專利名稱：具殺線蟲活力的球毛殼菌及其產(chǎn)生的代謝物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一株具有殺線蟲活性的球毛殼菌，以及應(yīng)用其真菌代謝物生物防治根結(jié)線蟲的方法。
背景技術(shù)：
全世界嚴(yán)重危害植物的線蟲有根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、滑刃線蟲、莖線蟲、粒線蟲及短體(根腐)線蟲等(劉維志，2002)。其中，根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)作為危害農(nóng)作物的重要病原生物之一，給世界各地大面積的農(nóng)作物帶來了極大的危害(趙鴻等，2003)。根結(jié)線蟲寄主范圍很廣，超過3000種植物，分屬于114個(gè)科。茄科、葫蘆科和十字花科等植物，根結(jié)線蟲病較普遍。根結(jié)線蟲的生活史比較簡單，從卵發(fā)育成幼蟲，經(jīng)四次蛻 皮，最后變成成蟲。大多數(shù)線蟲生活周期大約為3 — 4周。根結(jié)線蟲產(chǎn)卵后，卵在卵殼內(nèi)發(fā)育成一齡幼蟲，并在卵殼內(nèi)脫皮一次，孵化后為二齡幼蟲，二齡幼蟲棲息在土壤內(nèi)，伺機(jī)侵染，通常從根尖侵入根內(nèi)，并在根內(nèi)定居和生長，再經(jīng)兩次脫皮變成四齡幼蟲，在第四次脫皮前，雄幼蟲變?yōu)榧?xì)長形，雌幼蟲膨大為長梨形，最后一次脫皮后，分別成為雌、雄成蟲。雄蟲離開根在土壤中活動(dòng)，雌蟲留在根內(nèi)，可以不經(jīng)交配而產(chǎn)卵，卵產(chǎn)在膠質(zhì)的卵囊內(nèi)。在所有的根結(jié)線蟲中，南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita,或Μ· incognita)的危害最為嚴(yán)重。每年由根結(jié)線蟲造成的農(nóng)作物減產(chǎn)損失大于1000億美元。現(xiàn)有的殺蟲劑不能有效的抑制不斷增長的線蟲數(shù)量。而大量使用溴甲烷或呋喃丹等劇毒農(nóng)藥殺死根結(jié)線蟲的傳統(tǒng)方法，由于存在環(huán)境和食品安全風(fēng)險(xiǎn)，已經(jīng)逐步被禁止使用。因此，尋找它們的替代物，如生物制劑和天然產(chǎn)物，以有效防治根結(jié)線蟲的危害已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)許多真菌具有潛在的抗線蟲活性。最近,子囊真菌球毛殼菌Chaetomium globosum (或C. globosum)已開始應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物防治，例如，作為植物病原微生物和蚜蟲的生防制劑。也有一些報(bào)道稱此菌具有殺線蟲活性。C. globosum的粗制培養(yǎng)液能夠抑制M. incognita和大豆孢囊線蟲(Heteroderaglycines)的卵孵化(Meyer等,2004)。球毛殼屬Chaetomium ChlOOl菌株的發(fā)酵液不僅對M. incognita 二齡幼蟲具有顯著的致死作用，還能夠明顯降低根結(jié)的形成數(shù)量(Yan等，2011)。但是,從C. globosum中分離鑒定殺線蟲活性的天然產(chǎn)物的研究極少。食線蟲真菌可以產(chǎn)生次生代謝物以侵染或者殺死線蟲，這些天然化合物是具有潛力的用以控制線蟲的化學(xué)殺蟲劑和熏蒸劑的替代品。另外，考慮到普遍存在于土壤中，而且可以作為防治病原微生物和害蟲如蚜蟲的生物制劑，探索c. globosum的殺線蟲活力并提取生物制劑將成為今后商業(yè)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用的重點(diǎn)研究。國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索表明，目前還沒有將球毛殼菌的次生代謝產(chǎn)物作為線蟲防治藥劑的報(bào)道。因此利用C. globosum的發(fā)酵產(chǎn)物制備殺線蟲劑是一條值得探索的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是選擇對根結(jié)線蟲具有高殺蟲活性的真菌菌株，并將菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，從代謝產(chǎn)物中提取具有殺線蟲活性物質(zhì)的有效成分，開發(fā)殺線蟲生物農(nóng)藥，其中，所述的根結(jié)線蟲優(yōu)選是南方根結(jié)線蟲。本發(fā)明正是基于上述理論，以根結(jié)線蟲為靶標(biāo)，從真菌次生代謝產(chǎn)物中尋找高效殺線蟲活性物質(zhì)，擬為研究開發(fā)新型生物殺線蟲劑尋找新的資源。在尋找具有潛力的生物殺線蟲劑的過程中，我們分離得到一株球毛殼菌C. globosum NK106,并且從其發(fā)酵液中分離純化出一種次生代謝產(chǎn)物球毛殼菌素chaetoglobosin A(ChA)0進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵液和分離純化的ChA對M. incognita具有很強(qiáng)的殺滅活性。