金銀花檢測(cè)用引物、檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)技術(shù)的中藥材金銀花真?zhèn)纹房焖贆z測(cè)技術(shù)。一種金銀花檢測(cè)用引物，能擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的特異堿基，所述目標(biāo)核酸序列為葉綠體序列trnL-trnF。所述引物與所述目標(biāo)核酸序列的582-661位核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。本發(fā)明通過提供一種對(duì)金銀花特定位點(diǎn)具有特異性的引物組，及其用含有上述引物組的試劑盒檢測(cè)樣本中是否存在金銀花特定位點(diǎn)，進(jìn)而確定樣本中是否存在正品金銀花。
【專利說明】金銀花檢測(cè)用引物、檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)金銀花的方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]經(jīng)過市場(chǎng)調(diào)研及有關(guān)專家確認(rèn)可作為中藥材金銀花的偽品有灰氈毛忍冬(Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.)、紅腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)、華南忍冬(LoniceraConfusa DC.)或黃褐毛忍冬(Lonicera fulvotomentosa HsuetS.C.Cheng)等(郝近大，實(shí)用中藥材經(jīng)驗(yàn)鑒別，人民衛(wèi)生出版社，2009)。在中華人民共和國藥典(2010版)中主要收錄的藥材鑒別方法有性狀鑒別、薄層鑒別等方法，然而金銀花和其偽品灰氈毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、黃褐毛忍冬等在外形特征上非常相似，因此采用性狀鑒別具有一定的主觀性，且要求鑒別者具有豐富的鑒別經(jīng)驗(yàn)；如果藥材外形不完整或者破碎后鑒別也十分困難。另一方面，由于偽品灰氈毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、黃褐毛忍冬等中均含有指標(biāo)性成分綠原酸，因此采用薄層鑒別也無法把金銀花及其偽品區(qū)分開來。
[0003]近年來發(fā)展的以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法如DNA條形碼、位點(diǎn)特異性PCR等盡管克服了傳統(tǒng)鑒別方法準(zhǔn)確度不高、主觀性大等缺點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下實(shí)現(xiàn)了金銀花藥材的準(zhǔn)確檢測(cè)，但是由于常規(guī)PCR需要昂貴的PCR儀或測(cè)序儀以及凝膠電泳以及成像系統(tǒng)等，大大限制了這些檢測(cè)方法的推廣應(yīng)用。因此，建立適用于中藥材的準(zhǔn)確、快速、低成本的檢測(cè)方法一直是中藥鑒定領(lǐng)域中亟待解決的問題。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 技術(shù)(LAMP)是Notami等人在2000年提出的一種等溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)。該技術(shù)針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)模板依賴的特異性引物并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在一定溫度下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。LAMP法通過4引物識(shí)別目的基因的6個(gè)區(qū)域，使用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件(60-701:)下進(jìn)行核酸的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，通過在擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)引發(fā)下一輪引物結(jié)合，LAMP能在60-90min內(nèi)把目的片段擴(kuò)增到IO9數(shù)量級(jí)。目前尚未見到利用LAMP技術(shù)檢測(cè)中藥材金銀花中忍冬的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種可供檢測(cè)金銀花藥材是否含有正品忍冬的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法及其試劑盒，以實(shí)現(xiàn)在藥市、藥房、產(chǎn)地等快速、特異、靈敏、簡便的檢測(cè)金銀花中是否含有忍冬。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是首先通過生物信息學(xué)分析忍冬及其偽品的序列差異，基因序列如忍冬trnL-trnF序列(GenBank登錄號(hào):HM228586.1)所示,通過專業(yè)軟件設(shè)計(jì)用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)忍冬的特異性寡核苷酸引物，以引物序列組擴(kuò)增待測(cè)樣品模板DNA,進(jìn)行目的片段的特異性擴(kuò)增，其檢測(cè)方法步驟包括:
