專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備高活性低毒副作用肝素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備高活性低毒副作用肝素的方法。屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝素是有己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以I — 4糖苷鍵交替形成的粘多糖，其分子量在3000-40000Da之間，平 均分子量為15000Da ；肝素作為抗凝試劑和抗栓試劑已有60多年的歷史。肝素的抗凝血活性主要通過(guò)含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心結(jié)合抗凝血酶(AT-III)，誘導(dǎo)其發(fā)生構(gòu)象改變，從而顯示抗凝血活性。肝素的抗凝血活性包括抗栓活性(anti-factor Xa)和抗凝活性(anti-factor IIa)。但是由于肝素具有抗凝血活性，所以大量的使用會(huì)引起出血和誘導(dǎo)性血小板減少、骨質(zhì)疏松等副作用，從而大大的限制了肝素在臨床上的應(yīng)用。此外，肝素還具有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗癌、調(diào)血脂等方面的生活功能?，F(xiàn)有研究表明，肝素的抗凝血活性取決于其戊糖活性中心的數(shù)量。戊糖結(jié)構(gòu)中N-, 6-0-及3-0-位硫酸基參與結(jié)合AT-III，與抗凝血活性有關(guān)，而艾杜糖醛酸的作用尚不清楚。其中3-0-位硫酸基尤為重要如果缺少3-0-位硫酸基，肝素的抗凝血活性則會(huì)降低1000倍以上；相反，增加一個(gè)3-0-位硫酸基，則可以將肝素的抗凝血活性提高數(shù)倍。肝素由多4種生物合成酶在線(xiàn)粒體內(nèi)合成。合成過(guò)程中會(huì)涉及多種合成酶，如2-0-，6-0_，3-0-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(2-0ST，6-0ST, 3-0ST)分別對(duì)主鏈不同位置上的羥基進(jìn)行部分硫酸化，其中3-0-位硫酸化由3-0ST完成。這些硫酸基轉(zhuǎn)移酶大多具有多種異構(gòu)型式，如3-0ST就具有六種異構(gòu)體。其中，3-0ST-1和3-0ST-5能合成肝素戊糖活性中?，F(xiàn)有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-0ST-1和3-0ST-5很好的底物。因此，用3-0ST-1和3-0ST-5對(duì)低分子量肝素選擇性修飾，使80%不具有戊糖活性中心的低分子量肝素經(jīng)過(guò)反映后擁有戊糖活性中心，就可以大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的數(shù)量，從而提高其抗凝血活性(理論上可以同時(shí)提高抗栓和抗凝活性3-5倍)。此外研究還表明，2-0硫酸基對(duì)肝素發(fā)揮抗凝活性是非必須的。與普通肝素相比，2-0-位硫酸基的缺失降低電荷密度降低減少非特異性蛋白吸附，可一定程度降低出血風(fēng)險(xiǎn)、減少血小板聚集等。2-0-位脫硫酸化可以由2-0-sulfatase完成,2-0_sulfatase對(duì)肝素及低分子量肝素又很好的底物特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備高抗凝血活性低毒副作用肝素的方法本發(fā)明所提供的制備高抗凝血活性低分子量肝素的方法，是以肝素為底物，采用PAPS (3’ -磷酸腺苷-5’ -磷酸硫酸)再生系統(tǒng)，以肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉(zhuǎn)移酶、2-0-sulfatase對(duì)其進(jìn)行選擇性修飾，增加抗凝活性中心的數(shù)量、降低電荷密度，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。本發(fā)明方法所采用的3-0-硫酸基轉(zhuǎn)移酶、2-0-sulfatase均可通過(guò)發(fā)酵制備；所述PAPS再生系統(tǒng)，以PNPS (對(duì)硝基苯酚磺酸鉀鹽)作為酶修飾反應(yīng)的硫酸基供體，極大地降低了生產(chǎn)成本，使工業(yè)化成為可能。本發(fā)明為高活性低毒副作用肝素的酶法工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的途徑。所述肝素是市售的未分級(jí)肝素。所述PAPS 再生系統(tǒng)中，反應(yīng)液為含 I % Triton X-100,1% BSA7ImM MgCI2, ImMMnCI2, pH 為 5. 0-8. O 的 50mM Tris-HCI 緩沖液。所述PAPS再生系統(tǒng)中，PNPS的濃度為O. I-IOmM, PAP的濃度為O. l_50uM。所述方法中，AST-IV的用量為 O. l-50mg/ml ;優(yōu)選 5-lOmg/ml。所述方法中，肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉(zhuǎn)移酶的用量為O. l-50mg/mg底物；優(yōu)選 l_20mg/ml 底物。所述方法中，按照以下方法純化低分子量肝素終止反應(yīng)后，離心分離得到上清 液，將此上清液與兩倍提及的緩沖液A混合，對(duì)DEAE柱上樣；一詞以緩沖液A和緩沖液B進(jìn)行梯度洗脫，收集第二次洗脫所得洗脫液，得到高活性低分子量肝素；所述DEAE分離所用的緩沖液A為喊質(zhì)量百分含量為O. 5-2. 5%的NaCI水溶液，緩沖液B為含質(zhì)量百分含量為2. 5-5. 0%的 NaCI 水溶液。本發(fā)明的方法采用具有高效酶活性的肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉(zhuǎn)移酶、2-0-sulfatase制備高抗凝血活性低毒副作用肝素。重組的AST_IV、3-0ST_1及2-0-sulfatase均可通過(guò)發(fā)酵獲得，且均攜帶6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，一步純化就可得到90%以上的蛋白酶。利用AST-IV對(duì)PNPS以及PAP的雙底物進(jìn)行硫酸基酶促反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了 PNPS的再生系統(tǒng)，從而可以使用極為廉價(jià)的PNPS作為硫酸基供體，降低了高抗凝血活性低分子量肝素的成本。