專利名稱：對(duì)多個(gè)混合dna或rna序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種對(duì)多個(gè)混合的DNA或RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法以及裝置。
背景技術(shù)：
在免疫細(xì)胞群中，T淋巴細(xì)胞受體分子(TCR，T cell rec印tor)和B淋巴細(xì)胞受體分子(BCR,B cell receptor)的多樣性是以十萬(wàn)到百萬(wàn)計(jì)。組成TCR或BCR的a和旦鏈，不僅各自結(jié)構(gòu)不同，各鏈的形成還經(jīng)歷了 V、J或V、J、D不同區(qū)域中眾多基因片段的組
八
口 o在研究TCR和BCR的多樣性時(shí)，需要對(duì)TCR和BCR的V、J或V、J、D不同區(qū)域中眾多基因片段進(jìn)行測(cè)序。一般來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有的測(cè)序技術(shù)可以適應(yīng)一般的基因測(cè)序的要求。但是，對(duì)于研究TCR和BCR的多樣性來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有的測(cè)序技術(shù)的錯(cuò)誤率太高，以至于無(wú)法根據(jù)得到的測(cè)序結(jié)果，辨別出來(lái)的眾多基因片段之間的細(xì)微區(qū)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)多個(gè)混合DNA或者RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法以及裝置，能夠利用現(xiàn)有的測(cè)序技術(shù)提高基因測(cè)序的準(zhǔn)確性，顯著減少基因測(cè)序的錯(cuò)誤率。
`
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明針對(duì)不同的起始模板，分別采用了兩種技術(shù)方案，對(duì)于以多個(gè)混合的DNA序列為模板進(jìn)行基因測(cè)序的，采用的一個(gè)技術(shù)方案是包括將M對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列和免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體TCR和/或B淋巴細(xì)胞受體BCR的N個(gè)DNA序列的溶液混合，并進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一 PCR產(chǎn)物，其中，所述M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，所述第一上游引物序列或第一下游引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及第一上游基礎(chǔ)引物序列或第一下游基礎(chǔ)引物序列，每對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列的標(biāo)簽序列使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，所述接頭序列是使每個(gè)DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列，所述第一上游基礎(chǔ)引物序列與第一下游基礎(chǔ)引物序列分別與所述DNA序列兩條單鏈的3’末端互補(bǔ)；對(duì)所述第一 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第一 DNA產(chǎn)物，所述第一 DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含所述第一上游引物序列與第一下游引物序列的互補(bǔ)序列，或包含所述第一上游引物序列的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列；將所述獲得的第一 DNA產(chǎn)物與第二上游引物序列和第二下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第二 PCR產(chǎn)物，其中，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的接頭序列；對(duì)所述第二 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第二 DNA產(chǎn)物；對(duì)所述第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果。其中，所述接頭序列包括測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列，所述測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列順序連接，所述測(cè)序引物序列連接所述第一上游引物序列或第一下游引物序列的標(biāo)簽序列，所述測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列用于區(qū)別來(lái)自不同樣本的多個(gè)DNA序列。其中，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列。其中，所述標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè),或者七個(gè),或者六個(gè)。其中，所述對(duì)第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果的步驟，包括對(duì)所述第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，獲得DNA測(cè)序結(jié)果；將所述DNA測(cè)序結(jié)果按照標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，獲得屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果；比較所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)所述所有的DNA測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次；判斷所述每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次是否達(dá)到預(yù)定的閾值；若達(dá)到預(yù)定的閾值，則確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所述位置的堿基，按照所述方法，即可確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的另一個(gè)技術(shù)方案是提供一種對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的裝置，所述裝置包括第一獲得模塊，用于將M對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列和免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體和/或B淋巴細(xì)胞受體的N個(gè)DNA序列的溶液混合，并進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一 