[0007](I)基因組DNA提取步驟,從待檢樣品中提取I旲板DNA。
[0008](2)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增步驟，將上述模板DNA加入LAMP反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，其中所使用引物序列如下:
[0009]正向外引物L(fēng)J-F3: 5，-AGGGTTCAAGTCCCTCTA-3 ’
[0010]反向外引物L(fēng)J-B3:5’ -CGTATTATCTTAGATCACAAGACT-3’
[0011]正向內(nèi)引物L(fēng)J-FIP: 5，-GGAACCGCTAACAAAAAAAGGACCAAAAAACCCATATTGACTCC-3 ’
[0012]反向內(nèi)引物L(fēng)J-BIP:5’ -CTAATTCGTTATATTTCTCATCCACCTGAGAAAAACATTTCCGCTC-3’
[0013]反應(yīng)體系包括:2.5 μ LlOXThermoPol緩沖液，2個(gè)內(nèi)引物L(fēng)J-FIP和LJ-BIP的終濃度為I~2μΜ，兩個(gè)外引物L(fēng)J-F3和LJ-B3的終濃度為0.1~0.4 μ M，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1-2.5mM，甜菜堿0.5-3M，待檢樣品DNA l-100ng,Bst DNA聚合酶5-20U?；靹蚝笤诩s 63-68°C 內(nèi)保溫 50-90min，然后 80°C保溫 lOmin。
[0014](3) LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系內(nèi)加入10-10000倍稀釋的SYBR Green I染料，然后在紫外燈下檢測(cè)被檢樣品LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的顏色，如果顏色為綠色或黃綠色則表示檢測(cè)藥材中存在忍冬，如果是其他顏色則表示檢測(cè)藥材不存在忍冬。
[0015]本發(fā)明所提供的忍冬檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn):(I)檢測(cè)時(shí)間短，僅1-2小時(shí)內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，比現(xiàn)有的分子生物學(xué)檢測(cè)方法縮短2-3小時(shí)。(2)儀器要求寬松，不需要普通PCR所用的PCR儀、電泳槽及凝膠成像系統(tǒng)，只要一個(gè)水浴鍋即可完成檢測(cè)反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。(3)操作簡單，整個(gè)過程不涉及復(fù)雜的儀器設(shè)備，檢測(cè)結(jié)果清晰，只用肉眼觀察顏色即可判斷。
[0016]為了能更清晰地說明本發(fā)明的提取方法，下面結(jié)合具體實(shí)施案例，對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步闡述。`
[0017]為了建立忍冬的LAMP檢測(cè)方法，首先要選擇忍冬所特有的核苷酸序列，然后進(jìn)行LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成。研究表明忍冬trnL-TrnF序列(GenBank登錄號(hào):HM228586.1)可作為忍冬的特異性核苷酸序列，用于忍冬的鑒定和檢測(cè)。通過引物設(shè)計(jì)軟件primerexplorer4.0 (https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)設(shè)計(jì) LAMP 弓丨物。其中所設(shè)計(jì)引物序列如下:
[0018]正向外引物L(fēng)J-F3:5’ -AGGGTTCAAGTCCCTCTA-3’
[0019]反向外引物L(fēng)J-B3:5’ -CGTATTATCTTAGATCACAAGACT-3’
[0020]正向內(nèi)引物L(fēng)J-FIP: 5，-GGAACCGCTAACAAAAAAAGGACCAAAAAACCCATATTGACTCC-3 ’
[0021]反向內(nèi)引物L(fēng)J-BIP:5’ -CTAATTCGTTATATTTCTCATCCACCTGAGAAAAACATTTCCGCTC-3’
[0022]按照上述序列進(jìn)行引物L(fēng)AMP合成，即可進(jìn)行LAMP檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:忍冬及其偽品LAMP反應(yīng)紫外檢測(cè)結(jié)果
