專利名稱：玉麥法呢基焦磷酸合酶基因yfps及其分離克隆、定點突變及酶功能的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種參與小麥甲羥戊酸代謝途徑中類異戊二烯物質(zhì)合成的分支點的關(guān)鍵酶基因的分離克隆、基因定點突變、酶蛋白的原核表達(dá)、酶蛋白的分離純化及酶功能檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
類異戊二烯物質(zhì)是維持植物生長發(fā)育、光合作用、電子傳遞、應(yīng)對環(huán)境脅迫等所必需的重要物質(zhì)。該類物質(zhì)可作為光合色素(如葉綠素、類胡蘿卜素)、生長物質(zhì)和植物激素(如細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素和油菜素內(nèi)酯)、膜結(jié)構(gòu)的一部分如谷留醇、電子傳遞受體如質(zhì)體醌、作為葡萄糖基化反應(yīng)中葡萄糖的受體如多萜醇，并能調(diào)控細(xì)胞的生長(如異戊烯 基蛋白，細(xì)胞分裂素)。此外，很多植物類異戊二烯還具有重要的商業(yè)價值如橡膠、食物香料、飲料、維生素A、D、E以及天然殺蟲劑如除蟲菊素等。類異戊二烯物質(zhì)主要通過甲羥戊酸途徑中的一系列酶催化合成的，其中該代謝途徑中分支點的關(guān)鍵酶是法呢基焦磷酸合酶(FPS;EC2. 5.1. 1/EC2. 5.1. 10)，是控制整個代謝途徑的限速酶之一。該酶將一個分子的異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)通過I’-4順序進(jìn)行縮合，首先形成櫳牛兒基焦磷酸(GPP)，然后與另一分子異戊烯焦磷酸縮合形成一個多分支點的、特別重要的中間產(chǎn)物法呢基焦磷酸(FPP)。目前已分別從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghumbicolor)、橡膠(Heveabrasiliensis)等40種植物中分離克隆了法呢基焦磷酸合酶基因，在本發(fā)明申請之前，還沒有公開或發(fā)表過關(guān)于從小麥地方品種“玉麥”中分離克隆法呢基焦磷酸合酶基因、基因定點突變、基因原核表達(dá)、酶蛋白的分離純化及其酶功能體外檢測等研究資料信息。特別是對于野生型玉麥法呢基焦磷酸合酶基因進(jìn)行定點突變的研究，現(xiàn)在還是空白，無法應(yīng)用基因突變技術(shù)獲得更好的效果。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中在小麥法呢基焦磷酸合酶基因相關(guān)技術(shù)的缺失，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一整套關(guān)于小麥地方品種“玉麥”法呢基焦磷酸合酶基因克隆、基因定點突變、基因原核表達(dá)、高純度酶蛋白的分離純化及酶功能檢測技術(shù)。測得自小麥地方品種玉麥克隆獲得的野生型法呢基焦磷酸合酶對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的 Vmax 分別為 10. 0±0. 6,31. 2±0. 8 和 23. 3±0. 8mol/min/mg ；KM 值分別為 O. 80±0· 12,0. 71 ±0. 04 和 O. 76±0· 06 μ M ；Kcat 分別為 O. 23±0· 01、O. 72±0· 02 和 O. 54±0· 02S-1，Kcat/KM 分別為 2. 88x105、1. 01x106 和 7. 11x105M-1S_1，由此證明克隆的野生型玉麥法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物學(xué)功能。測得玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體H278L對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的 Vmax 分別為 16. 1±1· 4,46. 3±2· 8 和 41. 9±6· 3mol/min/mg ;KM 值分別為 2. 31±0· 35,1. 52±0· 19 和 2. 27±0· 62 μ M ；Kcat 分別為 O. 88±0· 08,2. 53±0· 15 和2. 29±0· 34S-1, Kcat/KM 分別為 3. 81x105、1. 66x106 和1. 01xl06M-lS_l ;測得玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體D295E對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的 Vmax 分別為 32. 6±2· 1,76. 3±0· 8 和 70. 9±9· 5mol/min/mg ;KM 值分別為 2. 14±0· 25,0. 46±0· 02 和 2. 15±0· 51 μ M ；Kcat 分別為 2. 55±0· 16,5. 97±0· 06 和5. 54±0· 74S-1, Kcat/KM 分別為1. 19x106、1. 30x107 和 2. 58xl06M_lS_l，表明通過對氨基酸密碼子的改變，能夠提高酶的催化活性，其中替換的谷氨酸(E )殘基對酶活性的提高較為顯著。本發(fā)明為進(jìn)一步進(jìn)行基因改造和修飾、構(gòu)建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化相應(yīng)作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業(yè)價值的植物，探討法呢基焦磷酸合酶基因在受體植物中的過量表達(dá)與次生代謝產(chǎn)物、作物籽粒大小及粒重等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)系，進(jìn)而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，以及對法呢基焦磷酸合酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)進(jìn)行剖析，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標(biāo)記提供重要技術(shù)儲備。
本發(fā)明提供的玉麥法呢基焦磷酸合酶基因YFPS的編碼區(qū)基因序列如Seq ID No:1所示，其編碼的氨基酸序列如Seq ID No:2所示。上述的玉麥中的法呢基焦磷酸合酶基因cDNA總長為1330bp，包括I個40bp的5’非編碼區(qū)，I個1065bp編碼區(qū)和I個225bp的3’非編碼區(qū)，在1308位核苷酸處有polyA尾巴，翻譯起始密碼子ATG自41位核苷酸開始，終止密碼子TAG位于1103位核苷酸處，編碼一條包含354aa的多肽，分子量約為42kDa，其基因序列及氨基酸序列如Seq ID No:3所示；本發(fā)明的發(fā)明人提供了該基因的具體分離克隆方法、基因定點突變及其原核表達(dá)及酶功能檢測的方法為1.玉麥葉片RNA的分離提取根據(jù)Trizol試劑盒的說明書進(jìn)行。獲得的RNA保存在DEPC水中備用。2.第一鏈cDNA的合成按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。3.基因中間序列擴(kuò)增、連接與轉(zhuǎn)化根據(jù)植物中FPS氨基酸序列的高度保守區(qū)設(shè)計基因中間序列擴(kuò)增引物，擴(kuò)增玉麥YFPS的相應(yīng)序列。上游引物為YRF: 5’ TCAACGCCACTTCAGAGGAAAACCG3’，其基因序列如SeqID No:4 所示；下游引物為YRR:5’ TCCCGCTCATACTTGTGAAATGCCGT3’，其基因序列如 Seq IDNo:5所示。根據(jù)一定條件進(jìn)行PCR，利用DNA膠回收試劑盒回收527bp特異條帶。將回收的DNA片段與pGEM-T Easy載體進(jìn)行連接。利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，制備質(zhì)粒DNA并進(jìn)行DNA測序，通過NCBI比對獲得目的基因片段。