PCR產(chǎn)物，其中，所述M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，所述第一上游引物序列或第一下游引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及第一上游基礎(chǔ)引物序列或第一下游基礎(chǔ)引物序列，每對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列的標(biāo)簽序列使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，所述接頭序列是使每個(gè)DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列，所述第一上游基礎(chǔ)引物序列與第一下游基礎(chǔ)引物序列分別與所述DNA序列兩條單鏈的3’末端互補(bǔ)；第二獲得模塊，用于對(duì)所述第一 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第一 DNA產(chǎn)物，所述第一 DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含所述第一上游引物序列與第一下游引物序列的互補(bǔ)序列，或包含所述第一上游引物序列的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列；第三獲得模塊，用于將所述獲得的第一 DNA產(chǎn)物與第二上游引物序列和第二下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第二 PCR產(chǎn)物，其中，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的接頭序列；第四獲得模塊，用于對(duì)所述第二 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第二DNA產(chǎn)物；測(cè)序結(jié)果獲得模塊，用于對(duì)所述第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果。其中，所述接頭序列包括測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列，所述測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列順序連接，所述測(cè)序引物序列連接所述第一上游引物序列或第一下游引物序列的標(biāo)簽序列，所述測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列用于區(qū)別來(lái)自不同樣本的多個(gè)DNA序列。其中，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列。

其中，所述標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)，或者七個(gè)，或者六個(gè)。其中，所述測(cè)序結(jié)果獲得模塊包括第一獲得單元，用于對(duì)所述第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，獲得DNA測(cè)序結(jié)果；第二獲得單元，用于將所述DNA測(cè)序結(jié)果按照標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，獲得屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果；統(tǒng)計(jì)單元，用于比較所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)所述所有的DNA測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次；判斷單元，用于判斷所述每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次是否達(dá)到預(yù)定的閾值；確定單元，用于在達(dá)到預(yù)定的閾值時(shí)，確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所述位置的堿基，直到確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。對(duì)于以多個(gè)混合RNA為模板，進(jìn)行測(cè)序的，本發(fā)明采用的另一個(gè)技術(shù)方案是提供一種對(duì)多個(gè)混合的RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法，包括將M個(gè)反轉(zhuǎn)錄引物序列與免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體TCR和/或B淋巴細(xì)胞受體BCR的N個(gè)RNA序列的溶液混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA序列的產(chǎn)物，其中，所述M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，所述反轉(zhuǎn)錄引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列，所述反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列與所述RNA序列的3’末端互補(bǔ)；將所述獲得的cDNA序列的產(chǎn)物與M個(gè)前端引物序列的溶液混合反應(yīng)后，再進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第三PCR產(chǎn)物，其中，所述前端引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及前端基礎(chǔ)引物序列，所述前端基礎(chǔ)引物序列與所述cDNA序列的3’末端互補(bǔ)；對(duì)所述第三PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第三DNA產(chǎn)物，所述第三DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含所述反轉(zhuǎn)錄引物序列與前端引物序列的互補(bǔ)序列，或包含所述反轉(zhuǎn)錄引物序列的互補(bǔ)序列與前端引物序列；將所述獲得的第三DNA產(chǎn)物與第三上游引物序列和第三下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第四PCR產(chǎn)物，其中，所述第三上游引物序列包含所述前端引物序列中的接頭序列，所述第三下游弓I物序列包含所述反轉(zhuǎn)錄弓I物序列中的接頭序列；對(duì)所述第四PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第四DNA產(chǎn)物；對(duì)所述第四DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果；其中，反轉(zhuǎn)錄引物序列與前端弓I物序列的標(biāo)簽序列使得每個(gè)第三DNA產(chǎn)物的DNA序列具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，所述接頭序列是使每個(gè)第三DNA產(chǎn)物的DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列。

