耗氧培養(yǎng)至OD6tltl=O. 6，加入IPTG至終濃度為0. 2mM，加入蘋果酸或其鈉鹽至終濃度為180mM。不控制pH，誘導(dǎo)24h后取發(fā)酵液進行產(chǎn)物檢測。微耗養(yǎng)培養(yǎng)方式同實施例2步驟中所述。對照菌株BL21(DE3)/pET-30a以相同方法進行發(fā)酵測試。實驗重復(fù)三次。二、目標(biāo)產(chǎn)物2，4-二羥基丁酸的檢測發(fā)酵液的取樣及氣質(zhì)聯(lián)用的前處理(三甲基硅烷化處理)，同實施例2中的二。以二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑，配制濃度為O. 5mM的2，4-二羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品。取20 μ 10. 5mM的2，4- 二羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，按同樣方法進行硅烷化處理。氣質(zhì)聯(lián)用條件HP-5柱子(柱長為30米)，分流比設(shè)為5:1 (全掃描模式)或15:1(選擇離子模式)，進樣量I μ 1，質(zhì)荷比范圍30-500。進樣口溫度設(shè)置為280°C。以氦氣為載體，流速設(shè)置為I. OmL/min。氣質(zhì)升溫程序設(shè)置為80°C保持I. 5mn ;以10°C /min的速率升溫至140°C，保持3min ;以30°C /min的速率升溫至280°C，保持12min。目標(biāo)產(chǎn)物分別用全掃描模式和選擇離子模式檢測。選擇離子設(shè)定為103. Om/z, 219. lm/z, 321. lm/z。選擇離子模式的檢測時間設(shè)定為11. 2(Tl2. 50min。全掃描的檢測時間設(shè)定為6 13. 50min。 經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用分析，并與2，4_ 二羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(圖8中A)作比較，結(jié)果表明，重組菌株BL21 (DE3)/PET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD的發(fā)酵濾液中含有與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間高度一致的、含有標(biāo)準(zhǔn)品特征離子譜的目標(biāo)峰(圖8中B)。且在全掃描模式下通過對目標(biāo)峰進行質(zhì)譜分析(圖8中C、D)，結(jié)果表明，目標(biāo)峰的質(zhì)譜裂解規(guī)律與標(biāo)準(zhǔn)品高度一致?？梢源_定，該目標(biāo)峰即為2，4- 二羥基丁酸。而對照菌株BL21 (DE3)/pET-30a的發(fā)酵濾液中則沒有該目標(biāo)峰。實施例4、以2，4- 二羥基丁酸鈉為底物的1，2，4- 丁三醇的生物合成及檢測一、通過生物發(fā)酵將2，4- 二羥基丁酸鈉轉(zhuǎn)化為1，2，4- 丁三醇M9發(fā)酵培養(yǎng)基除不加卡那霉素外，其他組成成份、終濃度及配制方法同實施例2
步驟一。取5ml M9發(fā)酵培養(yǎng)基，接種100 μ I能同時表達蘋果酸途徑后三步反應(yīng)的酶蛋白的BL21 (DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE重組菌，37°C，200rpm，好氧培養(yǎng)(搖瓶培養(yǎng)，透氣不密封)過夜。取2ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入到20mlM9發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，200rpm，微耗氧培養(yǎng)至OD6qq=O. 6，加入IPTG至終濃度為O. 2mM，加入2，4-二羥基丁酸鈉至終濃度為180mM。不控制PH，誘導(dǎo)24h后取發(fā)酵液進行產(chǎn)物檢測。微耗養(yǎng)培養(yǎng)方式同上。對照菌株BL21(DE3)/PACYC184以相同方法進行發(fā)酵測試。實驗重復(fù)三次。二、目標(biāo)產(chǎn)物1，2，4- 丁三醇的檢測取樣及氣質(zhì)聯(lián)用的前處理(三甲基硅烷化處理)，同實施例2中的步驟二。氣質(zhì)聯(lián)用條件HP-5柱子(柱長為30米)，不設(shè)分流比，進樣量2 μ 1，質(zhì)荷比范圍30-500。進樣口溫度設(shè)置為280°C。以氦氣為載體，流速設(shè)置為I. OmL/min。氣質(zhì)升溫程序設(shè)置為80°C保持I. 5min ;以3°C /min的速率升溫至140°C，保持Omin ;以50°C /min的速率升溫至280°C，保持lOmin。目標(biāo)產(chǎn)物用全掃描模式和選擇離子模式檢測。選擇離子的設(shè)定，同實施例2中的步驟二。經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用分析，并與1，2，4_ 丁三醇標(biāo)準(zhǔn)品(圖9中A)作比較，結(jié)果表明，重組菌株BL21 (DE3)/pACYC184/abfT-2/adhE的發(fā)酵濾液中含有與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間高度一致的、含有標(biāo)準(zhǔn)品特征離子譜的目標(biāo)峰(圖9中B)。且在全掃描模式下通過對目標(biāo)峰進行質(zhì)譜分析(圖9中C、D)，結(jié)果表明，目標(biāo)峰的質(zhì)譜裂解規(guī)律與標(biāo)準(zhǔn)品高度一致。可以確定，該目標(biāo)峰即為1，2，4-丁三醇。而對照菌株BL21(DE3)/pACYC184的發(fā)酵濾液中則沒有該目標(biāo)峰。另外，本發(fā)明的發(fā)明人對利用重組菌株BL21 (DE3)/pET-30a/mtkAB-2/sucD/4HbD /PACYC184/abfT-2/adhE通過生物發(fā)酵將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1，2，4- 丁三醇的產(chǎn)量進行了初步檢測，其產(chǎn)量達到y(tǒng)g/L發(fā)酵液的級別。
權(quán)利要求
