3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種氨?；?tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列和SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本發(fā)明提供一種3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)，其包含：(i)3-甲硫酪氨酸；(ii)本發(fā)明的正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸優(yōu)先氨?；稣籺RNA；和(iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
【專利說明】3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供氨?；?tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本發(fā)明還涉及一種2-氨基-3-(4-羥基-3-(甲硫)苯基)丙酸(簡稱3-甲硫酪氨酸，簡寫為MtTyr)翻譯系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶的配對(duì)將3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)特異性插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)，和利用所述翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸的方法。本發(fā)明還涉及用這套翻譯系統(tǒng)和這種方法產(chǎn)生的含有3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)，例如，插入3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體，以及插入3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)是所有生命體及其生命活動(dòng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。在整個(gè)蛋白中，約有三分之一的蛋白都是一些含金屬的蛋白，稱為金屬蛋白(Metalloprotein)或金屬酶(Metalloenzyme)。金屬酶中普遍存在通過硫醚鍵結(jié)合的Tyr-Cys輔助因子,例如:半乳糖氧化酶(GO)，乙二醛氧化酶，半胱氨酸雙加氧酶(CDO)，亞硫酸鹽還原酶(NirA)以及Thioalkalivibrio nitratireducens細(xì)胞色素c亞硝酸鹽還原酶(TvNiR)。在上述的所有酶中，酪氨酸苯環(huán)上的C3原子與鄰近半胱氨酸的S原子均能自發(fā)地形成共價(jià)鍵，而不需要任何外源性蛋白質(zhì)催化。因此，這種Tyr-Cys輔助因子的基本功能目前已被多位合成化學(xué)家、物理化學(xué)家、酶學(xué)家和結(jié)構(gòu)生物學(xué)家深入研究，并且取得了巨大的突破。盡管如此，關(guān)于該輔助因子在酶催化過程中的確切作用至今仍無人知曉，而限制其研究的瓶頸問題是無法通過傳統(tǒng)的定點(diǎn)誘變方法來探測這種翻譯后修飾的結(jié)構(gòu)。為了克服這種限制，有人合成出模擬Tyr-Cys共價(jià)交聯(lián)的化`合物來進(jìn)行研究。結(jié)果表明，Tyr-Cys共價(jià)交聯(lián)基團(tuán)可以顯著降低苯環(huán)側(cè)鏈的PKa值和還原電位，因此促進(jìn)了酶作用底物和Tyr-Cys輔助因子之間的質(zhì)子耦合電子轉(zhuǎn)移，而這對(duì)優(yōu)化酶活性是至關(guān)重要的因素。
[0003]本發(fā)明擬通過在肌紅蛋白中定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸，使其模擬Thioalkalivibrio nitratireducens細(xì)胞色素c亞硝酸鹽還原酶(TvNiR)活性中心的Tyr-Cys輔助因子，該研究將為金屬酶中Tyr-Cys輔助因子的催化機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。本研究現(xiàn)已開發(fā)了在原核和真核生物中將各種非天然氨基酸體內(nèi)位點(diǎn)特異性地定點(diǎn)插入蛋白質(zhì)的通用方法。這些方法依賴于正交蛋白質(zhì)翻譯組分，所述組分識(shí)別合適的選擇密碼子(selector codon)從而能在體內(nèi)多肽翻譯期間將所需的非天然氨基酸插入限定位置。這些方法利用識(shí)別選擇密碼子的正交tRNA (Ο-tRNA)，而相應(yīng)的特異性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加載該Ο-tRNA。這些組分不與宿主生物體內(nèi)的任何內(nèi)源性tRNA、氨?；?tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密碼子交叉反應(yīng)(即，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS配對(duì)可能遺傳編碼大量結(jié)構(gòu)各異的非天然氨基酸。
[0004]本領(lǐng)域普遍知道利用適合于制備含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的正交翻譯系統(tǒng)，例如產(chǎn)生正交翻譯系統(tǒng)的通用方法。例如，參見國際公布號(hào)WO 2002/086075，其發(fā)明名稱為 “METHODS AND C0MP0SIT10NF0R THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNASYNTHETASE PAIRS” ；W0 2002/085923,其發(fā)明名稱為 “INVIV0INC0RP0RAT10N OF UNNATURAL AMINO ACIDS” ；W0 2004/094593,其發(fā)明名稱為“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定點(diǎn)特異性插入非天然氨基酸的正交翻譯系統(tǒng)及它們的產(chǎn)生和使用方法的其他討論還可參見Wang和Schultz, Chem.Commun.(Camb) I:
1-11(2002)；ffang 和 Schultz, Angewandte Chemie Int.Ed.44(I):34-66(2005) ；Xie 和Schultz, Methods 36(3):227-238(2005) ；Xie 和 Schultz, Curr.0pinion inChemicalBiology 9(6):548-554 (2005) ；ffang 等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35:225-249(2006)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]1、技術(shù)問題
