專利名稱：一種深層液體發(fā)酵法制備富硒金耳粗多糖粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種深層液體發(fā)酵法制備富硒金耳粗多糖粉的方法。屬保健食品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金耳為擔子菌綱，銀耳目，銀耳科，銀耳屬的干燥子實體，主要分布于我國西藏云南等地，野生資源稀有，古籍文獻記載用于肺熱、痰多、咳嗽、氣喘等癥的治療。研究表明，金耳深層發(fā)酵獲得的菌絲體所含的主要營養(yǎng)成分以及氨基酸與子實體相似，為深層發(fā)酵生產(chǎn)金耳多糖提供了理論依據(jù)。硒是人體必需的微量元素之一，它的生物學作用主要有①硒是谷胱甘肽過氧化物酶必需的組成成分，對免疫系統(tǒng)的影響可能與谷胱甘肽過氧化物酶參與花生四烯酸的代 謝，進而影響到前列腺素和白三烯的合成有關(guān)。硒化合物又是自由基的捕獲劑，后者會導致生化紊亂從而引起癌變和衰老。②硒有調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)速度，強化某些酶系統(tǒng)的活性及調(diào)節(jié)維生素A、C、E、K在體內(nèi)的吸收和消耗的功能。③硒對汞、鎘有解毒作用。研究表明，茶樹菇菌絲體及發(fā)酵液中微量元素含量的多少易受培養(yǎng)基成分的影響，因此可以考慮在培養(yǎng)基中添加硒元素來培養(yǎng)金耳，從而得到富硒金耳粗多糖粉。目前，人們獲得真菌多糖的途徑主要是從真菌子實體提取而得，但隨著需求量的增大，野生資源有限，人工栽培周期長且容易污染雜菌，受病蟲害侵蝕，而菌絲體培養(yǎng)周期短，染菌少，故應(yīng)該探索在生物反應(yīng)器內(nèi)進行液體深層發(fā)酵以獲取多糖的途徑，為開辟工業(yè)化液體深層發(fā)酵生產(chǎn)真菌多糖提供可靠依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種深層液體發(fā)酵制備富硒金耳粗多糖粉的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為將金耳斜面保藏菌種活化，接種至至搖瓶種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌絲體分散后將培養(yǎng)好的種子液接入搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中加入一定濃度無機硒，使金耳菌絲體中積累高濃度的有機硒，同時發(fā)酵液有效成分中也有一定濃度的硒元素。發(fā)酵結(jié)束后，收集菌絲體，勻漿，熱水浸提，浸提液濃縮后醇析，冷凍干燥得到富硒金耳胞內(nèi)粗多糖粉；另外將發(fā)酵液濃縮，將濃縮液醇析后冷凍干燥得到富硒金耳胞外粗多糖粉；二者合并后得到富硒金耳粗多糖粉。本發(fā)明提出的深層液體發(fā)酵制備富硒金耳粗多糖粉的具體操作步驟如下(I)菌種培養(yǎng)出發(fā)菌種為本實驗室金耳斜面保藏菌種；①搖瓶種子培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基=PDAlL加磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂O. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，ρΗ6· O ；培養(yǎng)方法從斜面菌種中取3 4塊黃豆大小相同的菌塊，接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝培養(yǎng)基IOOmL于25°C，120r/min，振蕩培養(yǎng)7d ;搖瓶中預先裝有經(jīng)過消毒滅菌的玻璃珠，用于打散菌絲體。②搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖4g/100mL、酵母粉lg/100mL、磷酸二氫鉀O. 2g/100mL、硫酸鎂
O.05g/100mL、亞砸酸納 6 μ g/1OOmL培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的種子以15%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中25°C，120r/min，振蕩培養(yǎng)7d;(2)富硒粗多糖的提取離心分離收集發(fā)酵液和菌絲體；①胞內(nèi)粗多糖的提取將濕菌絲體勻漿，80°C -90°C熱水浸提，加水量為5倍體積濕菌絲體，總提取時間為12h，提取2次，合并提取液，濃縮后加入4倍體積95%乙醇在4°C 醇析12h，SOOOrpm離心得沉淀物，沉淀物用蒸餾水復溶后冷凍干燥，粉碎后得到富硒金耳胞內(nèi)粗多糖粉；②胞外粗多糖提取將發(fā)酵液濃縮后調(diào)PH值為5. 5，添加4倍體積發(fā)酵液的95%乙醇，4°C醇析17h，SOOOrpm離心得沉淀物，沉淀物用蒸餾水復溶后冷凍干燥，粉碎后得到富硒金耳胞外粗多糖粉；(3)產(chǎn)品的獲得將富硒金耳胞內(nèi)粗多糖粉與茶樹菇胞外粗多糖粉合并，得到富硒金耳粗多糖粉；(4)檢測結(jié)果樣品中總硒及游離硒的含量，兩者之差為樣品中有機硒含量，含量為10微克/克以上。