其中，所述第三上游引物序列或第三下游引物序列包含測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司結(jié)合序列，所述第三上游引物序列的測(cè)序引物序列包含前端引物序列中的接頭序列，所述第三下游引物序列的測(cè)序弓I物序列包含反轉(zhuǎn)錄引物序列中的接頭序列。本發(fā)明的有益效果是區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明主要利用了一對(duì)第一上游弓I物序列與第一下游引物序列，這對(duì)引物序列除了包含基礎(chǔ)引物序列外，還包含接頭序列和標(biāo)簽序列，標(biāo)簽序列使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)以及測(cè)序后，即可獲得每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，通過(guò)分析每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，可以辨別每個(gè)DNA序列的每個(gè)位置的堿基是否是其它外部實(shí)驗(yàn)因素導(dǎo)致的基因突變，因而可以提高基因測(cè)序的準(zhǔn)確性，顯著減少基因測(cè)序的錯(cuò)誤率；另外由于給每個(gè)DNA都加上了一個(gè)標(biāo)簽序列，通過(guò)計(jì)算標(biāo)簽序列可以準(zhǔn)確測(cè)定每種DNA片段在起始DNA混合物中的拷貝數(shù)。


圖1是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法一實(shí)施方式的流程圖2是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法另一實(shí)施方式的流程圖；圖3是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法中兩次PCR反應(yīng)的原理示意圖；圖4是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法中兩次PCR反應(yīng)的另一原理示意圖；圖5是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的裝置一實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法一實(shí)施方式的流程圖；圖7是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法中反轉(zhuǎn)錄及兩次PCR反應(yīng)的原理不意圖；圖8是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法中反轉(zhuǎn)錄及兩次PCR反應(yīng)的另一原理不意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。參閱圖1，圖1是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法兩個(gè)實(shí)施方式的流程圖，包括步驟SlOl :將M對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列和免疫細(xì)胞群中TCR和/或BCR的N個(gè)DNA序列的溶液混合，并進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一 PCR產(chǎn)物，其中，M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，第一上游引物序列或第一下游引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及第一上游基礎(chǔ)引物序列或第一下游基礎(chǔ)引物序列，每對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列的標(biāo)簽序列使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，接頭序列是使每個(gè)DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列，第一上游基礎(chǔ)引物序列與第一下游基礎(chǔ)引物序列分別與DNA序列兩條單鏈的3’末端互補(bǔ)。第一上游引物序列的第一上游基礎(chǔ)引物序列與DNA序列一條單鏈的3’末端互補(bǔ)，第一下游引物序列的第一下游基礎(chǔ)引物序列與DNA序列另一條單鏈的3’末端互補(bǔ)，因此，第一上游基礎(chǔ)引物序列和第一下游基礎(chǔ)引物序列分別與DNA的兩條單鏈結(jié)合，以便于進(jìn)行PCR反應(yīng)。與第一上游基礎(chǔ)弓I物序列和第一下游基礎(chǔ)引物序列連接的標(biāo)簽序列是為了給每個(gè)DNA序列帶上唯一的標(biāo)記，該標(biāo)記使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列。與標(biāo)簽序列連接的接頭序列主要起兩個(gè)作用，一是為了使每個(gè)DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)，二是在后續(xù)的進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)時(shí)，第二次PCR的引物由于包含該接頭序列，因此，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物除了原來(lái)的DNA序列外，還包括標(biāo)簽序列。將M對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列和免疫細(xì)胞群中TCR和/或BCR的N個(gè)DNA序列的溶液混合，并進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一 PCR產(chǎn)物。其中，M大于或等于一百倍的N，是為了保證N個(gè)DNA序列的混合溶液中每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)后，獲得不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列。免疫細(xì)胞群中TCR的多樣性多達(dá)1016，BCR的多樣性多達(dá)1014，而實(shí)際中，免疫細(xì)胞群中TCR和BCR的基因的多樣性達(dá)105，只要標(biāo)簽序列的組合個(gè)數(shù)至少達(dá)到107，足以讓每個(gè)DNA序列獲得唯一的標(biāo)記。免疫細(xì)胞群中TCR和BCR的基因片段的大小在400bp左右。其中，標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)，或者七個(gè)，或者六個(gè)。例如，標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)時(shí)，可以獲得IO9個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合；標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是七個(gè)時(shí)，可以獲得IO8個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合；標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是六個(gè)時(shí)，可以獲得IO7個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合。