[0006]本發(fā)明提供一種氨?；?tRNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ IDNO:4所示氨基酸和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。這種氨?；?tRNA合成酶突變體能夠用3-甲硫酪氨酸(簡寫為MtTyr)優(yōu)先氨?；c之配對(duì)的正交tRNA，從而在翻譯的氨基酸序列中插入MtTyr。這是本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的，相應(yīng)地，在本發(fā)明中將其命名為正交3-甲硫酪氨酸氨?；?tRNA合成酶(MtTyrRS)。
[0007]本發(fā)明還提供一種酪氨酸酹裂解酶(Tyrosine phenol lyase,簡寫為TPL)突變體，所述酪氨酸酚裂解酶突變體可以高效地催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸，其氨基酸序列為:
[0008](I)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或
[0009](2)將SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相同的催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0010]此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在本發(fā)明中，術(shù)語“能夠催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶突變體”不僅包括SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，還包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化
2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性，所述功能衍生物是指將SEQID N0:9所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相同的催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0011]這種能夠催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶突變體是本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的。
[0012]在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶的配對(duì)將3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)特異性插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)，和利用所述翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸的方法。本發(fā)明還涉及用這種翻譯系統(tǒng)和這種方法產(chǎn)生的含有3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)及其應(yīng)用。[0013]因此，本發(fā)明的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶的配對(duì)將3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)特異性插入蛋白質(zhì)的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)，并且提供利用該翻譯系統(tǒng)在目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸的方法。
[0014]本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生的含有至少一個(gè)3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明人利用這種方法將3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)特異性插入目的蛋白中，所述目的蛋白包括，但不限于，肌紅蛋白(Myoglobin)。通過本發(fā)明的方法得到的包含3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體蛋白具有亞硝酸鹽還原酶活性。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法也可以用于在肌紅蛋白之外的多種蛋白中定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸，并不局限于該蛋白。
[0015]2、技術(shù)方案
[0016]本發(fā)明人經(jīng)過篩選，獲得一種正交氨?；?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性，在本發(fā)明中將其命名為正交3-甲硫酪氨酸氨?；?tRNA合成酶(MtTyrRS)。并且，本發(fā)明人利用所述正交氨酰基-tRNA合成酶，研發(fā)了 3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)。
[0017]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在本發(fā)明中，除了 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之外，術(shù)語“本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶”或“正交3-甲硫酪氨酸氨?；?tRNA合成酶”還包括SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的保守性變體，只要所述保守性變體具有與SEQID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且還包括將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0018]具體來說，本發(fā)明提供在體內(nèi)(例如在宿主細(xì)胞內(nèi))識(shí)別選擇密碼子(selectorcodon)如琥珀終止密碼子(TAG)從而將非天然氨基酸3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)特異性插入到多肽鏈中的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)。所述3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)包含不與宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制相互作用的正交-tRNA (Ο-tRNA)和正交`氨?；?tRNA合成酶(O-RS)配對(duì)。即，宿主細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶不會(huì)識(shí)別Ο-tRNA。類似地，本發(fā)明提供的O-RS不以顯著水平或者某些情況下不以可檢測水平地識(shí)別內(nèi)源性tRNA。利用所述翻譯系統(tǒng)能夠產(chǎn)生在翻譯過程中定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸的大量蛋白質(zhì)。
[0019]在一些方面中，本發(fā)明提供3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)。所述翻譯系統(tǒng)包含:
[0020](a)非天然氨基酸，即3-甲硫酪氨酸，
[0021](b)本發(fā)明的正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，和
[0022](c)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰-tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即3-甲硫酪氨酸)，優(yōu)先氨酰化所述0-tRNA。
[0023]優(yōu)選地，本發(fā)明的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子，優(yōu)選地為琥珀密碼子。更優(yōu)選地，本發(fā)明的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0024]所述系統(tǒng)中所用的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)即為本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的氨?；鵷RNA合成酶突變體，其含有的氨基酸序列選自由SEQ IDNO:4所示氨基酸序列和SEQID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性。
[0025]在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明提供一種3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含:
[0026](i) 3-甲硫酪氨酸；
[0027](ii)本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶；
[0028](iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨?；?tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸優(yōu)先氨?；稣籺RNA ;和
[0029](iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
[0030]優(yōu)選地，所述3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列。
[0031]該翻譯系統(tǒng)中的各種組分可以衍生自各種物種來源，例如，該翻譯系統(tǒng)中的各組分衍生自詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)。例如，正交tRNA (Ο-tRNA)為古菌來源的反密碼子突變?yōu)榕c琥珀密碼互補(bǔ)的酪氨酸t(yī)RNA。在一些實(shí)施方式中，Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些實(shí)施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，優(yōu)選地，Ο-tRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于該系統(tǒng)的正交氨?；?tRNA合成酶可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列及該序列的保守變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于該系統(tǒng)的正交氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:4所示。
[0032]在一些方面中，`本發(fā)明的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)還包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸具有由正交tRNA (Ο-tRNA)特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。在優(yōu)選方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。
[0033]在一些方面中，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相對(duì)應(yīng)的正交tRNA序列的宿主細(xì)胞。所用的宿主細(xì)胞不作具體限定，只要正交氨酰基-tRNA合成酶和正交tRNA在它們的宿主細(xì)胞環(huán)境中保留它們的正交性即可。例如，所述宿主細(xì)胞可以是真細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌。
[0034]本發(fā)明還提供產(chǎn)生在至少一個(gè)所選位置定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法。所述方法利用上述3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)。所述方法通常包括下述步驟:
[0035](a)提供含有以下組分的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)的步驟:
[0036](i)非天然氨基酸，即3-甲硫酪氨酸；
[0037](ii)本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)；
[0038](iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用3-甲硫酪氨酸優(yōu)先氨?；靓?tRNA ;和
[0039](iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；
[0040](b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列克隆并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3-甲硫酪氨酸，在所述木匾蛋白質(zhì)的翻譯過程中，3-甲硫酪氨酸氨?；恼籖NA識(shí)別編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的mRNA上的選擇密碼子以及3-甲硫酪氨酸，從而介導(dǎo)3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)特異性插入所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，從而產(chǎn)生在所選位置含有3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)。
[0041]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，適當(dāng)?shù)闹亟M載體的構(gòu)建和宿主細(xì)胞的篩選可以通過常規(guī)分子克隆技術(shù)和篩選技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