1.一種制備1，2，4-丁三醇的方法，包括用重組生物細(xì)胞將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1，2，4- 丁三醇的步驟；所述重組生物細(xì)胞表達具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1，2，4- 丁三醇功能的酶系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述酶系統(tǒng)包括如下(al)_(a5) (al)具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A功能的酶I ; (a2)具有將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛功能的酶2 ； (a3)具有將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2，4- 二羥基丁酸功能的酶3 ； (a4)具有將所述2，4- 二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為2，4- 二羥基丁酰輔酶A功能的酶4 ； (a5)具有將所述2，4- 二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為1，2，4- 丁三醇功能的酶5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述酶I為琥珀酰輔酶A合成酶和蘋果酸硫激酶中的至少一種； 所述酶2為琥珀酸半醛脫氫酶； 所述酶3為4-羥基丁酸脫氫酶； 所述酶4為4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、肉桂酰輔酶A:苯乳酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶中的至少一種； 所述酶5為雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述酶I為琥珀酰輔酶A合成酶，所述琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基的氨基酸序列如序列表中序列I所示，所述琥珀酰輔酶A合成酶的α亞基的氨基酸序列如序列表中序列2所示； 所述酶2為琥珀酸半醛脫氫酶；所述琥珀酸半醛脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示； 所述酶3為4-羥基丁酸脫氫酶；所述4-羥基丁酸脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示； 所述酶4為4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶；所述4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示； 所述酶5為雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶；所述雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述重組生物細(xì)胞是將如下編碼基因?qū)肽康纳锛?xì)胞后得到的表達所述酶系統(tǒng)的重組生物細(xì)胞 如序列表中序列7所示的所述琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基的編碼基因，如序列表中序列8所示的所述琥珀酰輔酶A合成酶的α亞基的編碼基因； 如序列表中序列9所示的所述琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因； 如序列表中序列10所示的所述4-羥基丁酸脫氫酶的編碼基因； 如序列表中序列11所示的所述4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因； 如序列表中序列12所示的所述雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶的編碼基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述生物細(xì)胞為微生物細(xì)胞、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞；
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述生物細(xì)胞為大腸桿菌。
8.如下DNA片段中的至少一種(bl)核苷酸序列為序列表中序列7所示的DNA片段； (b2)核苷酸序列為序列表中序列8所示的DNA片段； (b3)核苷酸序列為序列表中序列9所示的DNA片段； (b4)核苷酸序列為序列表中序列10所示的DNA片段； (b5)核苷酸序列為序列表中序列11所示的DNA片段； (b6)核苷酸序列為序列表中序列12所示的DNA片段。
9.重組質(zhì)粒A和/或重組質(zhì)粒B，其特征在于所述重組質(zhì)粒A為攜帶并表達權(quán)利要求 8中(bl) - (b4)所述DNA片段的重組表達載體；所述重組質(zhì)粒B為攜帶并表達權(quán)利要求8中(b5)和(b6)所述DNA片段的重組表達載體。
10.重組大腸桿菌I或/和重組大腸桿菌2或/和重組大腸桿菌3，其特征在于所述重組大腸桿菌I為攜帶權(quán)利要求9中所述重組質(zhì)粒A和所述重組質(zhì)粒B，并表達權(quán)利要求8中(bl)- (b6)所述DNA片段的大腸桿菌；所述重組大腸桿菌2為攜帶權(quán)利要求9中所述重組質(zhì)粒A，并表達權(quán)利要求8中(bl) - (b4)所述DNA片段的大腸桿菌；所述重組大腸桿菌3為攜帶權(quán)利要求9中所述重組質(zhì)粒B，并表達權(quán)利要求8中(b5)和(b6)所述DNA片段的大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種1,2,4-丁三醇的生物合成方法。該方法包括用重組生物細(xì)胞將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇的步驟；所述重組生物細(xì)胞表達具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇功能的酶系統(tǒng)。所述酶系統(tǒng)包括如下(a1)具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A功能的酶；(a2)具有將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛功能的酶；(a3)具有將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2,4-二羥基丁酸功能的酶；(a4)具有將所述2,4-二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為2,4-二羥基丁酰輔酶A功能的酶；(a5)具有將所述2,4-二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇功能的酶。本發(fā)明對建立擁有自主產(chǎn)權(quán)的、原料價格低廉的、合成途徑全新的、轉(zhuǎn)化效率較高的1,2,4-丁三醇的生物合成方法具有重要意義。
文檔編號C12N15/54GK102965401SQ20121045797
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者蔡真, 李興華, 張延平, 李寅 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所