專利名稱：一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于菌種培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法。
背景技術(shù)：
金花菌是茯磚茶發(fā)花 過程中自然形成的一種具有益生性能的優(yōu)勢菌，學(xué)名為冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。獲磚茶是一種主銷邊疆地區(qū)的古老茶品，具有生津止渴、消滯減肥等益生功效，研究表明這與金花菌的存在是密不可分的。自然發(fā)酵的茯磚茶中易生長曲霉、青霉等多種雜菌，影響了金花菌的正常生長，從而降低了茯磚茶的品質(zhì)，且發(fā)酵周期較長。若能人工培養(yǎng)獲得金花菌的孢子粉，用以接種發(fā)酵茯磚茶，不僅可以縮短發(fā)酵周期，而且降低雜菌的污染，從而提高茯磚茶的品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，以獲得人工培養(yǎng)金花菌的孢子粉，用以接種發(fā)酵茯磚茶，不僅可以縮短發(fā)酵周期，而且降低雜菌的污染。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，包括以下步驟I)將金花菌接種至種子培養(yǎng)基斜面，26 30°C培養(yǎng)5d，得到種子培養(yǎng)物；2)向種子培養(yǎng)物加入無菌水，洗下金花菌孢子，充分振蕩后，得到均勻分散的孢子懸液；3)將麩皮與水以IOOg:80 IOOmL的比例充分混合后作為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)容器中鋪平，厚度為O. 8 I. 5cm,濕熱滅菌；滅菌后，以5 15%的體積比接種孢子懸液，充分搖勻，在26 30°C恒溫培養(yǎng)，接種后培養(yǎng)容器的出口用紗布封蓋，待白色菌絲開始萌發(fā)時在紗布上加蓋無菌透氣封口膜，在白色菌絲萌發(fā)結(jié)束黃色菌絲開始萌發(fā)時去掉無菌透氣封口膜，培養(yǎng)6 8d后得到曲種；4)將麩皮與水以100g:80 IOOmL的比例充分混合后作為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)容器中鋪平，厚度為2. O 3. Ocm,濕熱滅菌；滅菌后，以5 10%的質(zhì)量比接種曲種,在26 30°C恒溫培養(yǎng)，接種后O 36h內(nèi)培養(yǎng)容器的出口用紗布封蓋，并在白色菌絲萌發(fā)結(jié)束黃色菌絲剛剛萌發(fā)時去掉無菌透氣封口膜，繼續(xù)培養(yǎng)3 4d后停止培養(yǎng)，得到麩曲；5)將麩曲粉碎后過篩，得到金花菌孢子粉。所述的金花菌是自茯磚茶中分離純化得到，其分離純化方法為取茯磚茶茶葉10g，加入90mL無菌水，IlOr mirT1震蕩IOmin得到菌懸液，并進(jìn)行梯度稀釋，將梯度濃度的菌懸液分別涂布到CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)；取適宜稀釋濃度的菌落，進(jìn)行劃線分離，28°C培養(yǎng)5d后挑取單菌落，再次劃線分離，直至挑取單菌落后鏡檢無雜菌，得到金花菌的純菌種，轉(zhuǎn)接至斜面于4°C保存。所述的步驟I)中所用的種子培養(yǎng)基為CZG培養(yǎng)基(5%NaCl)。
所述的步驟2)中，向種子培養(yǎng)物加入無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以100 120r · mirT1振蕩5 15min,得到均勻分散的孢子懸液。所述的步驟3)中，所述的濕熱滅菌時，將麩皮與水充分混勻后分裝錐形瓶中，110 121°C滅菌20 30min ;滅菌結(jié)束后，立即振蕩搖散培養(yǎng)基。置于無菌操作臺中冷卻
至室溫。所述還繼續(xù)培養(yǎng)3 5d后金花菌的閉囊殼數(shù)量豐富，呈均勻金黃色。