[0042]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解,在步驟(b)中，將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列克隆并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可以通過多種方式進(jìn)行，例如，將所述正交tRNA序列、編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列分別可操作性地連接到適當(dāng)?shù)妮d體中，再以任意次序或三者共同轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中；或者，也可以將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地連接到一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體中(兩種序列之間有或無適當(dāng)?shù)慕宇^連接)，將編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列可操作性地連接到另一種不同的適當(dāng)?shù)妮d體中，然后將構(gòu)建好的兩種重組載體共同轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中；或者，也可以將所述正交tRNA序列和編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列可操作性地連接到一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體中(兩種序列之間有或無適當(dāng)?shù)慕宇^連接)，將編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列可操作性地連接到另一種不同的適當(dāng)?shù)妮d體中，然后將構(gòu)建好的兩種重組載體共同轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中?；蛘?，也可以將正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列以任意適當(dāng)?shù)捻樞蚩刹僮餍缘剡B接在一起，然后克隆到一個(gè)載體上，最后轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中。上述克隆方案都是可行的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要容易地進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
[0043]另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，為了避免宿主細(xì)胞對(duì)外源重組載體的“踢除”效應(yīng)，往往選擇用帶有不同抗生素標(biāo)記的載體來構(gòu)建需要共同轉(zhuǎn)化到同一宿主細(xì)胞中的核酸序列片段。對(duì)于適當(dāng)?shù)妮d體的選擇、重組載體的構(gòu)建、宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等等，都是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，例如，可以參見美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版的分子克隆手冊(cè)。
[0044]在所述方法的一些實(shí)施方式中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟包括通過定點(diǎn)誘變使野生型氨?；?tRNA合成酶的氨基酸結(jié)合口袋`發(fā)生突變，選擇用所述非天然氨基酸(即3-甲硫酪氨酸)優(yōu)先氨?；靓?tRNA的氨?；?tRNA合成酶突變體(即，本發(fā)明所用的正交氨酰基-tRNA合成酶)。所述選擇步驟包括定點(diǎn)誘變后從得到的氨酰基-tRNA合成酶分子庫進(jìn)行所述O-RS的正選擇和負(fù)選擇(參見下述實(shí)施例2)。在一些實(shí)施方式中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟還包括提供Ο-tRNA的序列，Ο-tRNA為古菌來源的反密碼子突變?yōu)榕c琥珀密碼互補(bǔ)的酪氨酸t(yī)RNA，例如，所述Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。在這些方法中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟還包括提供含有所述翻譯系統(tǒng)所用的琥珀選擇密碼子的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸。
[0045]還可在宿主細(xì)胞內(nèi)實(shí)施產(chǎn)生含有3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法。在這些情況中，提供的宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)(即，包含編碼本發(fā)明的O-RS的核苷酸序列、Ο-tRNA序列和含有至少一個(gè)選擇密碼子的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸)，而在適宜的培養(yǎng)條件下(例如，在培養(yǎng)基中添加3-甲硫酪氨酸等)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞可導(dǎo)致在所述目標(biāo)蛋白質(zhì)中定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸。在一些實(shí)施方式中，提供步驟包括提供真細(xì)菌宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)。[0046]本發(fā)明還提供生產(chǎn)含有3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體的方法，其利用上述產(chǎn)生在至少一個(gè)所選位置定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法，其中所用的編碼肌紅蛋白突變體的核酸序列在適當(dāng)?shù)奈恢冒稣籺RNA特異性識(shí)別的選擇密碼子，在肌紅蛋白的翻譯期間，3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)插入到所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，從而產(chǎn)生含有3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體。
[0047]優(yōu)選地，本發(fā)明還提供生產(chǎn)含有3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體的方法，所述方法利用上述3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)進(jìn)行，所述方法通常包括下述步驟:
[0048](a)提供含有以下組分的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)的步驟:
[0049](i) 3-甲硫酪氨酸；
[0050](ii)正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)；
