專利名稱：一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒，具體地，涉及一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法。
背景技術(shù)：
VEGFA 的全稱為 vascular endothelial growth factor A,其中文名為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A。血管生成刺激因素包括有一類稱為“血管生成因子(antigenic growthfactors) ”的細(xì)胞因子，起著刺激新血管形成的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些血管生成刺激因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子(TOGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子(TGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A(VEGFA)等，其中在腫瘤血管生成中起關(guān)鍵作用的是VEGFA?！?br> VEGFA蛋白由腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及纖維母細(xì)胞等分泌，廣泛分布于人體許多組織，如腺體、肺、肝、腎、心肌等，但表達(dá)水平極低，其作用僅維持正常血管密度和基本滲透功能，維持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞之后，其表達(dá)水平一般會(huì)大大上升。有研究表明，VEGFA與腫瘤侵染性相關(guān)，與腫瘤易感性亦相關(guān)。VEGFA的主要功能包括(I)選擇性增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)血管形成。(2 )升高血管尤其是微小血管的滲透性，使血漿大分子外滲沉積在血管外基質(zhì)中，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供營(yíng)養(yǎng)。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和模式生物基因組計(jì)劃的進(jìn)行，人們對(duì)于占人類基因組95%以上的非編碼序列的研究日益加強(qiáng)，研究發(fā)現(xiàn)它們中很多是具有生物學(xué)功能和意義的片段，在這些研究之中，對(duì)于大小約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA的microRNA的研究則是最為熱點(diǎn)之一。在近幾年中的腫瘤的研究中，有關(guān)于microRNA對(duì)于腫瘤的功能與調(diào)控的研究一直是腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，同時(shí)也取得了很大的突破與進(jìn)展。目前研究表明，microRNA主要是通過結(jié)合到靶標(biāo)基因的3 ' UTR區(qū)域，進(jìn)而抑制靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，因此基因的3' UTR的抑制程度能夠指示該基因受到miCToRNA抑制的水平。然而，現(xiàn)階段對(duì)于血管生成與microRNA的相關(guān)研究報(bào)道并不多見,而對(duì)于VEGFA蛋白與microRNA的研究就更為少見了，同時(shí)目前也沒有一種簡(jiǎn)便，快捷的方法來篩選能夠抑制多藥耐藥蛋白的microRNAο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，利用含有血管內(nèi)皮成長(zhǎng)因子A (VEGFA)基因3' UTR序列和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，進(jìn)行血管生成相關(guān)的microRNA的篩選。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，所述的方法包含
步驟I，進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的培養(yǎng)和鋪板。優(yōu)選人結(jié)腸癌細(xì)胞HCTl 16細(xì)胞培養(yǎng)于含有胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基(37°C 5% CO2、飽和濕度)中，并使之維持單層貼壁生長(zhǎng)。然后在空板中接種指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，直到細(xì)胞到80%匯片。步驟2，配置microRNA/DNA/脂質(zhì)體的混合物，對(duì)步驟I所述的細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。具體過程如下稀釋質(zhì)粒DNA及microRNA至RPMI 1640-SF培養(yǎng)液中，另外稀釋脂質(zhì)體至同樣的RPMI 1640-SF培養(yǎng)液中，分別室溫放置5 min。然后將所有上述稀釋液混合，在室溫放置20 min，使microRNA/DNA與脂質(zhì)體結(jié)合。鋪板細(xì)胞用RPMI 1640-SF培養(yǎng)液洗一次，在每個(gè)孔中加入microRNA/DNA/脂質(zhì)體混合物。在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3_5 h，吸去microRNA/DNA/脂質(zhì)體/RPMI 1640-SF培養(yǎng)液混合物，每孔加入3ml新鮮培養(yǎng)液，在37°C5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48 ho步驟3，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。該步驟三包含將步驟二所得的共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用一種含有VEGFA基因3' UTR與報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，以及一種海腎熒光素酶載體PRL-SV40分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染；然后將得到的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)后，進(jìn)行收集；將所收集的細(xì)胞進(jìn)行裂解，即取出培養(yǎng)基，用PBS洗一次，在每孔中加入裂解液，室溫?fù)u動(dòng)15 min;取15-20 μ I·細(xì)胞裂解液于離心管中，加入工作液，然后用發(fā)光儀進(jìn)行測(cè)讀。