本發(fā)明首先提供了一株具有殺線蟲活性的真菌菌株，即子囊真菌球毛殼菌Chaetomium globosum NK106,已于2012年10月29日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號(hào)CGMCC6716。C. globosum NK106是從大量真菌菌株中篩選出的一株對南方根結(jié)線蟲具有良好殺線蟲活性的真菌菌株。本發(fā)明同時(shí)從球毛殼菌C. globosum NK106的發(fā)酵液中分離純化出一種次生代謝產(chǎn)物球毛殼菌素chaetoglobosin A (ChA)0該代謝產(chǎn)物ChA能夠用于防治植物寄生線蟲，特別是對M. incognita具有很強(qiáng)的殺滅活性。該代謝物是由本發(fā)明的真菌菌株經(jīng)過常規(guī)的液體發(fā)酵培養(yǎng)后提取制備的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明提供了一株具有殺線蟲活性的球毛殼菌C. globosum NK106。本發(fā)明提供的真菌代謝物ChA是國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)具有殺線蟲活性的物質(zhì)。本發(fā)明的生物殺線蟲劑為純生物制劑，可用于對根結(jié)線蟲等植物寄生線蟲的生物防治。本發(fā)明的殺線蟲劑對于環(huán)境及植物、人、動(dòng)物等所有生物無不良影響，而且生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)過程簡單，不污染環(huán)境。微生物殺線蟲劑在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對黃瓜沒有藥害，反而可以促進(jìn)和剌激作物的生長，安全性好。本發(fā)明對于植物線蟲的生物防治、微生物殺線劑的開發(fā)應(yīng)用和農(nóng)產(chǎn)品的無公害生產(chǎn)，將具有極其重要的意義。


圖I是球毛殼菌Chaetomium globosum NK106的菌體形態(tài)。A是固體PDA上培養(yǎng)2周的菌體形態(tài)，B是液體PDA中培養(yǎng)9天的菌體形態(tài)。圖2是高效液相色譜(HPLC)分析方法純化和鑒定NK106發(fā)酵產(chǎn)物中所含球毛殼菌素ChA。A是ChA標(biāo)準(zhǔn)樣品，出峰時(shí)間14. 490min，B是NK106發(fā)酵產(chǎn)物，出峰時(shí)間14. 480min。圖3是不同濃度真菌發(fā)酵濾液和提純ChA對J2死亡率的影響。A是不同濃度的發(fā)酵液處理，B是不同濃度的ChA處理?！D4是不同濃度真菌發(fā)酵濾液和提純ChA處理線蟲后對其侵染根部的影響。A是不同濃度的發(fā)酵液處理，B是不同濃度的ChA處理。本發(fā)明提供的具有殺線蟲活性的菌株是一株腐生子囊真菌，已于2012年10月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)CGMCC6716,分類命名Chaetomium globosumNK106。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I、本發(fā)明所述的球毛殼菌C. globosum NK106的培養(yǎng)特征本發(fā)明C. globosum NK106菌株分離自東北某地的松柏(Cupressns sp.)樹皮上。菌株在PDA平板上28°C培養(yǎng)2周后，菌體呈現(xiàn)棕褐色(如圖IA所示)，用無菌水收集孢子得到孢子懸浮液。將孢子懸浮液轉(zhuǎn)接于含有200ml PDA 土豆培養(yǎng)基的500ml燒瓶中，于28°C，180rpm震蕩培養(yǎng)9天(如圖IB所示)。每個(gè)燒瓶接種I X IO5個(gè)孢子。PDA培養(yǎng)基配方(g/L):馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g (固體培養(yǎng)基中添加)。實(shí)施例2、本發(fā)明提供的C. globosum NK106發(fā)酵產(chǎn)物處理過程，產(chǎn)物的分析和鑒