[0051](iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，其中所述O-RS用所述3-甲硫酪氨酸優(yōu)先氨酰化所述Ο-tRNA ;和
[0052](iv)編碼所述肌紅蛋白的核酸，例如，但不限于，SEQ ID NO:5，其中所述核酸含有所述Ο-tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子(任選地為琥珀密碼子)；
[0053](b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列克隆并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3-甲硫酪氨酸，在所述目標(biāo)蛋白質(zhì)(即肌紅蛋白)的翻譯過程中，3-甲硫酪氨酸氨?；恼籖NA識(shí)別編碼肌紅蛋白的mRNA上的選擇密碼子以及3-甲硫酪氨酸，從而介導(dǎo)3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)插入所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的特定位置(即，所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置)，之后通過模擬Thioalkalivibrio nitratireducens細(xì)胞色素c亞硝酸鹽還原酶(TvNiR)活性中心的Tyr-Cys輔助因子從而增強(qiáng)其酶活性。
[0054]本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生的具有亞硝酸鹽還原酶活性的含有3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體，在野生型肌紅蛋白的33位引入3-甲硫酪氨酸，同時(shí)將29位亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸，所述肌紅蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:6。
[0055]最后，本發(fā)明人經(jīng)過篩選，還獲得了一種能夠催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶(簡寫為TPL)突變體，其氨基酸序列為:
[0056](I)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或
[0057](2)將SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相同的催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0058]分子模型表明，與野生型酪氨酸酚裂解酶相比較，該突變體的36位氨基酸突變?yōu)榱涟彼岷箫@著地?cái)U(kuò)大了酶口袋，使酶和底物可以更好地作用，從而高效地催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸。酶催化反應(yīng)液經(jīng)過HPLC純化后產(chǎn)率可達(dá)到40%，最終獲得較高產(chǎn)量的3-甲硫酪氨酸。這也是通過進(jìn)化TPL突變體來擴(kuò)大其底物范圍的首次應(yīng)用。
[0059]此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在本發(fā)明中，術(shù)語“能夠催化2-羥基苯硫醚生成
3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶突變體”不僅包括SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，還包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性，所述功能衍生物是指將SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相同的催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0060]3、有益效果
[0061]通過在肌紅蛋白中定點(diǎn)特異性插入非天然的氨基酸，即3-甲硫酪氨酸(MtTyr),我們成功地設(shè)計(jì)出了一個(gè)亞硝酸鹽還原酶功能模型MtTyrMb (即，與野生型肌紅蛋白相比，在氨基酸位點(diǎn)33位插入3-甲硫酪氨酸，同時(shí)將29位亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸的肌紅蛋白突變體)，它可以高效地催化強(qiáng)羥胺還原成銨根離子，并且其酶活性是對(duì)照的肌紅蛋白突變體TyrMb (即，與野生型肌紅蛋白相比，33位苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼幔瑫r(shí)將29位亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸的肌紅蛋白突變體，其可以按照常規(guī)分子克隆和突變方法制備)的四倍。該研究首次直接證實(shí)了酪氨酸殘基上的3-甲硫取代基可以顯著提高酶活性。
[0062]同時(shí)，由于野生型酪氨酸酚裂解酶無法催化生成3-甲硫酪氨酸，我們通過進(jìn)化酪氨酸酚裂解酶(TPL)，使其可以直接催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸，得到一種酪氨酸酚裂解酶突變體，其氨基酸序列為SEQ IDNO:9，使用該酪氨酸酚裂解酶突變體只需一步反應(yīng)就可以達(dá)到40%的產(chǎn)率，最終能夠較容易地獲得大量定點(diǎn)插入3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)。
[0063]本發(fā)明中通過TPL突變體催化合成的MtTyr，其結(jié)構(gòu)與GO、CDO、NirA和TvNiR活性中心上經(jīng)過翻譯后修飾的Tyr-Cys輔助因子高度相似，因此可以作為模型來詳細(xì)研究這些金屬酶的催化機(jī)理，同時(shí)也具有在合成生物學(xué)和工業(yè)催化方面的應(yīng)用潛力。目前，研究半乳糖氧化酶的定向進(jìn)化并獲得利用單糖作為底物的突變體已成為研究熱點(diǎn)，而我們發(fā)明設(shè)計(jì)的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)，再結(jié)合理性及計(jì)算設(shè)計(jì)方法，可能為解決半乳糖氧化酶的定向進(jìn)化提供有效的途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
`[0064]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0065]圖1是TPL突變體(SEQ ID NO:9)催化合成3_甲硫酪氨酸的反應(yīng)式；
[0066]圖2:圖2A是野生型TPL活性中心的晶體結(jié)構(gòu)圖，圖2B是薄層層析法篩選TLP突變體；
[0067]圖3是MtTyr的HPLC純化圖譜；
[0068]圖4是MtTyr的質(zhì)譜圖；
[0069]圖5是正交tRNA、野生型酪氨酰tRNA合成酶、本發(fā)明的正交氨?；?tRNA合成酶、肌紅蛋白突變體、酪氨酸酚裂解酶(TPL)突變體的序列；
[0070]圖6:圖6A是4TAG-Mb (即，4位插入3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體)和MtTyrMb的SDS-PAGE電泳圖，圖6B是4TAG_Mb的質(zhì)譜圖；
