專利名稱：一種篩選反硝化細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境生物領(lǐng)域，具體涉及一種從人工濕地中篩選出的具有高降解率的反硝化細(xì)菌的方法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來，池塘養(yǎng)殖是我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)的中流砥柱，池塘養(yǎng)魚產(chǎn)量占全國(guó)淡水水產(chǎn)品年總量的50%以上。但近幾年，池塘養(yǎng)殖在發(fā)展中也遇到了不少的問題，如殘餌、魚、蝦類排泄物、死亡藻類不斷增多，底部有機(jī)物不斷積淀，這些有機(jī)物在缺氧條件下，經(jīng)發(fā)酵、分解產(chǎn)生大量的氨氮、硫化氫及亞硝酸鹽等，當(dāng)水中的氮、磷等元素達(dá)到一定數(shù)值后，引發(fā)池塘水體富營(yíng)養(yǎng)化，從而會(huì)使池塘水質(zhì)發(fā)生變化，PH值下降，水體中有益菌自凈能力減弱，破壞水體微生物的平衡，嚴(yán)重影響魚、蝦類新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致其死亡。
我國(guó)池塘養(yǎng)殖水體環(huán)境的控制和修復(fù)的生態(tài)技術(shù)發(fā)展快速且多樣化，如水生植物修復(fù)技術(shù)，生態(tài)浮床系統(tǒng)、微生態(tài)技術(shù)等，但是，微生態(tài)技術(shù)因使用方便、成本低廉、效果顯著而被大家所采用。微生態(tài)技術(shù)是通過反硝化細(xì)菌的菌株的反硝化作用，還原水體中的亞硝酸鹽，使之生成無害的氮?dú)?，解除亞硝酸鹽的危害；消耗氮素營(yíng)養(yǎng)，抑制藻類過度繁殖，凈化水體。從人工濕地中篩選、分離出的反硝化細(xì)菌的菌株在池塘養(yǎng)殖的微生態(tài)系統(tǒng)中穩(wěn)定性較強(qiáng)，對(duì)養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝態(tài)氮的分解效果較好，投入成本低，同時(shí)也為養(yǎng)殖環(huán)境的生物修復(fù)奠定理論了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從人工濕地中篩選出一株具有高降解效率的反硝化細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行篩選和分離純化，然后應(yīng)用在池塘養(yǎng)殖中，達(dá)到降低亞硝酸鹽、凈化塘內(nèi)水體的效果。為了實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)效果，本發(fā)明是通過如下步驟包括本發(fā)明所用的初篩反硝化細(xì)菌的菌源來自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所池塘生態(tài)工程研究中心，室外人工垂直潛流濕地表層往下30厘米處取得的濾料與水的混合樣。該人工濕地主要用于凈化處理池塘養(yǎng)殖廢水并循環(huán)利用。一種篩選反硝化細(xì)菌的方法，其步驟包括(I)反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)將人工濕地中初篩得到的反硝化細(xì)菌菌源與培養(yǎng)基混合后搖床培養(yǎng)；再將搖床培養(yǎng)得到的菌懸液置于富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，得到反硝化細(xì)菌菌液；(2)反硝化細(xì)菌菌株的固體培養(yǎng)將步驟(I)中的反硝化細(xì)菌菌液接種于平板分離基上，然后將平板分離基置于25°C -30°C條件下劃線培養(yǎng)，直至菌落生長(zhǎng)良好；(3)挑取步驟(2)中得到的反硝化菌株的斜面菌種接種于活化培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，再用無菌生理鹽水離心洗滌并稀釋后冷藏備用。所述步驟(I)中，反硝化細(xì)菌菌源和培養(yǎng)基按照體積比為I : 10進(jìn)行混合后搖床培養(yǎng)7-10天，培養(yǎng)溫度為30°C，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為75轉(zhuǎn)/分鐘所述步驟⑴中，富集培養(yǎng)基的組成包括以下比例的原料檸檬酸鈉、MgSO4 · 7H20、K2HPO4 · 3H20、KNO3、KH2PO4及蒸餾水的用量比為5. Og O. 2g l.Og 2.0 I. Og lOOOmL，所述富集培養(yǎng)基的 pH 值為 7. 2 7. 5，121°C條件下滅菌15分鐘所述步驟(2)中，平板分離基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂，分離基的pH為7. 0-7. 2，121°C條件下滅菌15分鐘。所述步驟(3)中，搖床培養(yǎng)溫度為25°C -30°C，培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間為18_25小時(shí)，將離心洗滌后的菌株用無菌生理鹽水稀釋至OmL菌液并在0°C -4°C條件下保存。