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，所述的工作液通過Kenreal試劑盒配置；所述的工作液包含用于測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性的工作液I和用于測(cè)定海腎熒光素酶活性的工作液2。該工作液I為A液(2 ml)+B液(40μ I) + C液(10 μ I)混合均勻而得。該工作液2為D液(2 ml) +E液(10 μ I)混合均勻而得。進(jìn)行測(cè)讀時(shí)，加入工作液1，設(shè)定延遲2 sec，發(fā)光儀測(cè)讀10 sec ;加入工作液2，則設(shè)定延遲2 sec,發(fā)光儀測(cè)讀10 sec。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，步驟3所述的報(bào)告基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶基因。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，步驟3所述的含有VEGFA基因3 ^ UTR與報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其制備方法包含步驟3. 1，對(duì)載體質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增和抽提；步驟3. 2，對(duì)VEGFA基因的3' UTR序列進(jìn)行克隆、酶切及純化；步驟3. 3，進(jìn)行所述的VEGFA基因的3' UTR序列與所述的載體質(zhì)粒的連接；步驟3. 4，篩選重組子。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，所述的步驟3. I包含用所述的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增；然后采用堿裂解法抽提制備所述的載體質(zhì)粒，電泳檢測(cè)所述載體質(zhì)粒的純度和含量；再用NcoI和HindIII對(duì)所述載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切，試劑盒凝膠回收大片段的酶切產(chǎn)物。堿裂解法是提取質(zhì)粒的最常用也最有效的方法，是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的。其原理是高PH使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性，同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)。再將pH值調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA較小，很容易復(fù)性成雙鏈。而染色體DNA較大，不會(huì)復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì)，從而可以通過離心除去。具體方法為依次加入下面三種溶液，然后進(jìn)行離心:溶液 I :葡萄糖 50 mmol/T,,EDTA 100 mmol/L,Tris-Cl 25 mmol/L,溶菌酶5mg/ml，調(diào)整 pH 為 8· O ;溶液 2 Na0H 0. 2 mol/L, SDS 1% ;溶液 3 :5 mol/L KAc 60 ml，冰乙酸11.5 ml，重蒸水28.5 ml。其中溶液I作用主要是懸浮菌體，溶液2作用是裂解菌體，釋放胞內(nèi)物質(zhì)，溶液3是沉淀染色體DNA。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，所述的步驟3. 2包含步驟3. 2. 1，根據(jù)人的VEGFA基因的3' UTR區(qū)序列設(shè)計(jì)兩端引物引物I為上游Y端引物，其中包含19個(gè)VEGFA基因的Y UTR互補(bǔ)堿基，一個(gè)HindIII識(shí)別位點(diǎn)，3個(gè)保護(hù)堿基；引物2為下游3'端引物，其中包含19個(gè)VEGFA基因3' UTR互補(bǔ)堿基，一個(gè)NcoI識(shí)別位點(diǎn)，4個(gè)保護(hù)堿基；步驟3. 2. 2，以基因組DNA為模板，利用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增；步驟3. 2. 3，反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ I反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；步驟3. 2. 4，取反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，用凝膠回收試劑盒回收；步驟3. 2. 5，將回收的PCR產(chǎn)物用NcoI和HindIII雙酶切，再次回收以備連接使用。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，所述的引物 I 為5’ - CCCAAGCTTCTCACCAGGAAAGACTGAT-3’，其中 AAGCTT 為 HindIII 識(shí)別位點(diǎn)。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，所述 的引物 2 為5’ - CATGCCATGGAACTCAAGTCCACAGCAGT -3’，其中 CCATGG 為 NcoI 識(shí)別位點(diǎn)。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，所述的PCR反應(yīng)，采用ExTaq DNA聚合酶，反應(yīng)條件為在95°C變性3min，再在95°C循環(huán)30s，然后在55°C退火45s，再在72°C延伸lmin，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后在72°C最終延伸8min。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，所述的步驟3. 3的連接是所述的步驟三的連接采用DNA連接試劑盒，進(jìn)行連接反應(yīng)，16°C過夜。上述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，所述的步驟3. 4包含取連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)；從培養(yǎng)平板上隨機(jī)挑取菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后用堿裂解法提取質(zhì)粒備用；最后經(jīng)過酶切、PCR、測(cè)序鑒定。本發(fā)明提供的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明提供的方法具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等有點(diǎn)。(2)本發(fā)明提供的方法同時(shí)具有靶向性的特點(diǎn)，能夠用來特異性檢測(cè)microRNA抑制基因3' UTR的活性。(3)本發(fā)明提供的方法還能夠克服轉(zhuǎn)染效率對(duì)結(jié)果的影響。