[0071]圖7:圖7A是Wolinella succinogenes細(xì)胞色素c亞硝酸鹽還原酶和Thioalkalivibrio nitratireducens細(xì)胞色素c亞硝酸鹽還原酶活性中心的晶體對(duì)比結(jié)構(gòu)圖；圖7B是MtTyrMb的結(jié)構(gòu)模型圖；
[0072]圖8是肌紅蛋白突變體(MtTyrMb和TyrMb)和野生型肌紅蛋白(wtMb)催化還原羥胺的反應(yīng)對(duì)比圖；
[0073]圖9是MtTyrMb催化還原羥胺的核磁共振光譜圖；[0074]圖10是肌紅蛋白突變體(MtTyrMb和TyrMb)和野生型肌紅蛋白(wtMb)催化還原羥胺的反應(yīng)速率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0075]以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0076]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，除非特別說明，下述實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為可通過商業(yè)途徑購得的分析純級(jí)別的試劑。
[0077]實(shí)施例1:MtTyr的生物催化合成(圖1_圖4)
[0078]本發(fā)明采用生物酶催化的方法，利用從弗氏檸檬酸細(xì)菌(ATCC 8090，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))中克隆出的酪氨酸酚裂解酶(TPL)催化2-羥基苯硫醚合成3-甲硫酪氨酸，催化反應(yīng)式見圖1。
[0079]但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生型TPL無法催化生成3-甲硫酪氨酸。因此，本發(fā)明人分析了 TPL的晶體結(jié)構(gòu)圖(圖2A)，挑選出448位苯丙氨酸、36位苯丙氨酸和288位甲硫氨酸，引入NNK突變(N = A+T+C+G ；K = T+G)，構(gòu)建成pEt_TPL突變庫來進(jìn)行TPL的定向進(jìn)化。從突變庫挑選出96個(gè)單克隆，用96孔板培養(yǎng)過夜后，加入溶菌酶裂解細(xì)胞，然后加入2-羥基苯硫醚、氯化銨和丙酮酸鈉，37°C孵育4h，用茚三酮薄層色譜法檢測氨基酸的形成。結(jié)果表明(圖2B)，其中一個(gè)克隆成功地催化形成了 3-甲硫酪氨酸。測序結(jié)果顯示，該酪氨酸酚裂解酶突變體的氨基酸序列為SEQ IDNO:9，該突變體將野生型TPL 36位的苯丙氨酸突變成了亮氨酸。使用該酪氨酸酚裂解酶突變體只需一步反應(yīng)就可以達(dá)到40%的產(chǎn)率，最終能夠較容易地獲得大量定點(diǎn)插入3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)。
[0080]我們將篩選得到的TPL突變體進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后收菌，離心，超聲破碎，采用鎳柱純化，得到突變蛋白酶。取30mM乙酸銨、IOmM 2-羥基苯硫醚(購自北京百靈威公司)、60禮丙酮酸鈉、501111巰基乙醇、4(`^1磷酸吡哆醛和IOmg突變蛋白酶，定容至1L，pH 8.0，然后室溫避光攪拌3天。收集水相，通過HPLC分離純化得到白色粉末(圖3，圖4)，產(chǎn)率40% ο (YMC AA12S052503WT column, 12ml/min flow rate, from 10% to 90%CH3CN,0.1%TFA (w/v) in water, over the course of 30min).MS:m/z:228 [M+H] + ;H_NMR (400MHz，DMS0-d6):2.35(s，3H)，3.00(m，2H)，4.12 (t，1H)，6.73 (d，1H，J = 8.1)，6.83 (dd，J = 8.1，
1.96，1H)，6.97 (d, 1H)，8.23 (s, 2H)，9.88 (s, 1H)。
[0081]以上合成反應(yīng)所需化學(xué)試劑如無特別說明，均購自Sigma公司，均為分析純以上級(jí)別。
[0082]另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在本發(fā)明中，術(shù)語“能夠催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酪氨酸酚裂解酶突變體”不僅包括SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，還包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的功能片段或功能衍生物，即，所述功能片段保留催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性，所述功能衍生物是將SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相同的催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQID NO:9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
[0083]實(shí)施例2:進(jìn)化MtTyr特異性氨?；?tRNA合成酶[0084]為了在基因中位點(diǎn)特異性插入MtTyr，需要在所用的E.coli宿主細(xì)胞中引入氨酰基-tRNA合成酶/tRNA正交對(duì)，這個(gè)正交對(duì)來源于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)琥珀抑制酪氨酰tRNA (MjtRNACUATyr) /酪氨酰tRNA合成酶(MjTyrRS，野生型，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2)對(duì)。MjTyrRS突變庫構(gòu)建在卡納霉素抗性pBK質(zhì)粒(購自美國scripps研究所Peter G.Schultz實(shí)驗(yàn)室)中，位于該質(zhì)粒上E.coli谷氨酰胺合成酶的啟動(dòng)子和終止子之間。所使用的合成酶突變庫為pBk-lib-jwl庫，該突變庫的構(gòu)建方法為:在MjTyrRS 基因上挑選 6 個(gè)位點(diǎn)(Tyr32，Leu65，Phel08，Glnl09，Aspl58，和 Leul62)引入 NNK突變(N = A+T+C+G ;K = T+G)，另外 6個(gè)位點(diǎn)(Ile63,Ala67,His70,Tyrll4, Ilel59,Vall64)或隨機(jī)突變?yōu)?Gly 或保持不變(參見 Xie, J.；Liu, ff.S.；Schultz, P.G.Angew.Chem.,Int.Ed.2007，46，9239-9242 ；Wang, JY.；Zhang W.；Song WJ ；et al.J.Am.Chem.Soc.2010，132，14812-14818)。