所述反硝化細(xì)菌的鑒定方法，步驟包括(a)將步驟(3)中得到的備用反硝化細(xì)菌菌液按照10%的接種量，接種于養(yǎng)殖廢水中，28°C -32°C條件下?lián)u床培養(yǎng)24小時(shí)；(b)在搖床培養(yǎng)過程中，每隔2小時(shí)取樣I次,每次取樣量為10mL，并測(cè)定樣品中氨氮、亞硝態(tài)氮含量。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的反硝化菌株的是從人工濕地中初篩得到的，再經(jīng)過進(jìn)一步的培養(yǎng)、篩選，成為一株對(duì)于亞硝態(tài)氮降解能力極強(qiáng)的反硝化細(xì)菌菌株，然后按照10%的接種量接種于養(yǎng)殖廢水中，該廢水在菌液接種三小時(shí)后水中的亞硝態(tài)氮的含量降低了 75%以上，所以應(yīng)用在池塘養(yǎng)殖中能很好的起到凈化水體、抑制藻類過度繁殖的效果。所述反硝化細(xì)菌的菌株在池塘養(yǎng)殖的微生態(tài)系統(tǒng)中穩(wěn)定性較強(qiáng)，投入成本低。


圖I為本篩選方法得到的反硝化細(xì)菌的菌落圖。圖2為本篩選方法得到的反硝化細(xì)菌接種于養(yǎng)殖廢水中，亞硝態(tài)氮含量的變化。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明考慮到人工濕地濾料上的截留物中微生物種類豐富且和養(yǎng)殖水體和底質(zhì)環(huán)境相似，所以考慮將濾料截留的懸浮物作為功能菌篩選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將濾料上的原始微生物群落作為篩選對(duì)象，經(jīng)過連續(xù)的搖瓶培養(yǎng)和不斷轉(zhuǎn)接富集之后，篩選出適應(yīng)于高有機(jī)質(zhì)底質(zhì)和亞硝態(tài)氮濃度并具有高效降解效果的菌群。具體方法如下I、反硝化細(xì)菌的分離培養(yǎng)從人工濕地表層往下30厘米處取濾料與水的混合樣，此處為人工濕地的厭氧環(huán)境，有利于篩選出厭氧菌群。采樣點(diǎn)分布在人工濕地中部，采三個(gè)樣混合后4°C條件下冷藏。取冷藏的混合樣中的上層混合樣，將此混合樣分成兩部分，一份為篩選菌群，另一份為培養(yǎng)基，培養(yǎng)基放在高壓滅菌鍋內(nèi)高壓滅菌15分鐘，然后4°C條件冷藏備用。將未滅菌的泥水混合樣按10 : I與無菌水混合，制成菌源。將菌源和培養(yǎng)基按照體積比例為I : 10進(jìn)行混合后搖床培養(yǎng)7天，培養(yǎng)溫度為30°C，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為75轉(zhuǎn)/分鐘，然后再轉(zhuǎn)接三次后得到反硝化細(xì)菌的菌懸液。2、反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)將上述步驟中得到的反硝化細(xì)菌的菌懸液接種于富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2周。所用的富集培養(yǎng)基由5.(^檸檬酸鈉、0.281%504 · 7H20、1.0gK2HPO4 · 3Η20、2· Og ΚΝ03、1· Og KH2PO4及IOOOmL蒸餾水組成，所述富集培養(yǎng)基的pH值為7. 2 7. 5，121°C條件下滅菌15分鐘。3、反硝化細(xì)菌菌株的固體培養(yǎng)首先制作平板分離培養(yǎng)基，按照營(yíng)養(yǎng)瓊脂瓶上的配方，稱取32g營(yíng)養(yǎng)瓊脂置于IOOOmL的三角瓶中，并加入離子水?dāng)嚢枞芙?，在攪拌的同時(shí)用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基的pH值，用NaOH溶液和HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使pH值在7. 0-7. 2之間，并進(jìn)行滅菌處理。
然后倒平板趁熱將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒平板(無菌操作)，平放，待營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝固后備用。最后，將經(jīng)過富集培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌菌液作為培養(yǎng)對(duì)象劃線培養(yǎng)。吸取反硝化細(xì)菌菌液IOOuL置于已做好標(biāo)記的平板中，待菌懸液都吸取完以后，再用經(jīng)過滅菌的L型涂布棒涂抹菌液。平板全部涂抹好以后，置于工作臺(tái)中，待菌液蒸發(fā)稍干后，倒置平板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所用培養(yǎng)箱為生物培養(yǎng)室二氧化碳培養(yǎng)箱，設(shè)定溫度為30°C，2天后觀察記錄菌落的形態(tài)、顏色等菌落的生長(zhǎng)情況。再經(jīng)過多次平板分離與純化，得到相對(duì)優(yōu)勢(shì)的菌株。所得菌株的形態(tài)為乳白色、邊緣光滑、培養(yǎng)基中不透明、液體為透明。所得菌落形態(tài)圖如圖I所