定將實(shí)施例I中在PDA中培養(yǎng)的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，使得菌絲同發(fā)酵液分離開來；將抽濾后所得發(fā)酵上清液與等體積二氯甲烷混合，萃取過夜；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對上步所得有機(jī)相濾液濃縮后得到粗提產(chǎn)物，進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析鑒定和收集。HPLC選擇分析型C-180DS色譜柱(4. 6X250mm, Kromasil),色譜條件檢測波長227nm，流速lmL/min，柱溫是室溫，流動(dòng)相為甲醇水=7 :3。通過實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵產(chǎn)物中含有與ChA標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的物質(zhì)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2)。(A. ChA標(biāo)準(zhǔn)品，14. 490min ；B. NK106發(fā)酵產(chǎn)物，14.480min)。根據(jù)出峰面積，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸的方法可以計(jì)算出發(fā)酵產(chǎn)物中ChA的含量。ChA在培養(yǎng)至第9天時(shí)達(dá)到最大值50. 5mg/L。NK106在PDA培養(yǎng)基中能夠穩(wěn)定生產(chǎn)ChA。實(shí)施例3、NK106菌株發(fā)酵液和提純ChA的殺線蟲活性發(fā)酵液實(shí)驗(yàn)設(shè)有100%、50%、25%、12. 5%真菌濾液(Filtrates)和PDA培養(yǎng)基(Medium,對照)5 個(gè)處理，ChA 實(shí)驗(yàn)設(shè)有 3 μ g/mL、30 μ g/mL、300 μ g/mL 和 10% 甲醇(MeOH,對照)4個(gè)處理。兩組處理均已無菌蒸餾水(SDW)作為空白對照。每個(gè)處理包括6次重復(fù)。以下實(shí)驗(yàn)方法(2)、(3)均使用這兩組處理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。I.實(shí)驗(yàn)方法(I)線蟲和卵的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所用的蟲卵，是從南方根結(jié)線蟲侵染的彩椒(Capsicum annuum L.)的根上得到的。將根上的土洗凈后放在1%的次氯酸鈉中用攪拌器攪拌使卵塊中的卵釋放出來，然后過200目和500目篩，500目的篩子上收集卵。二齡幼蟲J2則由卵孵化2-3天獲得。 (2)真菌發(fā)酵濾液和提純ChA對J2的影響用24孔板研究NK106發(fā)酵濾液和ChA對南方根結(jié)線蟲J2的致死率。將線蟲懸浮液(0. ImL中包括大約100條J2)放入含有不同濃度濾液和ChA的24孔板的小孔中，均以無菌水作為負(fù)對照。接種線蟲后，將24孔板放在25°C的培養(yǎng)箱中。為了研究真菌濾液對線蟲的致死率，將線蟲在內(nèi)生真菌濾液中處理24h、48h和72h后記錄線蟲的死亡數(shù)和總數(shù)，并計(jì)算校正死亡率。通過觀察NaOH刺激后線蟲的反應(yīng)來確定線蟲是否死亡。(3)真菌發(fā)酵濾液和提純ChA處理線蟲后對其侵染根部的影響試驗(yàn)在南開大學(xué)網(wǎng)室中進(jìn)行。熱處理的土(其中干土中包括0.74g K2SO4,
0.74gC0 (NH2)27O. 48g NH4H2PO4)與蛭石等體積混合后，放入直徑9cm的花盆中。苗盆中種植黃瓜，一周后移栽到花盆中。4天后，南方根結(jié)線蟲用不同濃度真菌發(fā)酵濾液和提純ChA處理4h后，接種到每個(gè)花盆中1000條，每天按需給植物澆水。接種9天后收獲植物，用淋浴噴頭緩慢沖洗根上的土后，置于50ml離心管中，在離心管中放上水淹沒植物根部并在_20°C的冰箱中放置24h。分離時(shí)，從冰箱中取出結(jié)冰的根，在室溫下溶化后將植物根部放在組織粉碎機(jī)中攪拌30s以釋放根組織內(nèi)的線蟲并給線蟲計(jì)數(shù)。(4)提純ChA對線蟲繁殖的影響用與(3)相同處理過的土壤種植黃瓜苗，一周后移栽到花盆中。4天后，在花盆中加入濃度為O. 3、3、30mg/kg 土的提純ChA。2天后將卵接種到土壤中，每個(gè)花盆1000個(gè)。自然生長35天后，收獲植物測量植物的株高和鮮重，然后在烘箱中105°C下O. 5h，然后在80°C下烘10h。根部卵的獲得方法，將收獲的根用剪刀剪成l_2cm的小段，然后放在濃度為1%的次氯酸鈉中，用A-88組織搗碎勻漿機(jī)攪拌12min后過篩(上邊的篩為200目，下邊的篩為500目)，用水噴頭將200目篩上的根沖洗干凈后收集起來測根的干重。卵則留在500目 篩上。將卵收集在50ml的離心管中，最后定容到40ml，然后用倒置顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(I) NK106菌株發(fā)酵液和提純ChA對J2的影響在對J2處理24h后，12. 5%濃度的發(fā)酵液仍然具有殺線蟲效果(圖3A)。100%濃度的發(fā)酵液處理72h時(shí)致死率達(dá)到最大值81. 3%。濃度為300 μ g/mL的ChA處理J248h后死亡率達(dá)到90. 2% (LC50=126. 5 μ g/ml)(圖3B)，并且?guī)缀跛芯€蟲在72h處理后均死亡。不同濃度處理的死亡率之間具有顯著性差異。