本發(fā)明通過(guò)用高活性3-0ST-l、2-0-sulfatase對(duì)肝素進(jìn)行選擇性修飾，得到了高抗凝血活性低毒副作用的肝素(抗凝血活性比現(xiàn)有低分子量肝素提高3-5倍)，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例將具體說(shuō)明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例I、肝素的3-0-位的硫酸化修飾PAPS再生系統(tǒng)組分濃度為PNPS的濃度為5mM，PAP的濃度為20uM ；PAPS再生系統(tǒng)中AST-IV的用量為10mg/mM PAPS。按以上組成所制備的溶液加入制備高活性低分子量肝素的溶液，作為肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉(zhuǎn)移酶修飾反應(yīng)的硫酸基供體。以肝素為原料，反映條件為Img肝素溶解在20ml反應(yīng)液中于室溫震蕩(300)反應(yīng) 6h。反應(yīng)液包含 50mM 的 Tris-HCI (pH 7. 2), 1% Triton X-100,1 % BSA, ImM MgCI2, ImMMnCI2, ImM PNPS,40uM PAP，8mg3-0ST_l 及 4mgAST_IV。100°C下加熱反應(yīng) 15 分鐘終止反應(yīng)，分離得到上清液，100°C下加熱反應(yīng)液15分鐘終止反應(yīng)，12000rpm高速離心，真空冷凍干燥得凍干粉。實(shí)施例2、肝素的2-0-位的脫硫酸化修飾以3-0-位硫酸化修飾的肝素為原料，反映條件為IOmg未分級(jí)肝素溶解在Iml的反應(yīng)液中，30°C震蕩(300)反應(yīng)。反應(yīng)液包含2-0-脫硫酸基酶3IU/g肝素，10mg/ml的肝素，50mM NaCl, 50mM咪唑pH6. 5。將上清液雨量被提及的2. 0%的NaCI水溶液混合，對(duì)DEAE柱上樣；一次以2. 0%的NaCI水溶液和3. 0%的NaCI水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集第二次洗脫所得洗脫液，得到高活性低分子量肝素。所得溶液用去離子水透析24小時(shí)，凍干得高活性肝素凍干粉。實(shí)施例3、高活性低毒副作用肝素的抗凝血活性研究用lmg/mL BSA的磷酸緩沖液(PBS)，將凝血因子X(jué)a稀釋至lU/mL，用lmg/mL BSA的PBS溶解抗凝血酶AT得到濃度為27mM的儲(chǔ)液，以PBS稀釋溶解凝血酶發(fā)色底物S-2765，終濃度為 1禮。用 50rnMTris’ HCl (pH 8. 4)，7. 5mM 的 Na2EDTA 和 175mM NaCl 的 緩沖液溶解樣品及對(duì)照的低分子量肝素。反應(yīng)液包含25mL抗凝血酶儲(chǔ)液和25mL的肝素溶液，反應(yīng)過(guò)程，加入檸檬酸終止反應(yīng)后，在405nm的波長(zhǎng)下面測(cè)定反應(yīng)液的紫外吸光度，抗FXa活性測(cè)定過(guò)程是在不同肝素濃度的條件下。
權(quán)利要求
1.一種制備高抗凝活性低毒副作用肝素的方法，是以肝素為底物，采用3’ -磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸(PAPS)再生系統(tǒng)，以肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉(zhuǎn)移酶對(duì)其進(jìn)行選擇性修飾，再以2-0-脫硫酸基酶對(duì)2-0-位硫酸基脫硫酸化，增加抗凝活性中心的數(shù)量并降低其電荷密度，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特點(diǎn)在于所述PAPS再生系統(tǒng)中，反應(yīng)液為含1%Triton X-100，I % BSA, ImM MgCI2, ImM MnCI2, pH 為 5. 0-8. O 的 50mM Tris-HCI 緩沖液，PNPS 的濃度為 O. I-IOmM, PAP 的濃度為 O. l_50Um，AST-IV 的用量為 O. l_50mg/ml ;優(yōu)選5-10mg/ml ;所述方法中，肝素生物合成酶3_0_硫酸基轉(zhuǎn)移酶的用量為O. l-50mg/mg底物，優(yōu)選l_20mg/ml底物，反應(yīng)溫度為10_40°C，優(yōu)選30_40°C，酶促反應(yīng)的時(shí)間為1_20小時(shí)，優(yōu)選5-10小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特點(diǎn)在于2-0_脫硫酸基酶的用量O.l-10IU/g肝素，優(yōu)選3IU/g肝素；所述用于反應(yīng)液為50mM NaCl, 50mM咪唑pH6. 5緩沖液，反應(yīng)溫度為10-40°C，優(yōu)選30-40°C，酶促反應(yīng)的時(shí)間為1-20小時(shí)，優(yōu)選5_10小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備高活性低毒副作用肝素的方法。本發(fā)明制備高活性低毒副作用肝素的方法，是以肝素為底物，采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)再生系統(tǒng)，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶、2-O-脫硫酸基酶對(duì)其進(jìn)行選擇性修飾，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。本發(fā)明方法所采用的3-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶、2-O-脫硫酸基酶可通過(guò)發(fā)酵制備；所述PAPS再生系統(tǒng)，以PNPS(對(duì)硝基苯酚磺酸鉀鹽)作為酶修飾反應(yīng)的硫酸基供體，極大地降低了生產(chǎn)成本，使工業(yè)化成為可能。本發(fā)明為工業(yè)化制備高活性低毒副作用肝素提供了新的途徑。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102911981SQ20121046412
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者陳敬華, 劉衛(wèi)超, 周斌, 王敏, 程詠梅, 滕麗萍, 陳荊曉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)