[0024]I:SYBR Green I (陰性對(duì)照)；2:紅腺忍冬(偽品)；3:華南忍冬(偽品)；4:忍冬；5:忍冬
[0025]具體實(shí)施例1檢測(cè)方法
[0026]1.材料和方法
[0027]1.1 材料[0028]所用材料如表1所示,包括:
[0029]表1金銀花相關(guān)樣品基本情況
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種金銀花檢測(cè)用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成: 正向外引物 LJ-F3:5’ -AGGGTTCAAGTCCCTCTA-3’ 反向外引物 U-B3:5’ -CGTATTATCTTAGATCACAAGACT-3’
正向內(nèi)引物 LJ-FIP:5’ -GGAACCGCTAACAAAAAAAGGACCAAAAAACCCATATTGACTCC-3’
反向內(nèi)引物 LJ-BIP:5’ -CTAATTCGTTATATTTCTCATCCACCTGAGAAAAACATTTCCGCTC-3’ 可以擴(kuò)增忍冬trnL-trnF基因GenBank登錄號(hào):HM228586.1，582-661位的特異性核酸序列。
2.一種金銀花藥材的檢測(cè)方法，該方法用于檢測(cè)藥材中是否存在忍冬，其特征在于以忍冬的trnL-trnF基因GenBank登錄號(hào):HM228586.1，582-661位的特異性核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈為靶，通過LAMP法用權(quán)利要求1所述引物組選擇性擴(kuò)增所述靶基因，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金銀花檢測(cè)方法，其特征在于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系包括:2.5 μ LlO X ThermoPol緩沖液，2個(gè)內(nèi)引物L(fēng)J-FIP和LJ-BIP的終濃度為I~2 μ Μ，兩個(gè)外引物 LJ-F3 和 LJ-B3 的終濃度為 0.1 ~0.4 μ M，dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 1-2.5mM，甜菜堿0.5-3M，待檢樣品DNAl-lOOng，Bst DNA聚合酶5-20U，反應(yīng)程序擴(kuò)增溫度63_68°C ;所述檢測(cè)方法具體為:1)樣品處理和模板 提取，樣品范圍適用于金銀花藥材及其原植物；2)金銀花的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，取擴(kuò)增反應(yīng)液，先加待測(cè)模版，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為25 μ L的反應(yīng)體系，混勻后在約63-68°C內(nèi)保溫50_90min，然后80°C保溫IOmin ；3)LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系內(nèi)加入10-10000倍稀釋的SYBR Green I染料，然后在紫外燈下檢測(cè)被檢樣品LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的顏色，如果顏色為綠色或黃綠色則表示檢測(cè)藥材中存在忍冬，如果是其他顏色則表示檢測(cè)藥材不存在忍冬。
4.一種金銀花檢測(cè)用試劑盒，其特征在于由提取試劑A組成為0.5M氫氧化鈉、I %PVP (聚吡咯烷酮)>1% Triton XlOO (曲通X100)，中和試劑B組成為0.1M Tris-HCl和擴(kuò)增試劑C三個(gè)組件組成，擴(kuò)增試劑C每管23 μ L含2.5 μ LlOXThermoPol緩沖液，2個(gè)內(nèi)引物 LJ-FIP 和 LJ-BIP 的 1.6 μ Μ，兩個(gè)外引物 LJ-F3 和 LJ-B3 0.2 μ M, dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1.25mM,甜菜堿1M，13.9 μ L雙蒸水；該試劑盒使用方法具體為:1)模板DNA制備:取0.5-3mg粉碎的樣品，加入20 μ L提取試劑Α，充分混勻2min ;加入80 μ L中和試劑B，離心3min ;取20 μ L上清;加入80 μ L中和試劑B，離心3min ;取I μ L用作模板；2) LAMP反應(yīng)及檢測(cè):取擴(kuò)增試劑Cl管，加入I μ L模板DNA及8U Bst DNA聚合酶，混勻后在約63_68°C內(nèi)保溫50-90min，然后80°C保溫IOmin ;據(jù)權(quán)利要求3所述的金銀花檢測(cè)方法觀察LAMP反應(yīng)產(chǎn)物顏色判別是否存在忍冬。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103820530SQ201210464648
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月19日
【發(fā)明者】黃璐琦, 袁媛, 蔣超 申請(qǐng)人:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所