(3) NK106菌株發(fā)酵液和提純ChA對線蟲侵染的影響與無菌水和沒有接種菌種的PDA培養(yǎng)基相比，C. globosum NK106發(fā)酵液能夠顯著性降低線蟲的侵染(圖4A)。發(fā)酵液和ChA對線蟲的侵染都表現(xiàn)出依賴濃度的規(guī)律。與負(fù)對照無菌水相比，ChA能夠顯著性抑制線蟲侵染黃瓜，抑制率分別為300 μ g/mL濃度時(shí)的59. 4%和30μ g/mL濃度時(shí)的31. 7%(圖4B)。與此結(jié)果相同，發(fā)酵液處理也都降低了線蟲的侵染數(shù)量。與無菌水相比，MeOH和PDA培養(yǎng)基對侵染都沒有影響。侵染是M. incognita生活史中關(guān)鍵階段之一，阻斷線蟲的侵染能力可以說明ChA的抗線蟲活性。(4) NK106菌株發(fā)酵液和提純ChA對線蟲繁殖和黃瓜苗生長的影響在處理35天后，30mg/kg的ChA顯著性降低線蟲卵的繁殖，與對照相比降低了63%，與此對應(yīng)，30mg/kg濃度處理時(shí)，植物生長量顯著提高，根部生物量提高3. 4倍，莖的生物量提高I. 9倍(表I)。結(jié)果表明ChA確實(shí)具有殺線蟲活性。表I不同濃度ChA對線蟲繁殖和黃瓜苗生長的影響
ChA濃度
根干重(g)莖干重(g)株高(cm)根部卵數(shù)量
(mg/kg)
O0.32 士 0.05c3.49±0.76b25.28士 2.53b530.5±50.24b
0.30.31 士 0.04c3.61 士 0.43b23·95 士 2.80b507.8士 62.13b
30.63±0.07b2.81±0.38b24.13±2.64b461.0±84.79b
301.09±0.13a6.54i0,60a39.73i4,09a194.0±46.31a本發(fā)明闡明了 C. globosumNK106的發(fā)酵培養(yǎng)液具有抗南方根結(jié)線蟲(Μ.incognita)的特性。對J2存活、侵染、繁殖等一系列的抑制效果證實(shí)此真菌產(chǎn)物ChA具有強(qiáng)烈的殺線蟲活性。據(jù)我們所知，這是首次發(fā)現(xiàn)ChA具有殺線蟲效果。這項(xiàng)研究確定了 ChA可以與其他植物病原線蟲管理技術(shù)結(jié)合用作一種線蟲防治劑。未來實(shí)際應(yīng)用還需要田間實(shí) 驗(yàn)和對其他植物病原線蟲的效果評(píng)價(jià)。同時(shí)，NK106是一株極具有應(yīng)用價(jià)值的真菌，特別是對南方根結(jié)線蟲的殺線蟲作用，顯示出其良好的應(yīng)用開發(fā)前景。
權(quán)利要求
1.一株具有殺線蟲活性的真菌菌株，子囊真菌球毛殼菌Chaetomium globosum NK106,菌種保藏號(hào)CGMCC6716,分類命名為Chaetomium globosum。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的菌株，其特征是該菌株生產(chǎn)具有殺線蟲作用的次生代謝物球毛殼菌素 chaetoglobosin A (ChA)。
3.一種殺線蟲制劑，其特征在于，包含有效量的權(quán)利要求I所述的真菌或權(quán)利要求2所述的真菌代謝物作為活性成分。
4.權(quán)利要求I所述的真菌或權(quán)利要求2所述的真菌代謝物或權(quán)利要求3所述的殺線蟲制劑在植物寄生線蟲生物防治中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物寄生線蟲為根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)。
全文摘要
一株具殺線蟲活力的球毛殼菌及其產(chǎn)生的代謝物和應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述球毛殼菌ChaetomiumglobosumNK106，保藏號(hào)為CGMCC6716。本發(fā)明包括所述菌株生產(chǎn)的球毛殼菌素chaetoglobosinA(ChA)防治植物寄生線蟲的應(yīng)用。ChA對南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)具有毒力高、殺線蟲效果明顯的突出特點(diǎn)。本發(fā)明測定了本菌株發(fā)酵液和提純ChA對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)的影響。不同稀釋濃度發(fā)酵液的處理和對照處理有顯著差異。發(fā)酵液和ChA對J2有致死效果，ChA濃度為300μg/mL時(shí)，致死率為90.2%。所有稀釋濃度的發(fā)酵液都抑制J2的侵染。黃瓜根部加入30mg/kgChA，寄生卵的數(shù)量降低了63%。這表明ChA具有殺線蟲活性，是具良好的應(yīng)用開發(fā)前景的生物殺線劑。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102925369SQ201210465068
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者朱旭東, 胡陽, 畢建男, 阮維斌 申請人:南開大學(xué)