圖I為本發(fā)明的VEGFA基因3丨UTR序列克隆產(chǎn)物的電泳示意圖。圖2為本發(fā)明中的含有VEGFA基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒NcoI和Hindi 11雙酶切檢測(cè)的電泳示意圖。圖3為本發(fā)明中的含有VEGFA基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒在細(xì)胞中檢測(cè)microRNA對(duì)于VEGFA基因3' UTR活性的影響示意圖。圖4為本發(fā)明中的含有VEGFA基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒篩選出的對(duì)于VEGFA基因有抑制作用的microRNA的示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合 附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步地說明。實(shí)施例一
一.菌株、質(zhì)粒以及試劑的準(zhǔn)備。菌株大腸桿菌(E. coli)感受態(tài)細(xì)胞DH5a、大腸癌細(xì)胞株HCT116由實(shí)驗(yàn)室凍存。質(zhì)粒pGL3_promoter和 pRL_SV40 為實(shí)驗(yàn)室保存。試劑來源
ExTaq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶Hindlll、NcoI和DNA連接試劑盒(DNA LigationKit)購(gòu)自TaKaRa公司。DL2000 分子標(biāo)記(DL2000 marker )和 λ DNA/Hind III 分子標(biāo)記(λ DNA/Hind IIImarker)購(gòu)自上海MajorBio公司。RPMI 1640-SF 培養(yǎng)液購(gòu)自 Hyclone 公司。Lipofectamine 轉(zhuǎn)染試劑(Lipofect Transfection Reagent)購(gòu)自北京 TIANGEN公司。雙突光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KenReal公司。質(zhì)?；厥赵噭┖泻虳NA片段回收試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN公司。胎牛血清購(gòu)自gibco公司。BSA, NaCl, NaF, Tris, EDTA, Trytone，酵母提取物(Yeast Extract), PMSF, PAGE,SDS,吐溫20 (Tween-20), G250，硼酸，甘氨酸，亮肽，蛋白顯影液等試劑購(gòu)自上海MajorBio公司。VEGFA, β-actin 抗體購(gòu)買于 cell signal 公司。試劑配制
100mg/mL 牛血清白蛋白(BSA):稱取 BSA O. Ig 溶于 ImL O. 15 M NaCl, - 20° C 保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用O. 15M NaCl進(jìn)行100倍稀釋成lmg/mL，一 20° C保存。蛋白電泳緩沖液(5X):稱取Tris 15. lg，甘氨酸94g，SDS 5g溶于IL超純水，室
溫保存。蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液(5X ):稱取Tris 29g，甘氨酸14. 5g,SDS I. 85g溶于IL超純水，室溫保存。臨用前稀釋為IX，每升加入甲醇200 mL。I. 5 M Tris · HCl (pH 8.8):稱取 Tris 45. 43g 溶于 200mL，濃鹽酸調(diào) pH 至 8. 8，超純水定容至250 mL，4° C保存。O. 5 M Tris · HCl (pH 6. 8):稱取 Tris 15. 14g 溶于 200mL，濃鹽酸調(diào) pH 至 6. 8，超純水定容至250 mL，4° C保存。30%丙烯酰胺稱取丙烯酰胺29g，甲叉雙丙烯酰胺Ig溶于100 mL，濾紙過濾于棕色瓶中4° C保存。TBS緩沖液(5X ):稱取Tris 24. 2g，NaCl 80g溶于IL超純水，室溫保存。TBST 緩沖液(含 O. 1% Tween-20 的 TBS 緩沖液):量取 Tween-20 ImL 溶于 IL TBS,即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)稱取脫脂奶粉5g溶于IOOmL TBST，溶
解后4° C保存。
G250考馬斯亮藍(lán)溶液(測(cè)蛋白含量專用)稱取G250 lOOmg，溶于50mL 95%乙醇，量取IOOmL磷酸，超純水定容至1L，濾紙過濾，4° C保存。I M Tris · HCl (pH 7. 5):稱取 Tris 30. 29g 溶于 200mL 超純水，濃鹽酸調(diào) pH 至
8.8，超純水定容至250 mL，4° C保存。I M DTT :稱取 DTT 3. 085g 溶于 20mL O. OlM 乙酸鈉溶液，-20° C 保存。20mg/mL PMSF :稱取 PMSF O. 2g 溶于 IOmL 異丙醇，-20° C 保存。細(xì)胞總蛋白提取液稱取NaCl O. 73g，NaF O. 524g，EDTA O. 931g，SDS O. 25g，去氧膽酸鈉 2. 5g，量取 Triton-100 2. 5mL, I M Tris · HCl (pH 7.5) 2. 5mL，超純水定容至250mL，4。C 保存。用時(shí)每毫升提取液中加 I μ L DTT (IM)、5 μ L PMSF(20mg/mL)、10 μ L 亮妝(2. 5mg/mL)即可。SDS-聚丙烯酰胺分離膠(5mL)
權(quán)利要求
1.一種利用雙突光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法,其特征在于,所述的方法包含 步驟I，進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的培養(yǎng)和鋪板； 步驟2，配置microRNA/DNA/脂質(zhì)體的混合物，對(duì)步驟I所述的細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染； 步驟3，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)；該步驟三包含 將步驟2所得的共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用一種含有VEGFA基因3，UTR與報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，以及一種海腎熒光素酶載體分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染；然后將得到的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)后，進(jìn)行收集；將所收集的細(xì)胞進(jìn)行裂解；取15-20 μ I細(xì)胞裂解液于離心管中，加入工作液，然后用發(fā)光儀進(jìn)行測(cè)讀。