具體實施例方式下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。實例I :各種培養(yǎng)基的組成配方搖瓶種子培養(yǎng)基PDA1L加磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂O. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，ρΗ6· O0搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40g、酵母粉10g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂O. 5g、亞硒酸鈉40μ g-60y g，用水稀釋至 1L，PH6. O。實例2 :菌種培養(yǎng)出發(fā)菌種為實驗室保藏金耳斜面菌種,活化后從斜面母種中取3 4塊黃豆大小相同的菌塊，接種于實例I已滅菌的搖瓶種子培養(yǎng)基中，搖瓶中預先裝有經(jīng)過消毒滅菌的玻璃珠，裝液量100mL/250mL三角瓶，于25°C，120r/min,振蕩培養(yǎng)7d，三角瓶包八層紗布；將培養(yǎng)好的種子以15%的接種量接入實例I已滅菌的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中25°C，120r/min，振蕩培養(yǎng)7d。實例3 :富硒粗多糖的提取I、胞內(nèi)粗多糖的提取將上述發(fā)酵液4000rpm離心IOmin,收集菌絲體,將濕菌絲體勻漿，加入5倍體積濕菌絲體的水在80°C水浴鍋中浸提，，總提取時間為12h，提取2次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積1/5后加入4倍體積95 %乙醇，放入4°C冰箱醇沉12h，取出后SOOOrpm離心5min得沉淀物，沉淀物用蒸餾水復溶后冷凍干燥，粉碎后得到富硒金耳胞內(nèi)粗多糖粉85mg。
2、胞外粗多糖提取將上述發(fā)酵液4000rpm離心IOmin,收集上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積1/5后調(diào)PH值為5. 5，加入4倍體積95%乙醇，放入4°C冰箱醇沉17h，取出后SOOOrpm離心5min得沉淀物，沉淀物用蒸餾水復溶后冷凍干燥，粉碎后得到富硒茶樹菇胞外粗多糖粉376mg。3、產(chǎn)品的獲得將茶樹菇胞內(nèi)粗多糖粉與茶樹菇胞外粗多糖粉合并，得到富硒茶樹菇粗多糖粉461mg。實例4:檢測結(jié)果 測定了金耳富硒粗多糖中總硒及游離硒的含量，兩者之差為樣品中有機硒含量，含量為10微克/克以上。
權(quán)利要求
1.一種深層液體發(fā)酵法制備富硒金耳粗多糖粉的方法，其特征是將金耳固體斜面菌種活化后接入搖瓶種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分散菌絲體，將培養(yǎng)好的種子液接入搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中加入一定濃度無機硒，使金耳菌絲體中積累高濃度的有機硒，同時發(fā)酵液有效成分中也有一定濃度的硒元素。發(fā)酵結(jié)束后，收集菌絲體，勻漿，熱水浸提，浸提液濃縮后醇析，冷凍干燥得到富硒金耳胞內(nèi)粗多糖粉；另外將發(fā)酵液濃縮，將濃縮液醇析后冷凍干燥得到富硒金耳胞外粗多糖粉；二者合并后得到富硒金耳粗多糖粉； 具體步驟為 (1)菌種培養(yǎng) 出發(fā)菌種為本實驗室金耳斜面保藏菌種； ①搖瓶種子培養(yǎng) 搖瓶種子培養(yǎng)基=PDAlL加磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂O. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，pH6. O ； 培養(yǎng)方法從斜面菌種中取3 4塊黃豆大小相同的菌塊，接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝培養(yǎng)基IOOmL于25°C，120r/min，振蕩培養(yǎng)7d ； ②搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖4g/100mL、酵母粉lg/100mL、磷酸二氫鉀O. 2g/100mL、硫酸鎂O.05g/100mL、亞硒酸鈉若干； 培養(yǎng)方法將培養(yǎng)好的種子以15%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中25°C，120r/min，振蕩培養(yǎng)7d ； (2)富硒粗多糖的提取離心分離收集發(fā)酵液和菌絲體； ①胞內(nèi)粗多糖的提取將濕菌絲體勻漿，80°C熱水浸提，加水量為5倍體積濕菌絲體，總提取時間為12h，提取2次，合并提取液，濃縮后加入4倍體積95%乙醇在4°C醇析12h，SOOOrpm離心得沉淀物，沉淀物用蒸餾水復溶后冷凍干燥，粉碎后得到富硒金耳胞內(nèi)粗多糖粉； ②胞外粗多糖提取將發(fā)酵液濃縮后調(diào)PH值為5.5，添加4倍體積發(fā)酵液的95%乙醇，4°C醇析17h，SOOOrpm離心得沉淀物，沉淀物用蒸餾水復溶后冷凍干燥，粉碎后得到富硒金耳胞外粗多糖粉； (3)產(chǎn)品的獲得將富硒金耳胞內(nèi)粗多糖粉與茶樹菇胞外粗多糖粉合并，得到富硒金耳粗多糖粉。
2.如權(quán)利要求I所述的在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中加入一定濃度無機硒，其特征在于加入的為亞硒酸鈉，其含量為40 μ g-60y g.。
3.如權(quán)利要求I所述的分散菌絲體，其特征在于搖瓶種子培養(yǎng)基中預先裝有經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的玻璃珠。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種深層液體發(fā)酵法制備富硒金耳粗多糖粉的方法。主要包括菌種的組織分離，培養(yǎng)基的組成，發(fā)酵條件，硒元素的轉(zhuǎn)化，菌絲體的收集，粉碎，水浸提，醇提后冷凍干燥得到富硒金耳胞內(nèi)粗多糖粉；另外將發(fā)酵液濃縮，將濃縮液醇提后冷凍干燥得到富硒金耳胞外粗多糖粉；二者合并后得到富硒金耳粗多糖粉。每克粗多糖粉中有機硒含量達10微克/克以上。富硒金耳粗多糖粉有增強免疫力，抗疲勞，降血糖等保健生理活性?？蓱?yīng)用于制備具有相關(guān)功效的保健品。
文檔編號C12R1/645GK102899368SQ20121046446
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者鄧超, 陳敬華, 程詠梅, 陳荊曉, 滕麗萍, 徐曉宇, 付海田 申請人:江南大學