所述步驟4)中當(dāng)白色菌絲萌發(fā)前加蓋無菌透氣封口膜，菌絲變黃前去掉，培養(yǎng)至金黃色停止培養(yǎng)。所述步驟5)中麩曲經(jīng)粉碎后過100目篩；或者麩曲粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫儲藏。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，以粗代精選用了麩皮培養(yǎng)基，不僅成本低、方法穩(wěn)定、易于操作，且獲得的孢子肥大而稠密；而且在白色菌絲萌發(fā)期間，通過加蓋無菌透氣封口膜，一方面控制通氣量，另一方面控制培養(yǎng)基的水分，保證了培養(yǎng)基表面的濕度適宜，避免了金花菌在白色菌絲萌發(fā)期間以無性孢子萌發(fā)，減少了雜菌污染，從而提高所需的有性孢子的質(zhì)量。所獲得的金花菌孢子粉中，其孢子含量為8 X IO8個/g。本發(fā)明提供的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，短時間即可獲得大量的金花菌孢子粉，所獲得的金花菌孢子粉可以用以微生物有效成分的提取，也可以直接用作人工發(fā)酵茯磚茶的菌種，大大縮短茯磚茶制作周期，減少雜菌的污染，從而提高茯磚茶品質(zhì)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明所述的金花菌可以采用現(xiàn)有各菌種保藏中心的保藏菌種，也可以自行分離純化。比如采用劃線法進(jìn)行分離純化取獲磚茶茶葉IOg,加入90ml無菌水，IlOr .mirT1震蕩IOmin得到菌懸液,并進(jìn)行梯度稀釋(至IO6倍)，將梯度濃度的菌懸液分別涂布到CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)；取適宜稀釋濃度的菌落，進(jìn)行劃線分離，28°C培養(yǎng)5d后挑取單菌落，再次劃線分離，直至挑取單菌落后鏡檢無雜菌，得到金花菌的純菌種，轉(zhuǎn)接至斜面于4°C保存。實施例I—種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，包括以下步驟步驟I)菌種活化取自茯磚茶中分離純化得到的金花菌接種至CZG(5%NaCl)斜面培養(yǎng)基(試管18X 180mm)，28°C培養(yǎng)(需氧)，培養(yǎng)至5d時菌落呈現(xiàn)金黃色，即得到種子培養(yǎng)物，備用。步驟2)制備孢子懸液將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)物加入30mL無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以lOOi^mirT1振蕩lOmin，得到均勻分散的孢子懸液，備用。步驟3)孢子培養(yǎng)取麩皮，以每IOOg加水80mL配制固體培養(yǎng)基，充分混勻后分裝250mL錐形瓶中，鋪平厚度為1.0 1.3(^，以八層紗布包好，1211滅菌301^11。滅菌結(jié)束后，立即振蕩搖散培養(yǎng)基。置于無菌操作臺中冷卻至室溫，接種步驟2)的孢子懸液lmL，并充分搖勻后于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待培養(yǎng)至第2d白色菌絲萌發(fā)，在錐形瓶的出口加蓋無菌透氣封口膜，白色菌絲逐漸長滿培養(yǎng)基并在培養(yǎng)第3d時去掉。繼續(xù)于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至7d，培養(yǎng)基呈現(xiàn)干燥緊致的餅狀，且金花菌的閉囊殼數(shù)量豐富，均勻金黃色，即得到曲種，備用。步驟4)擴(kuò)大培養(yǎng)按上述加水量潤料均勻后，取曲盤，攤平厚度為2. O 3. 0cm，八層紗布覆蓋，滅菌后冷卻至室溫，以10%的接種量接種至曲盤，培養(yǎng)4 5d。其中培養(yǎng)12h后加蓋無菌透氣封口膜，至培養(yǎng)36h后菌絲變黃前去掉,繼續(xù)于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至4 5d，停止培養(yǎng)。步驟5):孢子收集將上述麩曲經(jīng)粉碎后過100目篩，即得到 金花菌孢子粉；或者直接粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫長期儲藏。實施例2步驟I):菌種活化取自茯磚茶中分離純化得到的金花菌接種至CZG(5%NaCl)斜面培養(yǎng)基(試管15 X 150mm)，30°C培養(yǎng)，培養(yǎng)至5d時菌落呈現(xiàn)金黃色，即得到種子培養(yǎng)物，備用。