4.利用RACE技術(shù)快速獲得基因末端序列4.1基因末端序列快速擴(kuò)增利用上述獲得的527bp的基因中間序列，根據(jù)Clontech Laboratories INC的SMARTTmRACE cDNA Amplification kit的方法快速擴(kuò)增基因的5’和3’末端，篩選重組子，并測序。基因5’末端片段的擴(kuò)增，主要利用了試劑盒提供的引物UPM(Universal PrimerA Mix)為上游引物，以擴(kuò)增基因中間序列的下游引物5’ TCCCGCTCATACTTGTGAMTGCCGT3’，其基因序列如Seq ID No: 5所示的為下游引物；基因3’末端片段的擴(kuò)增，利用試劑盒提供的的引物UPM(Universal Primer A Mix)為下游引物，以擴(kuò)增基因中間序列的上游引物5’TCAACGCCACTTCAGAGGAAAACCG3’，其基因序列如Seq ID No:4所示的為上游引物，之所以采用這兩個序列，主要就是為了有利于序列的后期拼接。4. 2基因中間序列和RACE序列使用Contig Express 9.1拼接全長序列，然后對所得的contig序列進(jìn)行人工校對。5基因全長序列的擴(kuò)增
5.1基因全長引物的設(shè)計根據(jù)中間序列和RACE序列contig結(jié)果,設(shè)計全長擴(kuò)增引物。上游引物序列為YFPSF:5’CTTCTCGTCCCTTCTCGCTC3’，其基因序列如 Seq ID No:6所示；下游引物序列為￥ 51 :5’6六了六660^6六六六六六0六1"^63’，其基因序列如569 ID No:7所示。5. 2全長基因的PCR擴(kuò)增以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增全長目的基因，進(jìn)行全長基因PCR產(chǎn)物的膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、PCR重組子檢測、質(zhì)粒提取和測序，獲得全長序列為1330bp。6基因的原核表達(dá)6.1基因原核表達(dá)引物設(shè)計根據(jù)所得全長序列測序結(jié)果，利用DNAMAN軟件把所得的基因序列翻譯成氨基酸序列，然后同NCBI已知生物法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列進(jìn)行比對來確定玉麥法呢基焦磷酸合酶基因的0RF，設(shè)計連入pLMl表達(dá)載體的引物。在基因的5’端，設(shè)計帶有核糖體結(jié)合位點(AGGAGGA)、限制性內(nèi)切酶SalI酶切位點(GTCGAC)、起始密碼子、6個組氨酸密碼子以及法呢基焦磷酸合酶基因中7個氨基酸密碼子引物5’ CGCGCGTCGACAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCATCACCACCATCACGCGGCGGCGGCGGTGGCGTTGTC3’，其基因序列如 Seq ID No:8所示；在基因的3’端，設(shè)計具有限制性內(nèi)切酶Hind III酶切位點(AAGCTT)、終止密碼子(TAG)以及含有編碼 7 個氨基酸的引物5’ CTGCAGAAGCTTCTATTTCTGCCTCTTGTAGATCTTC3’，其基因序列如Seq ID No:9所不；。6. 2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建包括基因原核表達(dá)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切、酶切產(chǎn)物與載體的連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆重組子PCR鑒定、酶切鑒定、質(zhì)粒DNA提取、DNA測序驗證。7法呢基焦磷酸合酶基因密碼子的定點突變7.1密碼子突變引物的設(shè)計由于氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，玉麥法呢基焦磷酸合酶第278位H和第295位D與其它植物不同，為探討這些氨基酸殘基的功能，將其H突變?yōu)長，密碼子CAT突變?yōu)镃TT，突變體的引物為YH278LF:5’GTGCAAGCTCTTGAGCTTGCAGATGAGAGCC3’，其基因序列如Seq ID No: 10所示；YH278LR: 5’ GGCTCTCATCTGCMGCTCAAGAGCTTGCAC,，其基因序列如 Seq ID No: 11 所示；將D突變?yōu)镋，密碼子GAT突變?yōu)镚AG，突變體的引物為YD295EF: 5’ GGGAAGTCAGAGCCAGAGTCTGTTGC3’，其基因序列如 Seq ID No: 12所示，YD295ER: 5’GCAACAGACTCTGGCTCTGACTTCCC3’，其基因序列如Seq ID No: 13所不。7. 2突變體的PCR擴(kuò)增以構(gòu)建的玉麥法呢基焦磷酸合酶基因野生型表達(dá)載體質(zhì)粒為DNA模板，合適的退火溫度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。7. 3突變體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、測序用Dpnl限制性內(nèi)切酶去除模板質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，擴(kuò)增突變的質(zhì)粒，并提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序，以確定突變位點的有無。將陽性克隆轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株中，進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。8法呢基焦磷酸合酶基因表達(dá)
首先進(jìn)行法呢基焦磷酸合酶蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，包括IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化等。根據(jù)確定的優(yōu)化條件，進(jìn)行法呢基焦磷酸合酶蛋白的大量表達(dá)。9法呢基焦磷酸合酶蛋白的純化利用離子交換柱分離純化法呢基焦磷酸合酶蛋白。過柱純化的蛋白質(zhì)，裝于透析袋中在一定溶液中透析去鹽，純化的蛋白質(zhì)于_86°C保存?zhèn)溆谩?0采用分光光度計檢測法呢基焦磷酸合酶活性。測得玉麥法呢基焦磷酸合酶對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的 Vmax 分別為 10. 0±0. 6,31. 2±0. 8 和 23. 3±0. 8mol/min/mg ;KM值分別為 O. 80±0· 12,0. 71±0· 04和 O. 76±0· 06 μ M ;Kcat 分別為 O. 23±0· 01、
0.72±0· 02 和 O. 54±0· 02S-1，Kcat/KM 分別為 2. 88x105,1. 01x106 和 7. 11x105M-1S_1，由
此證明克隆的小麥法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物學(xué)功能。測得玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體H278L對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的Vmax分別為16.1 ±1. 4、46. 3±2. 8和 41. 9±6. 3mol/min/mg ;KM 值分別為 2. 31 ±0. 35、1. 52±0· 19 和 2. 27±0· 62 μ M ;Kcat 分別為 O. 88±0· 08,2. 53±0· 15 和 2. 29±0· 34S-1，Kcat/KM 分別為 3. 81x105、
