專利名稱：一種凝結芽孢桿菌及其高密度發(fā)酵的工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術領域，涉及一種凝結芽孢桿菌及其反饋補料發(fā)酵實現高密度培養(yǎng)的生產工藝。
背景技術：
凝結芽孢桿菌在自然界分布廣泛，其芽孢對熱及其他致死因子有較強的抵抗能力，對抗菌素及其他化學藥品的抗性也高。正是由于這個特性再加上有益凝結芽孢桿菌具有分泌各種蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶(S0D)、抗菌素及多種氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質的能力，因此可以被廣泛應用于醫(yī)藥保健、農業(yè)和食品等各領域。凝結芽孢桿菌是芽孢桿菌中極具應用潛力的菌種之一，其抑菌效果顯著。該菌主
要特征與普通乳酸菌十分相似，口服后可在盲腸、結腸內定植，在大腸中進行發(fā)酵，且在發(fā)酵過程中，可產生短鏈脂肪酸，如乳酸和醋酸等；凝結芽孢桿菌是兼性厭氧菌，能適應低氧的腸道環(huán)境，進入腸道后會消耗游離氧并繁殖，有利于厭氧微生物乳酸菌和雙歧桿菌的生長；該菌對酸和膽汁有高耐性，能夠進行乳酸發(fā)酵，產生的L 乳酸能降低腸道pH值，抑制有害菌；由于能夠形成芽孢，所以較之不產乳酸的芽孢桿菌更益于恢復胃腸道微生態(tài)平衡。從而促進腸道微生態(tài)平衡，提高機體免疫和抗病能力，預防腸道疾病。凝結芽孢桿菌對多種植物病原菌有很強的抑制作用，也可作為農業(yè)增產物質使用。Bacillus coagulans CGMCCNo. 6681經田間抑菌及生防試驗還發(fā)現其對瓜、果、蔬菜等經濟作物的灰霉病、紋枯病、白粉病、黑斑病等多種作物病害都具有顯著的防治效果。在生物技術產業(yè)化平臺中，細胞大規(guī)模培養(yǎng)等中下游技術是我國最薄弱的技術環(huán)節(jié)，本發(fā)明針對凝結芽孢桿菌產業(yè)化過程中遇到的瓶頸問題進行深入研究，并對細胞大規(guī)模培養(yǎng)的工業(yè)化發(fā)酵工藝進行探索，以降低凝結芽孢桿菌的生產成本，為生物農藥的大規(guī)模生產、推廣提供可借鑒模板。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提高凝結芽孢桿菌發(fā)酵單位及生產產量，為益生菌的大規(guī)模生產、推廣而提供了一種凝結芽孢桿菌及其高密度發(fā)酵工藝；主要是通過反饋補料發(fā)酵方法來實現高密度發(fā)酵。本發(fā)明的技術方案為一種芽孢桿菌，其分類命名為凝結芽孢桿菌菌株，菌種的拉丁學名是Bacillus coagulans，參據的菌株為NJYHHWG 877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登記入冊編號是CGMCC No. 6681。本發(fā)明還提供了一種利用上述凝結芽孢桿菌進行高密度發(fā)酵的工藝，其具體步驟如下從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基挑取凝結芽孢桿菌菌體，接入種子液培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)得發(fā)酵種子液；取發(fā)酵培養(yǎng)基體積的4 20%的發(fā)酵種子液接入滅菌后裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)；通過反饋補料法控制營養(yǎng)物質的濃度進行高密度發(fā)酵，控制溫度、通氣量和轉速，發(fā)酵培養(yǎng)48 78h得發(fā)酵液。
上述的培養(yǎng)發(fā)酵種子液是從35 42°C培養(yǎng)50 72h后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑取菌體，接入裝有種子液培養(yǎng)基的無菌錐形瓶中，35 42°C條件下搖床培養(yǎng)，控制轉速140 200rpm，32 48h后得發(fā)酵種子液；其中錐形瓶中裝的種子液培養(yǎng)基量為錐形瓶體積的5 25%。優(yōu)選所述的種子液培養(yǎng)基組分為蛋白胨8 15g/L,酵母膏3 8g/L, NaC14 8g/L,葡萄糖35 70g/L，pH控制在6. 5 7. 8。優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基組分蛋白胨8 15g/L,酵母膏3 8g/L, NaCl 4 8g/L,葡萄糖 35 70g/L, CaCO3 10 15g/L, K2HPO4 O. 8 I. 5g/L, MgSO4 · 7H20 O. I O. 6g/L,ZnSO4 · 7H20 O. 005 O. 015g/L, MnCl2 · 4H20 0· 001 O. 005g/L, pH 保持在 6· 5 7· 8 ;發(fā)
酵罐裝液量為發(fā)酵罐體積的20 45%。