步驟2):制備孢子懸液將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)物加入20mL無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以IlOr min—1振蕩lOmin，得到均勻分散的孢子懸液，備用。步驟3):孢子培養(yǎng)取麩皮，以每IOOg加水IOOmL配制固體培養(yǎng)基，充分混勻后分裝500mL錐形瓶中，鋪平厚度為O. 8 I. Ocm,以八層紗布包好，121°C滅菌30min。滅菌結(jié)束后，立即振蕩搖散培養(yǎng)基。置于無菌操作臺中冷卻至室溫，接種步驟2)的孢子懸液2mL，并充分振蕩搖勻后放置29°C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)第2d加蓋無菌透氣封口膜，并于培養(yǎng)第3d去掉。繼續(xù)在培養(yǎng)至7d，培養(yǎng)基呈現(xiàn)干燥緊致的餅狀，且金花菌的閉囊殼數(shù)量豐富，均勻金黃色，即得到曲種，備用。步驟4):擴(kuò)大培養(yǎng)按上述加水量潤料均勻后，取曲盤，攤平厚度為2. O 2. 5cm,八層紗布覆蓋，滅菌后冷卻至室溫，以5%的接種量接種至曲盤，培養(yǎng)4d。其中第14h加蓋無菌透氣封口膜，并繼續(xù)培養(yǎng)15 20h后菌絲變黃前去掉，培養(yǎng)至金黃色停止培養(yǎng)。步驟5):孢子收集將上述麩曲經(jīng)粉碎后過100目篩，即得到金花菌孢子粉；或者直接粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫長期儲藏。實施例3步驟I):菌種活化取自茯磚茶中分離純化得到的金花菌接種至CZG(5%NaCl)斜面培養(yǎng)基(試管20X200mm)，28°C培養(yǎng)，培養(yǎng)至5d時菌落呈現(xiàn)金黃色，即得到種子培養(yǎng)物，備用。步驟2):制備孢子懸液將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)物加入30mL無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以IlOr · min—1振蕩5min，得到均勻分散的孢子懸液，備用。步驟3):孢子培養(yǎng)取麩皮，以每IOOg加水80mL配制固體培養(yǎng)基，充分混勻后分裝500mL錐形瓶中，鋪平厚度為O. 8 I. Ocm,以八層紗布包好，121°C滅菌30min。滅菌結(jié)束后，立即振蕩搖散培養(yǎng)基。置于無菌操作臺中冷卻至室溫，接種步驟2)的孢子懸液2mL，并充分搖勻于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并培養(yǎng)第2d加蓋無菌透氣封口膜，菌絲逐漸變黃于第3d時去掉。繼續(xù)在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至6d，培養(yǎng)基呈現(xiàn)干燥緊致的餅狀，且金花菌的閉囊殼數(shù)量豐富，均勻金黃色，即得到曲種，備用。步驟4):擴(kuò)大培養(yǎng)按上述加水量潤料均勻后，取曲盤，攤平厚度為2. O 3. Ocm,八層紗布覆蓋，滅菌后冷卻至室溫，以10%的接種量接種至曲盤，培養(yǎng)4d。其中第12h加蓋無菌透氣封口膜，并繼續(xù)培養(yǎng)20 24h后菌絲變黃前去掉，培養(yǎng)至金黃色停止培養(yǎng)。步驟5):孢子收集將上述麩曲經(jīng)粉碎后過100目篩，即 得到金花菌孢子粉；或者直接粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫長期儲藏。
權(quán)利要求
1.一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將金花菌接種至種子培養(yǎng)基斜面，26 30°C培養(yǎng)5d，得到種子培養(yǎng)物； 2)向種子培養(yǎng)物加入無菌水，洗下金花菌孢子，充分振蕩后，得到均勻分散的孢子懸液； 3)將麩皮與水以100g:80 IOOmL的比例充分混合后作為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)容器中鋪平，厚度為O. 8 I. 5cm,濕熱滅菌； 滅菌后，以5 15%的體積比接種孢子懸液，充分搖勻，在26 30°C恒溫培養(yǎng)，接種后培養(yǎng)容器的出口用紗布封蓋，待白色菌絲開始萌發(fā)時在紗布上加蓋無菌透氣封口膜，在白色菌絲萌發(fā)結(jié)束黃色菌絲開始萌發(fā)時去掉無菌透氣封口膜，培養(yǎng)6 8d后得到曲種； 4)將麩皮與水以100g:80 IOOmL的比例充分混合后作為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)容器中鋪平，厚度為2. O 3. 