1.66x106和1. 01xl06M-lS-l ;測得玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體D295E對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的Vmax分別為32. 6±2· 1,76. 3±0· 8 和 70. 9±9· 5mol/min/mg ;KM 值分別為 2. 14±0· 25,0. 46±0· 02 和
2.15±0· 51 μ M ；Kcat 分別為 2. 55±0· 16,5. 97±0· 06 和 5. 54±0· 74S-1，Kcat/KM 分別為1.19x106、1. 30x107和2. 58xl06M-lS_l，表明通過對氨基酸殘基密碼子的改變，能夠提高酶的催化活性，其中替換的谷氨酸(E)殘基對酶活性的提高較為顯著。本發(fā)明為進(jìn)一步進(jìn)行基因改造和修飾、構(gòu)建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化相應(yīng)作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業(yè)價值的植物，探討法呢基焦磷酸合酶基因在受體植物中的過量表達(dá)與次生代謝產(chǎn)物、作物籽粒大小及粒重等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)系，進(jìn)而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，以及對法呢基焦磷酸合酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)進(jìn)行剖析，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標(biāo)記提供重要技術(shù)儲備，同時更是通過對克隆的基因進(jìn)行定點突變，從而對基因進(jìn)行有目的的進(jìn)行體外改造或修飾，探討個別重要氨基酸對酶活性的影響，在體外可以根據(jù)研究目的獲得酶催化活性高的基因或酶催化活性低的基因，對作物遺傳改良中按照研究目的獲得優(yōu)異目的基因具有重要意義。
圖1為玉麥葉片RNA電泳圖，圖中I 為 IKbDNA marker ;2_5 為玉麥 RNA ；
圖2為玉麥法呢基焦磷酸合酶基因中間序列PCR產(chǎn)物電泳圖譜，圖中I為Ikb DNA ladder，2_13為玉麥法呢基焦磷酸合酶基因中間序列PCR產(chǎn)物，長度為527bp ；圖3為玉麥法呢基焦磷酸合酶基因末端序列快速擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳圖，圖中1-3 是 5’ race PCR 產(chǎn)物，大小為 IOOlbp ；4 為 Ikb DNA ladder ;5_11 是3’ racePCR 產(chǎn)物，大小為 856bp ；圖4為玉麥法呢基焦磷酸合酶基因的全長cDNA電泳圖，圖中I 為 Ikb DNA ladder ;2_6 為全長 cDNA，長度為 1330bp ；圖5為含有玉麥法呢基焦磷酸合酶基因ORF的pLMl質(zhì)粒酶切電泳圖， 圖中I為Ikb DNA ladder ；2為對含有目的基因的陽性克隆的質(zhì)粒DNA ；3為利用Sal I和Hind III雙酶切后，獲得1106bp的目的片段和pLMl質(zhì)粒；圖6為純化的玉麥法呢基焦磷酸合酶野生型及突變型蛋白SDS-PAGE電泳圖，圖中1-2為野生型；3為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；4為突變體L278H ;5為突變體E295D。
具體實施例方式實施例1 (小麥葉片RNA提取)(I)用蛭石于恒溫培養(yǎng)箱(28°C)培養(yǎng)玉麥長至三葉期。(2)液氮中將葉片研磨至粉末狀，移到DEPC處理的EP管中。(3)加入適量 RNAiso Plus。(4)室溫下靜置5min。(5)加入1/5 RNAiso Plus體積的氯仿。振蕩至乳白狀。(6)室溫下靜置5min。(7) 12000g，4°C 離心 15min。(8)上清移到新的DEPC處理的EP管中，加入與上清等體積的異丙醇，混勻。室溫下靜置lOmin。(9) 12000g，4°C離心 lOmin。(10)向沉淀中加入ImL用DEPC水配制的75%乙醇。12000g 4°C離心5min。(11)保留沉淀，通風(fēng)櫥中干燥至無色。(12)加入40 μ L DEPC水溶解。半小時后分裝并電泳檢測。取O. 5 μ L和O. 8 μ LRNA樣品，1. 0%瓊脂糖非變性凝膠電泳，電壓140V，電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照紀(jì)錄，結(jié)果如圖1所示。實施例2 (cDNA第一條鏈的合成)按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行。(I)在microtube管中配制下列混合液
01igo dT primer (50 μ m)Iul
dNTP Mixture (IOmM each)Iui
Total RNA<5 μ g
RNase free dH20up to 10 μ I(2)在PCR儀上進(jìn)行下列條件的變性、退火反應(yīng)65度5分鐘——冰上急冷。
(3)在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。
上述變性、退火后反應(yīng)液10 μ I
5XPrimerscript TM BF4 μ I
RNase inhibitor (40U/ul)0.5 μ I
Priraescript TM RTase (200U/ul)I μ I
RNase FreedH204.5 μ I
(4)在PCR儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42°C，60min ；70°C,15min ;4°C冷卻。實施例3(中間序列擴(kuò)增)I中間序列的弓丨物設(shè)計用Primer5. O引物設(shè)計軟件和DNAMAN軟件，根據(jù)植物中FPS的氨基酸序列的高度保守區(qū)設(shè)計引物。上游引物為YRF:5’ TCAACGCCACTTCAGAGGAAAACCG3’，其基因序列如SeqID 吣:4所示；下游引物為￥1^:5’1^0^(11^了4(11^了6444了601^3’ 其基因序列如 Seq IDNo:5所示。PCR 體系為cDNA 2ul,buffer1. 5 μ L、Taq 酶 O. 3 μ L、dNTP 0. 7μ L.YRF 0· 6 μ L、YRR O. 6 μ L、10%DMS0, ddH20 9.8 μ L。PCR 程序為94°C 3min、94°C 45s、62°C 45s,72°C lmin、72°C 6min, 32cycles。2中間序列的PCR結(jié)果檢測取8 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與I μ L溴酚藍(lán)混勻，點入1. 5%瓊脂糖凝膠中，在120V電壓下電泳45min，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。如圖2所示PCR得到一 527bp的DNA片段，結(jié)果如圖2所示。3擴(kuò)增片段的回收PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)瓊脂糖凝膠(TaKaRa Agarose,1. 5%濃度)電泳，在紫外燈(波長302nm)下觀察，割取目的DNA條帶。以DNA膠回收試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNAPurification KitVer2. O,大連寶生物產(chǎn)品)回收特異條帶。(I)在紫外燈下用干凈、無菌手術(shù)刀片切除含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體，此時應(yīng)注意盡量切除不含有目的DNA部分的凝膠。(2)向膠塊中加入膠塊融化液DR-1 Buffer。(3)混勻后75°C加熱融化膠塊，此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化(約6 lOmin)。(4)加入DR-1 Buffer 1/2體積量的DR-1I Buffer,吹吸混勻，當(dāng)分離400bp左右的DNA片段時，在上述溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。(5)將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(6)將上述操作的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm,離心lmin,棄濾液。將濾液再加入Spin Column中，離心一次，可以提高DNA回收率。(7)加入 500 μ L Rinse A, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(8)加入 700 μ L Rinse B, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(9)重復(fù) 8—次。(10)將Spin Column安置于新的1. 5mL離心管上,在Spin Column膜中央處加入25 μ L 60°C預(yù)熱的滅菌蒸懼水或Elution Buffer,室溫靜置lmin。