優(yōu)選所述的反饋補料為分階段進行補料流加，發(fā)酵進行16 26h開始流加底物A，并以發(fā)酵液中PH值來指導底物流加速度，使pH值保持在6. 5 7. 8 ;在發(fā)酵進行12 24h開始，流加底物B，并以葡萄糖的濃度來指導底物流加速度，使發(fā)酵罐內葡萄糖內濃度控制在 50 70g/L，發(fā)酵 32 44h ;其中底物 A成份為CaC0355 85g/L，(NH4) 2HP0450 80g/L ；底物 B 成份為葡萄糖 200 400g/L，酵母膏 50 80g/L，Κ2ΗΡ044· 5 8. 5g/L, MgSO4 ·7Η20O. 57 3. 5g/L。優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)過程中控制溫度在36 42°C;通入無菌空氣，保持通氣量在3 6L/(L · min)以控制溶氧在30 45% ;控制轉速在140 200rpm。CGMCC No. 6681菌株具有下述性質I、形態(tài)與培養(yǎng)特征該菌為革蘭氏染色陽性菌，菌體呈桿形，(O. 8 I) μ mX (3 4)μπι，單個或成短鏈。產生卵圓形芽孢，大多偏菌體一端菌，有的孢子囊膨脹，有運動性。對外界環(huán)境抵抗力很強，90°C處理lOmin，100°C處理5min不會失活，pH值為4. O 9. O時也能生長。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上邊緣不整齊，呈扁平圓形白色菌落，2 3mm大小。兼性厭氧菌，生長溫度為20 55°C，最適生長溫度為35 45°C。2、生理生化特性凝結芽孢桿菌CGMCC No. 6681菌株的主要生理生化特征見表I :表I菌株的生理生化特征
權利要求
1.一種芽孢桿菌，其分類命名為凝結芽孢桿菌菌株，菌種的拉丁學名是=BacillUScoagulans，參據的菌株為NJYHHWG 877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登記入冊編號是CGMCC No. 6681。
2.一種利用如權利要求I所述的凝結芽孢桿菌進行高密度發(fā)酵的工藝，其具體步驟如下從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基挑取凝結芽孢桿菌菌體，接入種子液培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)得發(fā)酵種子液；取發(fā)酵培養(yǎng)基體積的4 20%的發(fā)酵種子液接入滅菌后裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)；通過反饋補料法控制營養(yǎng)物質的濃度進行高密度發(fā)酵，控制溫度、通氣量和轉速，發(fā)酵培養(yǎng)48 78h得發(fā)酵液。
3.根據權利要求2所述的工藝，其特征在于培養(yǎng)發(fā)酵種子液是從35 42°C培養(yǎng)50 72h后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑取菌體，接入裝有種子液培養(yǎng)基的無菌錐形瓶中，35 42°C條件下搖床培養(yǎng)，控制轉速140 200rpm, 32 48h后得發(fā)酵種子液；其中錐形瓶中裝的種子液培養(yǎng)基量為錐形瓶體積的5 25%。
4.根據權利要求2所述的工藝，其特征在于所述的種子液培養(yǎng)基組分為蛋白胨8 15g/L,酵母膏3 8g/L, NaCl 4 8g/L,葡萄糖35 70g/L, pH控制在6. 5 7. 8。
5.根據權利要求2所述的工藝，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基組分蛋白胨8 15g/L，酵母膏 3 8g/L, NaCl 4 8g/L,葡萄糖 35 70g/L, CaCO3IO 15g/L, K2HPO4O. 8 I. 5g/L,MgSO4 · 7H20 O. I O. 6g/L, ZnSO4 · 7H20 O. 005 O. 015g/L, MnCl2 · 4H20 0· 001 O. 005g/L，pH保持在6. 5 7. 8 ;發(fā)酵罐裝液量為發(fā)酵罐體積的20 45%。
6.根據權利要求2所述的工藝，其特征在于所述的反饋補料為分階段進行補料流加，發(fā)酵進行16 26h開始流加底物A，并以發(fā)酵液中pH值來指導底物流加速度，使pH值保持在6. 5 7. 8 ;在發(fā)酵進行12 24h開始，流加底物B，并以葡萄糖的濃度來指導底物流加速度，使發(fā)酵罐內葡萄糖內濃度控制在50 70g/L，發(fā)酵32 44h ;其中底物A成份為CaC0355 85g/L，(NH4) 2HP0450 80g/L ;底物B成份為葡萄糖200 400g/L，酵母膏50 80g/L, Κ2ΗΡ044· 5 8. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 57 3. 5g/L。
7.根據權利要求2所述的工藝，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)過程中控制溫度在36 42°C;通入無菌空氣，保持通氣量在3 6L/(L · min)以控制溶氧在30 45% ;控制轉速在140 200rpmo
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凝結芽孢桿菌及其高密度發(fā)酵工藝。菌種的拉丁學名是Bacillus coagulans，參據的菌株為NJYHHWG 877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登記入冊編號是CGMCC No.6681；本發(fā)明所提供的工藝主要以pH值與葡萄糖濃度為指導，分階段調控不同底物的濃度以實現反饋補料培養(yǎng)，以大幅提高了發(fā)酵單位及生產產量，該發(fā)明操作方便簡潔，有利于工業(yè)化生產，為益生菌的大規(guī)模生產、推廣提供可借鑒模板。
文檔編號C12N1/20GK102943057SQ20121046440
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權日2012年11月16日
發(fā)明者胡永紅, 楊文革, 唐容容, 錢永根, 王濟奎 申請人:南京工業(yè)大學