[0085]通過正負(fù)篩選來進(jìn)化特異性識(shí)別MtTyr的氨?；?tRNA合成酶。正篩選質(zhì)粒包含MjtRNAai/' TAG突變的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，啟動(dòng)表達(dá)綠色熒光蛋白的琥珀突變的T7RNA聚合酶，四環(huán)素抗性基因。負(fù)篩選質(zhì)粒包含MjtRNAai/'在阿拉伯糖操縱子下的琥珀突變芽孢桿菌RNA酶基因，以及氨芐青霉素抗性基因。進(jìn)行3輪正負(fù)篩選:包含有正篩選質(zhì)粒的E.coli DHlOB細(xì)胞作為正篩選寄主細(xì)胞。細(xì)胞電轉(zhuǎn)pbk-lib-jwl庫，SOC培養(yǎng)基(2%(W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母粉，0.05% (W/V)NaCl,2.5mM KCl, IOmM MgCl2, 20mM 葡萄糖)在37°C培養(yǎng)I小時(shí)。之后換用極限培養(yǎng)基(GMML極限培養(yǎng)基的配方:M9鹽/甘油:764g Na2HPO4.7H20或者 30g Na2HPO4,15g KH2PO4,2.5g NaCl，5g NH4Cl, 50ml 甘油，高壓滅菌，pH 7.0 ；1M MgSO4:高壓滅菌；50mM CaCl2:高壓滅菌；25mM FeCl2:過濾滅菌;0.3Μ亮氨酸:溶解于0.3Μ NaOH中，過濾滅菌；1L液體GMML培養(yǎng)基:200ml M9鹽/甘油，2ml MgSO4, 2mlCaCl2, 2ml FeCl2, Iml亮氨酸)洗兩次，鋪板固體極限培養(yǎng)基(在液體GMML培養(yǎng)基中加入500ml 3%瓊脂粉，ImM MtTyr，50mg/L卡那霉素，60mg/L氯霉素，15mg/L四環(huán)素)，37°C培養(yǎng)60小時(shí)。收取細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA，電泳分離，膠回收。然后，將經(jīng)過正篩選的pBK-lib-jwl轉(zhuǎn)化到包含負(fù)篩選質(zhì)粒的DHlOB感受態(tài)細(xì)胞中。SOC培養(yǎng)基中恢復(fù)I小時(shí)。之后涂板包含
`0.2%阿拉伯糖(購自sigma公司)的LB固體培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含IOg胰蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl)。37°C培養(yǎng)8-12小時(shí)。共重復(fù)3輪。
[0086]最后一輪正篩選挑384個(gè)克隆，分別點(diǎn)板在含有ImM MtTyr、氯霉素60，80，100，120mg/L的GMML固體培養(yǎng)基上，及不包含MtTyr、但包含氯霉素0，20，40，60mg/L的GMML固體培養(yǎng)基。挑選在在ImM MtTyrl00mg/L氯霉素的培養(yǎng)基上生長，而在OmM MtTyr 20mg/L氯霉素培養(yǎng)基中不生長的克隆進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。最終挑出I個(gè)克隆，插入3-甲硫酪氨酸效率最高，測序表明，克隆所包含的氨?；?tRNA合成酶突變體(MtTyrRS)的氨基酸序列為SEQID NO:4 所示，其中突變位點(diǎn)為 Tyr32Glu, His70Gly, Aspl58Ala 和 Leul62Pro。
[0087]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在本發(fā)明中，除了 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列之外，術(shù)語“正交氨?；?tRNA合成酶”或“正交3-甲硫酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶”還包括SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的保守性變體，只要所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性即可；并且還包括將SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性的由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。[0088]實(shí)施例3:表達(dá)MtTyr-肌紅蛋白及質(zhì)譜鑒定
[0089]將正交tRNA (SEQ ID NO:1)和編碼肌紅蛋白的核苷酸序列(4TAG或33TAG) (SEQID N0:5和7)構(gòu)建到pBAD載體(購自美國scripps研究所Peter G.Schultz實(shí)驗(yàn)室)上，篩選出來的編碼MtTyrRS的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)構(gòu)建到pBK載體(購自美國scripps研究所Peter G.Schultz實(shí)驗(yàn)室)上，然后共轉(zhuǎn)化到DHlOB細(xì)胞(購自全式金公司)中。挑取單個(gè)克隆在37°C培養(yǎng)到0D_約等于0.5時(shí)，向LB培養(yǎng)基中加入ImMMtTyr及0.2%阿拉伯糖(購自sigma公司)培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照不加入MtTyr。6_8小時(shí)之后，收菌，N1-NTA純化蛋白，并用SDS-PAGE電泳分析(圖6A)。
[0090]我們發(fā)現(xiàn)，只有在存在MtTyr的培養(yǎng)基中才能純化出全長的肌紅蛋白，這說明篩選出來的MtTyrRS可以特異性的識(shí)別MtTyr。在LB培養(yǎng)基中MtTyr-肌紅蛋白的產(chǎn)率為10mg/L,而野生型肌紅蛋白的產(chǎn)率為50mg/L。為了檢測MtTyr僅僅插入到肌紅蛋白的4位琥珀突變位點(diǎn)，我們對(duì)4-MtTyr-肌紅蛋白進(jìn)行了 ES1-TOF質(zhì)譜檢測，檢測結(jié)果分子量為18476.5Da(圖6B)，與計(jì)算的分子量18477.2Da吻合。
[0091]實(shí)施例4:表達(dá)MtTyr-肌紅蛋白突變體作為TvNiR功能模型
[0092]我們用基因工程方法構(gòu)建了肌紅蛋白突變體MtTyrMb (核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)，其中29位亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸，33位苯丙氨酸突變?yōu)門AG終止密碼子，然后用實(shí)施例3中的相同方法在肌紅蛋白突變體的33位定點(diǎn)特異性插入MtTyr，表達(dá)產(chǎn)生MtTyrMb突變蛋白(氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示)，突變的3-甲硫酪氨酸和組氨酸殘基可以模擬TvNiR活性中心上的303位酪氨酸殘基和316位組氨酸殘基(圖7)。作為對(duì)照，我們還構(gòu)建了突變體TyrMb (核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)，其中29位亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸，33位苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼帷?br> [0093]我們首先通過15N核磁共振光譜測試了 MtTyrMb還原羥胺的活性。在500mM，pH
7.0的磷酸鈉緩沖液中加入50mM 15NH20H(購自劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室)和IOOmM連二亞硫酸鈉(俗稱保險(xiǎn)粉)，核磁共振光譜圖沒有變化；接著往上述溶液中加入5 μ M MtTyrMb, 30分鐘后，發(fā)現(xiàn)15NH2OH在90ppm的吸收峰消失，而在21ppm處產(chǎn)生了一個(gè)新的吸收峰，證明羥胺已被還原成了銨根離子(圖8，圖9)。