(11) 12000rpm 離心 lmin，洗脫 DNA，_20°C保存 DNA 備用。4回收產(chǎn)物的電泳檢測取5 μ L回收的中間序列PCR產(chǎn)物，用1. 5 %瓊脂糖凝膠中電泳檢測回收效率。5PCR產(chǎn)物的連接根據(jù)回收片段的濃度確定產(chǎn)物和pGEM-T Easy Vector之間的比例。連接步驟如下(I)加入 DNA 3. 75 μ L，T 載體 0.25 μ L，輕輕混勻。(2) 45°C水浴5min，立即轉(zhuǎn)入冰上5min。(3)再加入 T4DNA連接酶 O. 5μ L和 2x Rapid Ligation BufferO. 5 μ L 混勻，于PCR儀上16°C連接16h以上。6轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)(I)將5μ L連接液加入含50 μ L感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，吹吸混勻，冰上放置30mino(2) 42°C水浴熱激90s，立即冰浴2min。(3)加入950 μ L LB液體培養(yǎng)基，置于37°C搖床，230rpm振蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性。(4) 3000rmp離心3min。于超凈工作臺中去900 μ L上清，留100 μ L。(5)取70 μ L菌液均勻地涂布于LB固體培養(yǎng)基上，剩余30 μ L涂布在另外一個LB 固體培養(yǎng)基上。37°C倒置培養(yǎng)12 16h，直至出現(xiàn)菌落。7陽性重組子鑒定用滅菌槍頭挑取單個白斑菌落于4mL含有100 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，230rpm，37°C過夜振蕩培養(yǎng)。以菌液為模板，用PCR方法對含有插入片段的克隆進(jìn)行篩選。菌液PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照以上方法。取2. 5 μ L PCR反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。8質(zhì)粒DNA提取(I)取1500 μ L菌液加入Eppendorf管中，12000rpm,離心lmin,棄上清,浙干殘液。(2)加250μ solution I，置于潤旋振蕩器上振蕩，充分懸浮菌體。(3)加250yL solution II,輕輕顛倒混勻4-6次,室溫下lmin。整個過程不要超過 5min。(4)加 350yL solution III,輕輕混勻，室溫下放置 5min。(5) 12000rmp,離心 lOmin。(6)取上清液,移入柱中。8000rmp離心2mi η。(7)去廢液，加入 500 μ L washing solutions, IOOOOrmp, Imin0(8)重復(fù)(7)。(9)去廢液,柱子于IOOOOrmp離心2min。(10)柱子室溫下放置IOmin。(11)將柱子套到新的Eppendorf管中，加入50μ L Elution Buffer。室溫下放置2min, IOOOOrmp 離心 2min。(Elution Buffer 預(yù)熱到 60°C效果最好)(12)_20°C 保存?zhèn)溆谩?br>
9質(zhì)粒DNA濃度檢測和測序取2. 5 μ L質(zhì)粒于1. 0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測濃度。取陽性質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。10DNA序列分析通過DNAMAN和NCBI比對分析，獲得玉麥法呢基焦磷酸合酶基因的部分序列。實施例4 (通過RACE技術(shù)快速獲得末端序列)RACE是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知一段cDNA片段，通過向兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的5’端和3’端的方法。 IRACE 引物5’RACE的上游引物試劑盒提供的引物UPM(Universal Primer A Mix),5’ RACE 的下游引物5’ TCCCGCTCATACTTGTGAAATGCCGT3’，其基因序列如 Seq IDNo:5所示；3’ RACE 上游引物5’ TCAACGCCACTTCAGAGGAAAACCG3’，其基因序列如 Seq ID No:4所示，3’RACE 下游引物試劑盒提供的引物 UPM (Universal Primer A Mix)。2第一鏈cDNA合成(I)①對于 5，-RACE-Ready cDNA
RNA2 μ L
S7-CDS primer A I μ SMART II A oligo I μ LDEPC waterI μ L②對于3' -RACE-Ready cDNARNA2μ L3’—CDS primer A IuLDEPC water2 μ L(2)微離心。(3)在 PCR 儀上進(jìn)行 70°C，2min。(4)冰上放置2min，微離心。(5)向上管中分別加入
5X First-Strand Buffer 2 μ LDTT ( 2OmM)I μ
dNTP ( I OmM)I μ L
MMLV Reverse Transcriptase I μL
10 μ L(6)渦旋并離心。(7)在 PCR 儀上進(jìn)行 42°C，1.5h(8)分別加入 100 μ L 的 Tricine-EDTA Buffer0(9) 72°C，7min。
(10)_20°C保存 3 個月。3RACE快速擴(kuò)增末端序列(I)準(zhǔn)備 Master Mix
PCR-Grade water34.5 μ L
IOx Advantage 2 PCR Buffer 5 μ L dNTP (IOmM)I μ
50x Advantage 2 Polymerase mix I μL (2)渦旋，微離心。(3)①對于 5’-RACE
5,-RACE-Ready cDNA 2. 5 μ L
UPM(Universal Primer A Mix)、 μ L
5,-RACE 引物I μ L
Master Mix34. 5 μ L②對于3’-RACE
V-RACE-Ready cDNA 2.5 μ L
UPM (Universal Primer A Mix)5 μL
3,-RACE 引物I μ L
