專利名稱：一種(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法。
背景技術(shù)：
⑶-4-氯-3-羥基丁酸乙酯是制備羥甲基戊二酰CoA (HMG-CoA)還原酶抑制劑如他汀類藥物的關(guān)鍵手性中間體。他汀類藥物是目前世界上最為暢銷的降膽固醇和降血脂藥物，也是銷售額最高的一類藥物。因此，作為他汀類藥物關(guān)鍵手性中間體的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯具有較高的需求量和廣泛的應用范圍。 目前，利用還原法生產(chǎn)4-氯-3-羰基丁酸乙酯的方法可以分為化學法和生物法，其中生物法以其所具有的反應條件溫和、立體專一性強、轉(zhuǎn)化率高等特點被廣泛地研究和應用。中國發(fā)明專利申請例如申請?zhí)?00810124754. 2,201010213724. 6,201110225388. I等公開了數(shù)種酮還原酶生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，然而這些方法的酶和輔因子用量較高，并需要添加葡萄糖作為氫供體。其底物濃度雖然可以達到30%，但是必須添加大量有機溶劑形成兩相體系，并且需要分批補料加入底物，操作繁瑣，安全性不好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改進的-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物，使該底物在生物催化劑、輔因子及氫供體的存在下發(fā)生不對稱還原反應生成(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其特征在于所述生物催化劑為重組酮還原酶，該酮還原酶的制備方法為將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35 40°C下活化8 12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35 40°C下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D_值達到O. 6 O. 8時，加入誘導劑，于25 33°C下繼續(xù)培養(yǎng)8 12小時，離心，收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰水浴中超聲破碎8 12分鐘，再離心，將上清液預凍至溫度降至-10°C _25°C，然后再凍干24 48小時，即得凍干粉狀的重組酮還原酶；所述的氫供體為異丙醇，所述不對稱還原反應在pH為7. O 9. O的水相緩沖液和甲苯的混合體系中進行，其中，水相緩沖液與甲苯的體積比為4 20 I。根據(jù)本發(fā)明的進一步實施方案反應起始時的反應體系中，底物的濃度為10% 40% (w/v)，重組酮還原酶的用量為底物質(zhì)量的O. 5% 2.0% (w/w)，異丙醇的物質(zhì)的量為底物的物質(zhì)的量的I. 05 I. 2倍，輔因子的用量為底物質(zhì)量的O. 02% O. 1% (w/w)。根據(jù)一個優(yōu)選方面，反應起始時的反應體系中，底物的濃度為31% 40% (w/v)。進一步地，所述的誘導劑可以為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，乳糖等，其中優(yōu)選異丙基_ β -D-硫代半乳糖苷。
進一步地，所述的輔因子可以為NAD/NADH或NADP/NADPH，其中更優(yōu)選NADP/NADPH0
根據(jù)本發(fā)明，所述的水相緩沖液可以為磷酸鹽緩沖液或Tri-HCl緩沖液，其中更優(yōu)選磷酸鹽緩沖液。根據(jù)一個具體方面，所述的水相緩沖液為磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽和水配制而成的磷酸鹽緩沖液，磷酸氫鹽與磷酸二氫鹽的總濃度為10 200mM。 優(yōu)選地，所述水相緩沖液與甲苯的體積比為4 10 I，更優(yōu)選為4 6 I。根據(jù)本發(fā)明的一個具體方面，所述制備方法的實施過程如下在反應容器中加入配制好的所述水相緩沖液或形成所述水相緩沖液所需要的成分，然后依次加入甲苯、異丙醇、底物、重組酮還原酶以及輔因子，于溫度25V 45°C下攪拌反應，利用HPLC-MS方法或氣相色譜方法檢測反應進程，至轉(zhuǎn)化率達到80% 100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，即得(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)品。優(yōu)選地，至轉(zhuǎn)化率大于99%時，方加入乙酸乙酯進行萃取。通常在所述反應條件下，反應24h后，轉(zhuǎn)化率即達到99%以上。通過該實施過程獲得的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)品已經(jīng)達到應用的要求，無需再進一步純化。根據(jù)本發(fā)明，所用的原料4-氯-3-羰基丁酸乙酯、含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落及其它使用到的原料均可商購獲得。此外，本發(fā)明中所述的重組酮還原酶，由于本申請人有對應的商品在銷售，它人在實施本發(fā)明方法時可以按照本發(fā)明所述方法制備或購買。本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。由于以上技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢本發(fā)明方法通過采用特定的重組酮還原酶，解決了傳統(tǒng)生物法中有機溶劑甲苯加入過多、催化效率低以及成本高的問題。該方法反應條件溫和，反應效率高，操作簡便，特別是，反應底物的濃度可以提高至40%，大大提高了制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的效率和降低了反應的成本。