[0094]為了進(jìn)一步檢測反應(yīng)速率，我們使用0.5μ M肌紅蛋白突變體反應(yīng)不同時(shí)間后，加入 50 μ M 三擬基氯甘氨酸釕(tricarbonylchloro (glycinato) ruthenium(II), C0RM-3)終止反應(yīng)，然后通過15N核磁共振光譜測量分析90ppm和21ppm處的化學(xué)位移并進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)以20mM15N-尿素(購自劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室)作為內(nèi)標(biāo)物。結(jié)果如圖10所示，MtTyrMb可以催化95%的輕胺還原成銨根離子,反應(yīng)速率為400 μ M/min (kcat = SOOmirT1) ；TyrMb催化反應(yīng)的速率僅為MtTyrMb的四分之一，keat = 200min_1o而MtTyrMb和TyrMb的km值卻比較近似，分別為7mM和6mM。
[0095]應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。
【權(quán)利要求】
1.一種正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQID NO:4所示氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的保守性變體組成的組，所述保守性變體具有與SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同的酶活性，所述正交氨酰基-tRNA合成酶命名為正交3-甲硫酪氨酸氨?；?tRNA合成酶。
2.—種3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含: (i)3-甲硫酪氨酸； (?)權(quán)利要求1所述的正交氨?；?tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨?；?tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸優(yōu)先氨酰化所述正交tRNA ;和 (iv)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子。
3.如權(quán)利要求2所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所述選擇密碼子是琥珀密碼子，并且所述翻譯系統(tǒng)還包含編碼正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列。
4.一種宿主細(xì)胞,其包含編碼權(quán)利要求1所述的正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列和相對(duì)應(yīng)的正交tRNA序列。
5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。
6.一種產(chǎn)生在至少一個(gè)所選位置定點(diǎn)特異性插入3-甲硫酪氨酸的突變蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括下述步驟: (a)提供權(quán)利要求2所述的3-甲硫酪氨酸翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含: (i)3-甲硫酪氨酸； (?)權(quán)利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨?；?tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸優(yōu)先氨酰化所述正交tRNA ;和 (iv)編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸在所選的位置包含所述正交tRNA特異性識(shí)別的至少一個(gè)選擇密碼子；和 (b)將所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨?；?tRNA合成酶的核苷酸序列以及編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列克隆并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入3-甲硫酪氨酸，在所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的翻譯期間，3-甲硫酪氨酸氨?；恼籺RNA識(shí)別編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的mRNA上的選擇密碼子以及3-甲硫酪氨酸，從而介導(dǎo)3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)特異性插入所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，從而產(chǎn)生在所選位置含3-甲硫酪氨酸的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。
8.生產(chǎn)含有3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體的方法，其利用權(quán)利要求6所述的方法，其中所用的編碼肌紅蛋白突變體的核酸序列在適當(dāng)?shù)奈恢冒稣籺RNA特異性識(shí)別的選擇密碼子，在肌紅蛋白的翻譯期間，3-甲硫酪氨酸定點(diǎn)插入到所述選擇密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸位置，從而產(chǎn)生含有3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體。
9.由權(quán)利要求8所述的方法獲得的含有3-甲硫酪氨酸的肌紅蛋白突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:6，所述肌紅蛋白突變體具有亞硝酸鹽還原酶活性。
10.一種酪氨酸酚裂解酶突變體，所述酪氨酸酚裂解酶突變體催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸，其氨基酸序列為: (1)SEQID NO:9所示的氨基酸序列，或 (2)將SEQID NO:9所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列相同的催化2-羥基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQ ID NO:9所示·的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】C12P21/00GK103820410SQ201210464989
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月16日
【發(fā)明者】王江云, 周慶, 胡美榮, 張維, 姜麗, 柯莎, 周娟作, 江歡歡 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生物物理研究所