Master Mix34. 5 μ L(4)混勻，離心。(5) PCR 程序5’-RACE PCR 程序94 °C lmin,94 °C 35s,60 °C 35s,72 °C 2min，35 個循環(huán)，72°C 8min。擴(kuò)增出一約IOOlbp的DNA片段。3’-RACE PCR 程序94 V 3min、94 V 30s,66 V 30s,72 V 3min，30 個循環(huán)，72°C 6min。擴(kuò)增出一約856bp的DNA片段。所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并照相，結(jié)果如圖3所示。所述的緩沖液等物質(zhì)，及具體操作步驟均按照Clontech Laboratories INC的SMARTTmRACE cDNA Amplification kit 的方法操作。4RACE PCR產(chǎn)物純化、連接、轉(zhuǎn)化步驟RACE PCR產(chǎn)物純化方法PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)瓊脂糖凝膠(TaKaRa Agarose,1. 5%濃度)電泳，在紫外燈(波長302nm)下觀察，割取目的DNA條帶。以DNA膠回收試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNAPurification KitVer2. O,大連寶生物產(chǎn)品)回收特異條帶。(I)在紫外燈下用干凈、無菌手術(shù)刀片切除含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體，此時應(yīng)注意盡量切除不含有目的DNA部分的凝膠。(2)向膠塊中加入膠塊融化液DR-1 Buffer。(3)混勻后75°C加熱融化膠塊，此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化(約6 lOmin)。(4)加入DR-1 Buffer 1/2體積量的DR-1I Buffer,吹吸混勻，當(dāng)分離400bp左右的DNA片段時，在上述溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。(5)將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(6)將上述操作的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm,離心lmin,棄濾液。將濾液再加入Spin Column中，離心一次，可以提高DNA回收率。(7)加入 500 μ L Rinse A, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(8)加入 700 μ L Rinse B, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(9)重復(fù) 8—次。(10)將Spin Column安置于新的1. 5mL離心管上,在Spin Column膜中央處加入 25 μ L 60°C預(yù)熱的滅菌蒸懼水或Elution Buffer,室溫靜置lmin。(11) 12000rpm 離心 lmin，洗脫 DNA，_20°C保存 DNA 備用。連接方法根據(jù)回收片段的濃度確定產(chǎn)物和pGEM-T Easy Vector之間的比例。連接步驟如下(I)加入 DNA 3. 75 μ L，T 載體 0. 25 μ L，輕輕混勻。(2) 45°C水浴5min，立即轉(zhuǎn)入冰上5min。(3)再加入 T4DNA連接酶 O. 5μ L和 2x Rapid Ligation BufferO. 5 μ L 混勻，于PCR儀上16°C連接16h以上。轉(zhuǎn)化方法(I)將5μ L連接液加入含50 μ L感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，吹吸混勻，冰上放置30mino(2) 42°C水浴熱激90s，立即冰浴2min。(3)加入950 μ L LB液體培養(yǎng)基，置于37°C搖床，230rpm振蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性。(4) 3000rmp離心3min。于超凈工作臺中去900 μ L上清，留100 μ L。(5)取70 μ L菌液均勻地涂布于LB固體培養(yǎng)基上，剩余30 μ L涂布在另外一個LB固體培養(yǎng)基上。37°C倒置培養(yǎng)12 16h，直至出現(xiàn)菌落。5RACE PCR產(chǎn)物重組子的篩選篩選方法一用5’ -RACE引物和3’ -RACE引物對白斑的菌液進(jìn)行菌液PCR。篩選方法二用T7和SP6引物進(jìn)行菌液PCR。程序為94 °C 3min、94 °C 45s、64°C 45s,72°C 2min, 35cycles, 72°C IOmin06中間序列和RACE序列使用Contig Express 9.1拼接全長序列打開contig Express9.1 軟件，輸入〃Project---Add Fragments---From ABI
file..."。在〃 Import Sequence From 〃對話框中選擇測序公司發(fā)給的ABI文件，點擊"Assemble---Assemble Selected Fragments"。然后對所得的 contig序列進(jìn)行人工校對。實施例5 (法呢基焦磷酸合酶基因全長序列的擴(kuò)增)I引物的設(shè)計根據(jù)中間序列和RACE序列contig結(jié)果，設(shè)計全長引物。上游引物序列為YFPSF:5’CTTCTCGTCCCTTCTCGCTC3’，其基因序列如 Seq ID No:6所示；下游引物序列為YFPSR:5’GATAGGCTAGAAAAACATTAG3’，其基因序列如Seq ID No:7所/Jn ο2全長基因的PCR擴(kuò)增以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增全長玉麥法呢基焦磷酸合酶基因YFPS，其PCR體系為water9. 3 μ L、IOx PCR buffer1. 5 μ L、dNTP O. 7 μ L、YFPSF O. 6 μ L、YFPSR O. 6 μ L、LATagO. 3 μ L、DMSO 2 μ L。PCR 程序為94°C 5min、94°C 45s、63°C 45s,72°C 2min、72°C lOmin，35cycles。
3全長基因PCR產(chǎn)物的膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR重組子檢測、質(zhì)粒提取和測序全長基因PCR產(chǎn)物純化方法PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)瓊脂糖凝膠(TaKaRa Agarose,1. 5%濃度)電泳，在紫外燈(波長302nm)下觀察，割取目的DNA條帶。以DNA膠回收試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNAPurification KitVer2. O,大連寶生物產(chǎn)品)回收特異條帶。(I)在紫外燈下用干凈、無菌手術(shù)刀片切除含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體，此時應(yīng)注意盡量切除不含有目的DNA部分的凝膠。(2)向膠塊中加入膠塊融化液DR-1 Buffer。(3)混勻后75°C加熱融化膠塊，此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化(約6lOmin)。(4)加入DR-1 Buffer 1/2體積量的DR-1I Buffer,吹吸混勻，當(dāng)分離400bp左右的DNA片段時，在上述溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。(5)將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(6)將上述操作的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm,離心lmin,棄濾液。將濾液再加入Spin Column中，離心一次，可以提高DNA回收率。(7)加入 500 μ L Rinse A, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(8)加入 700 μ L Rinse B, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。(9)重復(fù)(8)—次。(10)將Spin Column安置于新的1. 5mL離心管上,在Spin Column膜中央處加入25 μ L 60°C預(yù)熱的滅菌蒸懼水或Elution Buffer,室溫靜置lmin。(11) 12000rpm 離心 lmin，洗脫 DNA，_20°C保存 DNA 備用。連接方法連接步驟如下(I)加入 DNA 3. 75 μ L，T 載體 0. 25 μ L，輕輕混勻。(2) 45°C水浴5min，立即轉(zhuǎn)入冰上5min。(3)再加入 T4DNA連接酶 0. 5μ L和 2x Rapid Ligation BufferO. 5 μ L 混勻，于PCR儀上16°C連接16h以上。轉(zhuǎn)化方法(I)將5μ L連接液加入含50 μ L感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，吹吸混勻，冰上放置30mino(2) 42°C水浴熱激90s，立即冰浴2min。(3)加入950 μ L LB液體培養(yǎng)基，置于37°C搖床，230rpm振蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性。