0cm，濕熱滅菌； 滅菌后，以5 10%的質(zhì)量比接種曲種，在26 30°C恒溫培養(yǎng)，接種后O 36h內(nèi)培養(yǎng)容器的出口用紗布封蓋，并在紗布上加蓋無菌透氣封口膜，并在白色菌絲萌發(fā)結(jié)束黃色菌絲剛剛萌發(fā)時去掉無菌透氣封口膜，繼續(xù)培養(yǎng)3 4d后停止培養(yǎng)，得到麩曲； 5)將麩曲粉碎后過篩，得到金花菌孢子粉。
2.如權(quán)利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的金花菌是自茯磚茶中分離純化得到，其分離純化方法為取茯磚茶茶葉10g，加入90mL無菌水，IlOr · HiirT1震蕩IOmin得到菌懸液，并進(jìn)行梯度稀釋，將梯度濃度的菌懸液分別涂布到CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)；取適宜稀釋濃度的菌落，進(jìn)行劃線分離，28°C培養(yǎng)5d后挑取單菌落，再次劃線分離，直至挑取單菌落后鏡檢無雜菌，得到金花菌的純菌種，轉(zhuǎn)接至斜面于4°C保存。
3.如權(quán)利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的步驟I)中所用的種子培養(yǎng)基為CZG培養(yǎng)基(5%NaCl)。
4.如權(quán)利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的步驟2)中，向種子培養(yǎng)物加入無菌水，洗下金花菌孢子，無菌操作倒入裝有等體積玻璃珠的錐形瓶中，以100 120r · mirT1振蕩5 15min,得到均勻分散的孢子懸液。
5.如權(quán)利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的步驟3)中，所述的濕熱滅菌時，將麩皮與水充分混勻后分裝錐形瓶中，110 121°C滅菌20 30min;滅菌結(jié)束后，立即振蕩搖散培養(yǎng)基，置于無菌操作臺中冷卻至室溫。
6.如權(quán)利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述的步驟3)中，去掉無菌透氣封口膜后，繼續(xù)培養(yǎng)3 5d金花菌的閉囊殼數(shù)量豐富，呈均勻金黃色。
7.如權(quán)利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中當(dāng)白色菌絲萌發(fā)前加蓋無菌透氣封口膜，菌絲變黃前去掉，培養(yǎng)至金黃色停止培養(yǎng)。
8.如權(quán)利要求I所述的茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，其特征在于，所述步驟5)中麩曲經(jīng)粉碎后過100目篩；或者麩曲粉碎后置于密閉的無菌容器中，低溫儲藏。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茯磚茶金花菌孢子粉的制備方法，包括將金花菌接種至CZG斜面培養(yǎng)基，26～30℃培養(yǎng)5d，得到種子培養(yǎng)物；向種子培養(yǎng)物加入無菌水，洗下金花菌孢子，充分振蕩后，得到均勻分散的孢子懸液；在培養(yǎng)基上接種孢子懸液，在26～30℃恒溫培養(yǎng)，在白色菌絲萌發(fā)前加蓋無菌透氣封口膜，并在黃色菌絲萌發(fā)時去掉，繼續(xù)培養(yǎng)3～5d后得到曲種；然后再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)得到麩曲；將麩曲粉碎后過篩，得到金花菌孢子粉。本發(fā)明以獲得人工培養(yǎng)金花菌的孢子粉，既可以用于金花菌有效成分的提取，也可以用以接種發(fā)酵茯磚茶，不僅可以縮短發(fā)酵周期，而且降低雜菌的污染。
文檔編號C12N3/00GK102965328SQ20121047047
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者呂嘉櫪, 李玉婷 申請人:陜西科技大學(xué)