具體實施例方式以下提供的(S)-4_氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，是在pH為7. O 9. O的磷酸鹽緩沖液中，加入重組酮還原酶作為生物催化劑，采用少量甲苯作為底物分散劑，在輔因子NADPH的存在下，不對稱還原濃度為35% 40% (w/v)的4-氯-3-羰基丁酸乙酯，加入I. 2至I. 5當量的異丙醇作為氫供體，在24小時左右，以大于99%的轉(zhuǎn)化率，生成目的產(chǎn)物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其反應式如下所示
權(quán)利要求
1.一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物，使該底物在生物催化劑、輔因子及氫供體的存在下發(fā)生不對稱還原反應生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其特征在于所述生物催化劑為重組酮還原酶，該酮還原酶的制備方法為將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35 40°C下活化8 12小時，將活化后得到的培養(yǎng)物接種到含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于35 40°C下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD6tltl值達到O. 6^0. 8時，加入誘導劑，于25 33°C下繼續(xù)培養(yǎng)8 12小時，離心，收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰水浴中超聲破碎8 12分鐘，再離心，將上清液預凍至溫度降至-10°C '25°C，然后再凍干2Γ48小時，即得凍干粉狀的重組酮還原酶；所述的氫供體為異丙醇，所述不對稱還原反應在PH為7. (T9. O的水相緩沖液和甲苯的混合體系中進行，其中，水相緩沖液與甲苯的體積比為4 20:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于反應起始時的反應體系中，底物的濃度為10°/Γ40% (w/v)，重組酮還原酶的用量為底物質(zhì)量的0.59T2.0% (w/w)，異丙醇的物質(zhì)的量為底物的物質(zhì)的量的1.051.2倍，輔因子的用量為底物質(zhì)量的O. 029Γ0. 1% (w/w)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于反應起始時的反應體系中，底物的濃度為319T40% (w/v)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述的誘導劑為異丙基_β -D-硫代半乳糖苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述的輔因子為NAD/NADH或NADP/NADPH。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述的水相緩沖液為磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽和水配制而成的磷酸鹽緩沖液，磷酸氫鹽與磷酸二氫鹽的總濃度為1(T200 mM ;或者，所述的水相緩沖液為Tri-HCl緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述水相緩沖液與甲苯的體積比為Γιο: I。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述水相緩沖液與甲苯的體積比為4飛1。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3或6所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述制備方法的實施過程如下在反應容器中加入配制好的所述水相緩沖液或形成所述水相緩沖液所需要的成分，然后依次加入甲苯、異丙醇、底物、重組酮還原酶以及輔因子，于溫度25°C 45°C下攪拌反應，利用HPLC-MS方法或氣相色譜方法檢測反應進程，至轉(zhuǎn)化率達到809^100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，即得(S)-4-氯-3-輕基丁酸乙酯廣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于至轉(zhuǎn)化率大于99%時，方加入乙酸乙酯進行萃取。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物，使該底物在生物催化劑、輔因子及氫供體的存在下發(fā)生不對稱還原反應生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，生物催化劑為重組酮還原酶，氫供體為異丙醇，所述不對稱還原反應在pH為7.0~9.0的水相緩沖液和甲苯的混合體系中進行，水相緩沖液與甲苯的體積比為4~20:1。本發(fā)明方法解決了傳統(tǒng)生物法中需要額外加入輔酶體系、有機溶劑加入過多、催化效率低以及成本高的問題。該方法反應條件溫和，反應效率高，操作簡便，反應底物的濃度可以提高至40%，大大提高了制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的效率和降低了反應的成本。
文檔編號C12N9/02GK102925501SQ201210465009
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者鞠鑫, 唐圓圓 申請人:蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司