(4) 3000rmp離心3min。于超凈工作臺中去900 μ L上清，留100 μ L。(5)取70 μ L菌液均勻地涂布于LB固體培養(yǎng)基上，剩余30 μ L涂布在另外一個LB固體培養(yǎng)基上。37°C倒置培養(yǎng)12 16h，直至出現(xiàn)菌落。 菌液PCR重組子檢測用滅菌槍頭挑取單個白斑菌落于4mL含有100 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，230rpm，37°C過夜振蕩培養(yǎng)。以菌液為模板，用PCR方法對含有插入片段的克隆進(jìn)行篩選。菌液PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照以上方法。取2. 5 μ L PCR反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。質(zhì)粒提取
(I)取1500 μ L菌液加入Eppendorf管中，12000rpm,離心lmin,棄上清,浙干殘液。(2)加250μ solution I，置于潤旋振蕩器上振蕩，充分懸浮菌體。(3)加250 μ L solution II,輕輕顛倒混勻4-6次,室溫下lmin。整個過程不要超過 5min。(4)加 350yL solution III,輕輕混勻，室溫下放置 5min。(5) 12000rmp,離心 lOmin。(6)取上清液,移入柱中。8000rmp離心2min。(7)去廢液，加入 500 μ L washing solutions, IOOOOrmp, Imin0(8)重復(fù)(7)。(9)去廢液，柱子于IOOOOrmp離心2min。(10)柱子室溫下放置IOmin。(11)將柱子套到新的Eppendorf管中，加入50μ L Elution Buffer。室溫下放置2min, IOOOOrmp 離心 2min。(Elution Buffer 預(yù)熱到 60°C效果最好)(12)-20°C 保存?zhèn)溆谩y序取2. 5 μ L質(zhì)粒于1. 0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測濃度。取陽性質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。實施例6 (法呢基焦磷酸合酶基因的原核表達(dá))I玉麥法呢基焦磷酸合酶基因原核表達(dá)引物設(shè)計根據(jù)所得全長序列測序結(jié)果，利用DNAMAN軟件把所得的基因序列翻譯成氨基酸序列，然后同NCBI已知生物法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列進(jìn)行比對來確定玉麥法呢基焦磷酸合酶基因的0RF，設(shè)計連入pLMl表達(dá)載體的引物。在基因的5’端，設(shè)計帶有核糖體結(jié)合位點(AGGAGGA)、限制性內(nèi)切酶SalI酶切位點(GTCGAC)、起始密碼子、6個組氨酸密碼子以及法呢基焦磷酸合酶基因中7個氨基酸密碼子引物5’ CGCGCGTCGACAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCATCACCACCATCACGCGGCGGCGGCGGTGGCGTTGTC3’，其基因序列如 Seq ID No:8所示；在基因的3’端，設(shè)計具有限制性內(nèi)切酶Hind III酶切位點(AAGCTT)、終止密碼子(TAG)以及含有編碼 7 個氨基酸的引物5’ CTGCAGAAGCTTCTATTTCTGCCTCTTGTAGATCTTC3’，其基因序列如Seq ID No:9所不。2玉麥法呢基焦磷酸合酶基因原核表達(dá)序列的PCR擴(kuò)增以法呢基焦磷酸合酶全長基因并且不含有突變堿基的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其 PCR 體系為water 9. 3 μ LUOx GC-PCR I buffer1. 5 μ L、dNTP O. 7 μ L,Pl O. 6 μ L、Ρ20. 6 μ L、LA-Tag O.3 μ L0PCR 程序為94°C 5min、94°C 45s、64°C 45s,72°C 2min、72°C lOmin，35cycles。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。3法呢基焦磷酸合酶基因原核表達(dá)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切利用fermentas公司的Sal I和Hind III限制性內(nèi)切酶,對純化的PCR和pLM I分別進(jìn)行酶切，然后膠回收酶切產(chǎn)物。方案如下(I)向O. 5mL離心管中依次加入
(2) 37°C 3h，然后80°C 30min滅活酶。同時用1. 2%的膠電泳檢測酶切結(jié)果。(3)對酶切正確的片段進(jìn)行膠回收。4酶切產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化根據(jù)回收片段濃度，確定目的片段和pLM I酶切片段之間的連接比例，兩者混勻后加入適量NEB公司的T4DNA Ligase和2x Ligation Buffer。潤旋混勻，離心。在PCR儀上16°C連接16h以上。連接完成以后，轉(zhuǎn)化E. coil DH5a菌株。涂布在只含amp抗生素的LB固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)16h。5陽性克隆重組子PCR、酶切鑒定及質(zhì)粒提取挑取培養(yǎng)基上的白斑，用LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。然后做菌液PCR。對正確的陽性質(zhì)粒送上海生工測序，以確保沒有在PCR等操作過程中引入突變。6法呢基焦磷酸合酶蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化( I) IPTG濃度的優(yōu)化I)從含有重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株新鮮菌液中分別取出30 μ L接種至含IOmL的LB液體培養(yǎng)基(其中含100 μ g/mL氨芐青霉素)的試管中。2)37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至菌液0D600值約為O. 8時，加入IPTG至終濃度分別為O. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. Bmmol /I,η3) 37°C誘導(dǎo) 8h。5000r/min 10_15min 離心收集菌體。4)用等體積的去離子滅菌水沖洗菌體。5000r/min 10_15min離心收集菌體。5)用 ImL start Buffer (20mM 憐酸鉀，ΡΗ7· 4，O. 5M NaCl)重懸菌體。6)加入 5mg lysozyme, 37°C I 小時。7) _80°C放置大于I小時。8)30°C 水浴解凍。9)超聲破碎細(xì)胞10s，間隔30s。(130瓦)共lmin。10)收集裂解物，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、染色、脫色、觀察并分析電泳結(jié)果。(2)誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化