/Jn ο4、挑取上述反硝化細(xì)菌菌株的斜面菌種接種于活化培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)18-20小時(shí)后，再用無菌生理鹽水離心洗滌3次、最后用生理鹽水稀釋成菌液，4°C冷藏備用。5、反硝化細(xì)菌的降解效果鑒定將制得的反硝化細(xì)菌菌液按照10%的接種量，接種于養(yǎng)殖廢水中，28°C _32°C條件下?lián)u床培養(yǎng)24小時(shí)。在搖床培養(yǎng)過程中，每隔2小時(shí)取樣I次，每次取樣量為10mL，并測(cè)定樣品中氨氮、亞硝態(tài)氮含量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，氨氮、亞硝態(tài)氮含量為縱坐標(biāo)作圖，具體結(jié)果如圖2所示。圖2中，對(duì)照組為不加反硝化細(xì)菌菌液的養(yǎng)殖廢水中的亞硝態(tài)氮含量值，實(shí)驗(yàn)組為加了本篩選方法得到的反硝化細(xì)菌菌液的養(yǎng)殖廢水中亞硝態(tài)氮值，通過兩組數(shù)值對(duì)比后，養(yǎng)殖廢水在菌液接種三小時(shí)后水中的亞硝態(tài)氮的含量降低了 75%以上，降解效果明顯，而且降解速度較快。
權(quán)利要求
1.一種篩選反硝化細(xì)菌的方法，其步驟包括 (1)反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)將人工濕地中初篩得到的反硝化細(xì)菌菌源與培養(yǎng)基混合后搖床培養(yǎng)；再將搖床培養(yǎng)得到的菌懸液置于富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，得到反硝化細(xì)菌菌液； (2)反硝化細(xì)菌的固體培養(yǎng)將步驟(I)中的反硝化細(xì)菌菌液接種于平板分離基上，然后將平板分離基置于25°C -30°C條件下培養(yǎng)，直至菌落生長(zhǎng)良好； (3)挑取步驟(2)中得到的反硝化菌株的斜面菌種接種于活化培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，再用無菌生理鹽水離心洗滌并稀釋后冷藏備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種篩選反硝化細(xì)菌的方法，其特征在于所述步驟(I)中，反硝化細(xì)菌菌源和培養(yǎng)基按照體積比為I : 10進(jìn)行混合后搖床培養(yǎng)7-10天，培養(yǎng)溫度為30°C，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為70 80轉(zhuǎn)/分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種篩選反硝化細(xì)菌的方法，其特征在于所述步驟(I)中，富集培養(yǎng)基的組成包括以下比例的原料檸檬酸鈉、MgSO4 · 7H20、K2HPO4 · 3H20、KNO3、KH2PO4及蒸餾水的用量比為5. Og O. 2g l.Og 2.0 l.Og lOOOmL，所述富集培養(yǎng)基的pH值為7. 2 7. 5，121°C條件下滅菌15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種篩選反硝化細(xì)菌的方法，其特征在于所述步驟(2)中，平板分離基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂，分離基的PH為7. 0-7. 2，121°C條件下滅菌15分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種篩選反硝化細(xì)菌的方法，其特征在于所述步驟(3)中，搖床培養(yǎng)溫度為25°C _30°C，培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間為18-25小時(shí)，將離心洗滌后的菌株用無菌生理鹽水稀釋并在0°C -4°C條件下保存。
6.一種如權(quán)利要求I所述的篩選反硝化細(xì)菌的方法，其特征在于所述反硝化細(xì)菌的鑒定方法包括以下步驟 (a)將步驟(3)中得到的備用反硝化細(xì)菌菌液按照10%的接種量，接種于養(yǎng)殖廢水中，28 0C -32 °C條件下?lián)u床培養(yǎng)24小時(shí)； (b)在搖床培養(yǎng)過程中，每隔2小時(shí)取樣I次，每次取樣量為10mL，并測(cè)定樣品中氨氮、亞硝態(tài)氮含量。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境生物領(lǐng)域，具體涉及一種從人工濕地中篩選具有高降解率的反硝化細(xì)菌的方法，首先將人工濕地中初篩得到的反硝化細(xì)菌菌源與培養(yǎng)基混合后搖床培養(yǎng)，再將搖床培養(yǎng)得到的菌液置于富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，得到反硝化細(xì)菌菌液；然后將反硝化細(xì)菌菌液接種于平板分離基上，然后將平板分離基置于25℃-30℃條件下培養(yǎng)，直至菌落生長(zhǎng)良好；最后上述挑取反硝化菌株的斜面菌種接種于活化培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，再用無菌生理鹽水離心洗滌、稀釋后冷藏備用。本發(fā)明篩選得到的反硝化細(xì)菌菌株，對(duì)于廢水中亞硝態(tài)的降解能力強(qiáng)，降解速度快。而且該菌株在池塘養(yǎng)殖的微生態(tài)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性較強(qiáng)，投入成本低。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102965313SQ201210466988
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月17日
發(fā)明者朱浩, 顧兆俊, 劉興國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所