2.如權(quán)利要求I所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其特征在于，所述的工作液通過Kenreal試劑盒配置； 所述的工作液包含用于測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性的工作液I和用于測(cè)定海腎熒光素酶活性的工作液2。
3.如權(quán)利要求I所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其特征在于，步驟3所述的報(bào)告基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶基因。
4.如權(quán)利要求I所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其特征在于，步驟3所述的含有VEGFA基因3 ^ UTR與報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其制備方法包含 步驟3. I，對(duì)載體質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增和抽提； 步驟3. 2，對(duì)VEGFA基因的3' UTR序列進(jìn)行克隆、酶切及純化； 步驟3. 3，進(jìn)行所述的VEGFA基因的3' UTR序列與所述的載體質(zhì)粒的連接； 步驟3. 4，篩選重組子。
5.如權(quán)利要求4所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其特征在于，所述的步驟3. I包含 用所述的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增；然后采用堿裂解法抽提制備所述的載體質(zhì)粒，電泳檢測(cè)所述載體質(zhì)粒的純度和含量；再用NcoI和HindIII對(duì)所述載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切，試劑盒凝膠回收大片段的酶切產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求4所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其特征在于，所述的步驟3. 2包含 步驟3. 2. 1，根據(jù)人的VEGFA基因的3' UTR區(qū)序列設(shè)計(jì)兩端引物 引物I為上游Y端引物，其中包含19個(gè)VEGFA基因的Y UTR互補(bǔ)堿基，一個(gè)HindIII識(shí)別位點(diǎn)，3個(gè)保護(hù)堿基； 引物2為下游3'端引物，其中包含19個(gè)VEGFA基因3' UTR互補(bǔ)堿基，一個(gè)NcoI識(shí)別位點(diǎn)，4個(gè)保護(hù)堿基； 步驟3. 2. 2，以基因組DNA為模板，利用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增； 步驟3. 2. 3，反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ I反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)； 步驟3. 2. 4，取反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，用凝膠回收試劑盒回收； 步驟3. 2. 5，將回收的PCR產(chǎn)物用NcoI和HindIII雙酶切，再次回收以備連接使用。
7.如權(quán)利要求6所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為在95°C變性3min，再在95°C循環(huán)30s，然后在55°C退火45s，再在72°C延伸lmin，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后在72°C最終延伸8min。
8.如權(quán)利要求4所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其特征在于，所述的步驟3. 3的連接采用DNA連接試劑盒，進(jìn)行連接反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求4所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其特征在于，所述的步驟3. 4包含 取連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)；從培養(yǎng)平板上隨機(jī)挑取菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后用堿裂解法提取質(zhì)粒備用；最后經(jīng)過酶切、PCR、測(cè)序鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選血管生成相關(guān)microRNA的方法，其中，該方法包含步驟1，進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的培養(yǎng)和鋪板；步驟2，配置microRNA/DNA/脂質(zhì)體的混合物，對(duì)步驟1所述的細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染；步驟3，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)；該步驟3包含將步驟2所得的共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用一種含有VEGFA基因3′UTR與報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，以及一種海腎熒光素酶載體分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染；然后將得到的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)后，進(jìn)行收集；將所收集的細(xì)胞進(jìn)行裂解；取15-20μl細(xì)胞裂解液于離心管中，加入工作液，然后用發(fā)光儀進(jìn)行測(cè)讀。該報(bào)告基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶基因。本發(fā)明提供的方法，可用來篩選血管生成相關(guān)的microRNA、研究血管生成與microRNA之間的作用機(jī)理以及研究腫瘤細(xì)胞血管生成的機(jī)制等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102899421SQ20121046111
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者殷佩浩, 李琦, 邱艷艷, 周利紅, 劉宣, 王炎, 秦建民, 侯黎莉, 梁波, 胡送嬌, 包益潔, 陳星竹, 靳寶輝, 宋大遷, 葉乃菁, 王一斐 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院