I)從含有重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株新鮮菌液中分別取出30 μ L接種至含IOmL的LB液體培養(yǎng)基(其中含100 μ g/mL氨芐青霉素)的試管中。2)371、200印111振蕩培養(yǎng)至菌液00600值約為O. 8時，加入IPTG至終濃度為O. 5mmol/L,于37°C下130rpm誘導(dǎo)表達(dá)8h,或于室溫條件下(約15°C )130rpm過夜表達(dá)。收集菌體并進(jìn)行超聲波破碎處理，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、染色、脫色、觀察并分析電泳結(jié)果，結(jié)果如圖6所示。7法呢基焦磷酸合酶蛋白的大量表達(dá)(I)將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)。(2)于IOmL LB培養(yǎng)基(Amp濃度為100mg/L)中培養(yǎng)過夜。(3)取5mL過夜培養(yǎng)的含有目的基因質(zhì)粒的BL21 (DE3)菌液加到500mL LB培養(yǎng) (Amp濃度為100mg/L)。37°C搖床培養(yǎng)約2. 5h，至0D600=0. 8時，加入IPTG(終濃度為O. 5mM)(2. 5mL100mM IPTG 或 59. 5mg)。(4)室溫條件下130rmp搖床培養(yǎng)過夜。(5) 5000r/min 10_15min離心收集菌體。用等體積的去離子滅菌水沖洗菌體。5000r/minl0-15min離心收集菌體。8蛋白的純化(I)用 40mL start Buffer (20mM 憐酸鉀，ΡΗ7· 4，O. 5M NaCl)重懸菌體。(2)加入 5mg lysozyme, 37°C I 小時。(3) _80°C放置大于I小時。(4)30°C水浴解凍。(5)超聲破碎細(xì)胞10s，間隔30s。(130瓦)。(6) 7000r離心15min,收集上清液,用于蛋白純化。(7) H1-Trap柱與0. 45 μ m的過濾器、注射器連接好，取5mL滅菌水緩慢注入柱中去除柱中的乙醇。(8)再取3mL 0.1M硫酸鎳注入柱中，用5mL去離子水洗掉沒有結(jié)合的鎳離子，然后用 5mL start Buffer 平衡。(9)取10_20mL上清注入柱中(10)用 5mL start Buffer 洗柱。(11) 5mL wash Buffer (20mM 憐酸鉀，PH7. 4，0. 5M NaCl, 50mM imidazole 咪唑)洗柱。(12)用 5mL elution Buffer (20mM 憐酸鉀，PH7. 4，0. 5M NaCl, 500mM imidazole)溶解蛋白，用1. 5mL離心管收集，每管收集lmL。9純化蛋白的透析去鹽將過柱純化的蛋白質(zhì)移于透析袋中，在含有5%甘油、5mM β-巰基乙醇、20mMTris-HCl緩沖液(PH7. 5)的磁力攪拌器中4°C透析20小時，中間換透析液3次。純化的蛋白質(zhì)于-86°C冰箱中保存?zhèn)溆?。實施? (玉麥法呢基焦磷酸合酶基因密碼子的定點突變)I密碼子突變引物的設(shè)計由于氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，玉麥法呢基焦磷酸合酶第278位H和第295位D與其它植物不同，為探討這些氨基酸殘基的功能，將其H突變?yōu)長，密碼子CAT突變?yōu)镃TT，突變體的引物為YH278LF:5’GTGCAAGCTCTTGAGCTTGCAGATGAGAGCC3’，其基因序列如Seq ID No: 10所示；YH278LR:5’GGCTCTCATCTGCAAGCTCAAGAGCTTGCAC，，其基因序列如Seq ID No: 11 所示；將D突變?yōu)镋，密碼子GAT突變?yōu)镚AG，突變體的引物為YD295EF: 5’ GGGAAGTCAGAGCCAGAGTCTGTTGC3’，其基因序列如 Seq ID No: 12所示，YD295ER: 5’GCAACAGACTCTGGCTCTGACTTCCC3’，其基因序列如Seq ID No: 13所不。2突變體的PCR擴(kuò)增體系以構(gòu)建的玉麥法呢基焦磷酸合酶基因野生型表達(dá)載體質(zhì)粒為DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系如下。在O. 5ml PCR管中，依次加入下列試劑，模板DNA約O.1 μ g, 10倍pfu DNApoIymerasebuffer 5 μ I, IOmM dNTP mixture I μ I, 100 μ M 正向引物 I μ 1，100 μ M 反向引物 I μ 1，2· 5U/μ I pfu DNA polymerasel μ I,加滅菌 MiliQ 水至終體積 50 μ I。 其中，當(dāng)擴(kuò)增對象為玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體H278L時，正向引物為YH278LF，反向引物為 YH278LR ；當(dāng)擴(kuò)增對象為玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體D295E時，正向引物為YD295EF，反向引物為YD295ER ；3突變體PCR擴(kuò)增程序及PCR產(chǎn)物處理PCR擴(kuò)增程序為95°C變性30S，退火lmin，72°C延伸13min (按Ikb DNA在72°C延伸2min)，共13個循環(huán)。PCR結(jié)束，將PCR管放置冰上使溫度降至37°C以下，并向PCR混合物中加1μ I限制性內(nèi)切酶DpnIdOU/μ 1)，于37°C過夜，以去除模板DNA;其中當(dāng)擴(kuò)增對象為玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體H278L時，退火溫度為62°C ；當(dāng)擴(kuò)增對象為玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體D295E時，退火溫度為64°C ；4突變體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化向DpnI降解的DNA混合物中加等體積的氯仿，渦旋混勻，離心去除蛋白質(zhì)。將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的Eppendorf離心管中，加1/3體積的IOM NH4Ac和8/3體積的無水乙醇，混勻，4°C，13，OOOrpm離心lOmin。去除上清液，加適量70%乙醇，在相同離心速度下離心5min ;去除上清液，將離心管在超凈工作臺上放置15min，以去除殘留的乙醇，然后加20 μ ITE或無菌水溶解突變的DNA。5突變體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將10 μ I DNA與80 μ I HBlOl感受態(tài)細(xì)胞混合，并轉(zhuǎn)移到一預(yù)冷的電擊杯中，冰上放置5min后，使用1. 25kV或2. 5kV電壓進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化完畢，立即向電擊杯中加O. 5ml室溫的SOC培養(yǎng)液，混勻，并轉(zhuǎn)移到一新Eppendorf離心管中，于37°C搖床中，200rpm培養(yǎng)40min后，8000rpm離心30S，留50-100 μ I上清液懸浮沉淀細(xì)胞，然后涂布在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，37 °C倒置過夜培養(yǎng)。6突變體質(zhì)粒DNA提取、測序挑取3-5個在LB平板培養(yǎng)基上生長的菌落，接種在LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)6個小時，擴(kuò)增突變的質(zhì)粒。提取質(zhì)粒DNA，并測序，選取產(chǎn)生突變的菌落。7突變體原核表達(dá)、蛋白質(zhì)純化、酶活性測定將陽性克隆轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株中，進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，純化及酶活性測定和酶動力學(xué)測定，具體方法同實施例6和實施例8。實施例8 (玉麥法呢基焦磷酸合酶活性測定)玉麥法呢基焦磷酸合酶的活性、動力學(xué)參數(shù)的測定，利用焦磷酸酶將酶促反應(yīng)產(chǎn)生的焦磷酸轉(zhuǎn)化成單磷酸并與鑰酸鹽反應(yīng)形成無色Keggin型磷酸鑰酸鹽復(fù)合物(PmoVI 120403-)，被β -巰基乙醇還原形成在830nm具有吸收峰的藍(lán)色復(fù)合物(PMoV4MoVI80407-),可用分光光度計檢測，具體實驗如下。I在96孔平板酶標(biāo)儀的每個孔里依次加入下列試劑，使反應(yīng)體系的總體積為100 μ L。77. 5 μ I Η20,50mM Tris, 5 μ L (IM) 2mM MgC12, 5 μ L (40mM)5mg/ml BSA, 5 μ L (lOOmg/ml)ImM DTT, 5 μ L (20mM)0. 5 μ L IPP (200mg/200mL)0. 5 μ L DMAPP (200mg/200mL)或 GPP0.1 μ g FPPS (可根據(jù)情況調(diào)整)混勻后放入酶標(biāo)儀中37°C反應(yīng)5min。2取出96孔板加入O. 5mL pyrophosphatase,放入酶標(biāo)儀中37°C反應(yīng)5min。3取出96孔板加入IOmL鑰酸銨，放入酶標(biāo)儀中37°C反應(yīng)5min。4取出96孔板加入IOmL β-巰基乙醇，5mL Eikonogen Reagent,放入酶標(biāo)儀中37°C 反應(yīng) 20min。5取出96孔板拿下蓋子,放入酶標(biāo)儀中讀830nm處吸光度。酶動力學(xué)參數(shù)的測定對IPP的KM值的測定，首先固定DMAPP的濃度為33. 6mM,測定IPP的5個不同濃度下的酶活力單位；對DMAPP的KM值的測定，首先固定IPP的濃度為33. 6mM,測定DMAPP的5個不同濃度下的酶活力單位；對GPP的KM值的測定，首先固定IPP的濃度為33. 6mM，測定GPP的5個不同濃度下的酶活力單位，然后根據(jù)米氏公式y(tǒng)=ax/(b+x)，利用SigmaPlotl2即可獲得KM值和Vmax值。最終測得野生型玉麥法呢基焦磷酸合酶對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的Vmax分別為10. 0±0. 6、31. 2±0. 8和23. 3±0· 8mo 1/min/mg ；KM 值分別為 O. 80±0· 12,0. 71±0· 04 和 O. 76±0· 06 μ M ；Kcat 分別為 O. 23±0· 01,0. 72±0· 02 和 O. 54±0· 02S-1，Kcat/KM 分別為 2. 88x105,1. 01x106 和7. 11x105M-1S-1,由此證明克隆的野生型玉麥法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物學(xué)功倉泛。測得玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體H278L對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的Vmax分別為16.1±1. 4、46. 3±2. 8和41. 9±6· 3mol/min/mg ;KM 值分別為 2. 31 ±0. 35、1. 52±0· 19 和 2. 27±0· 62 μ M ；Kcat 分別為 O. 88±0· 08,2. 53±0· 15 和 2. 29±0· 34S-1，Kcat/KM 分別為 3. 81x105、1. 66x106 和1.01xl06M-lS-l ；測得玉麥法呢基焦磷酸合酶突變體D295E對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的Vmax分別為32.6±2. 1、76. 3±0.8和70. 9±9· 5mol/min/mg ;KM 值分別為 2. 14±0· 25,0. 46±0· 02 和 2. 15±0· 51 μ M5Kcat 分別為 2. 55±0· 16,5. 97±0· 06 和 5. 54±0· 74S-1，Kcat/KM 分別為1. 19x106、1. 30x107 和
2.58xl06M-lS-l，表明通過對氨基酸殘基密碼子的改變，能夠提高酶的催化活性，其中替換的谷氨酸(E)殘基對酶活性的提高較為顯著。本發(fā)明為進(jìn)一步進(jìn)行基因改造和修飾、構(gòu)建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化相應(yīng)作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業(yè)價值的植物，探討法呢基焦 磷酸合酶基因在受體植物中的過量表達(dá)與次生代謝產(chǎn)物、作物籽粒大小及粒重等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)系，進(jìn)而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，以及對法呢基焦磷酸合酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)進(jìn)行剖析，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標(biāo)記提供重要技術(shù)儲備。
權(quán)利要求
1.玉麥法呢基焦磷酸合酶基因YFPS的編碼區(qū)基因序列如SeqID No:1所示，其編碼的氨基酸序列如Seq ID No:2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的玉麥法呢基焦磷酸合酶基因YFPS在構(gòu)建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化相應(yīng)作物上的應(yīng)用。
3.應(yīng)用權(quán)利要求1所述玉麥法呢基焦磷酸合酶基因進(jìn)行定點突變。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種參與小麥甲羥戊酸代謝途徑中類異戊二烯物質(zhì)合成的分支點的關(guān)鍵酶基因的分離克隆、基因定點突變、酶蛋白的原核表達(dá)、酶蛋白的分離純化及酶功能檢測技術(shù)。為進(jìn)一步進(jìn)行基因改造和修飾、構(gòu)建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化相應(yīng)作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業(yè)價值的植物，探討法呢基焦磷酸合酶基因在受體植物中的過量表達(dá)與次生代謝產(chǎn)物、作物籽粒大小及粒重等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)系，進(jìn)而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，以及對法呢基焦磷酸合酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)進(jìn)行剖析，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標(biāo)記提供重要技術(shù)儲備。
文檔編號C12Q1/48GK102994527SQ201210468550
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者楚秀生, 李永波, 李玉蓮, 樊慶琦, 黃承彥, 隋新霞, 郭棟, 高潔, 李根英 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所