其中，接頭序列包括測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列，測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列順序連接，測(cè)序引物序列連接第一上游引物序列或第一下游引物序列的標(biāo)簽序列，測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列用于區(qū)別來(lái)自不同樣本的多個(gè)DNA序列。為了在測(cè)序時(shí)更好的獲得測(cè)序儀的所能達(dá)到的最好的效果，采用測(cè)序公司提供的接頭序列是很好的選擇，一般包括測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列，測(cè)序引物序列對(duì)獲得較好的測(cè)序結(jié)果有幫助，測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列有助于區(qū)別來(lái)自不同樣本的多個(gè)DNA序列，即同一個(gè)樣本的多個(gè)DNA序列采用同一個(gè)測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列的接頭序列。步驟S102 :對(duì)第一 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第一 DNA產(chǎn)物，第一 DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含第一上游引物序列與第一下游引物序列的互補(bǔ)序列，或包含第一上游弓I物序列的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列。

第一 PCR產(chǎn)物是包含第一 DNA產(chǎn)物的不同大小片段的混合物，經(jīng)過(guò)分離純化后,獲得片段大小基本一致的第一 DNA產(chǎn)物的混合物，即每條單鏈的兩端均包含第一上游引物序列與第一下游引物序列的互補(bǔ)序列，或包含第一上游引物序列的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列。步驟S103 :將獲得的第一 DNA產(chǎn)物與第二上游引物序列和第二下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第二 PCR產(chǎn)物，其中，第二上游引物序列包含第一上游引物序列中的接頭序列，第二下游引物序列包含第一下游引物序列中的接頭序列。第一 DNA產(chǎn)物是在經(jīng)過(guò)兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)后得到的，數(shù)量和質(zhì)量都很少，無(wú)法滿足后續(xù)要求，因此，要得到大量的滿足要求的第一 DNA產(chǎn)物，需要進(jìn)行第二次的PCR反應(yīng)。
第二上游引物序列包含第一上游引物序列中的接頭序列，第二下游引物序列包含第一下游引物序列中的接頭序列，因此，通過(guò)二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，可以獲得大量的包含第一 DNA產(chǎn)物的DNA序列，即第二 PCR產(chǎn)物。其中，在步驟SlOl中，接頭序列包括測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列時(shí)，則第二上游引物序列包含第一上游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列，第二下游弓I物序列包含第一下游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列。步驟S104 :對(duì)第二 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第二 DNA產(chǎn)物。第二 PCR產(chǎn)物含有其它的不同大小片段的雜質(zhì)成分，經(jīng)過(guò)分離純化后，獲得片段大小基本一致的第二 DNA產(chǎn)物的混合物，該第二 DNA產(chǎn)物是大量的純化的包含第一 DNA產(chǎn)物的DNA序列。步驟S105 :對(duì)第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果。利用現(xiàn)有的測(cè)序技術(shù)，例如Illumina公司的測(cè)序儀，即可對(duì)第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果。步驟S105的具體過(guò)程,請(qǐng)參閱圖2,包括步驟S201 :對(duì)第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，獲得DNA測(cè)序結(jié)果。步驟S202 :將DNA測(cè)序結(jié)果按照標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，獲得屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果。因?yàn)槊總€(gè)DNA序列都有標(biāo)簽序列，標(biāo)簽序列相同的即為同一個(gè)DNA序列。在獲得所有DNA測(cè)序結(jié)果后，根據(jù)標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，即可獲得屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果。 步驟S203 比較屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)所有的DNA測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次。例如，同一個(gè)DNA序列，總共有10個(gè)DNA測(cè)序結(jié)果，第5個(gè)位置有7個(gè)測(cè)序結(jié)果是A，兩個(gè)測(cè)序結(jié)果是G，一個(gè)測(cè)序結(jié)果是T，則第5個(gè)位置出現(xiàn)A的頻次是0. 7，出現(xiàn)G的頻次是0.2，出現(xiàn)T的頻次是0.1。步驟S204 :判斷每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次是否達(dá)到預(yù)定的閾值。

步驟S205 :若達(dá)到預(yù)定的閾值，則確定屬于同一個(gè)DNA序列的所述位置的堿基，按照方法，即可確定屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。如果設(shè)定的每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次的預(yù)定的閾值是0. 67，根據(jù)上述例子，第5個(gè)位置出現(xiàn)A的頻次是0. 7，因此第5個(gè)位置的堿基確定是A。依此類推，可以確定屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。參閱圖3，圖3是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法中兩次PCR反應(yīng)的原理示意圖，如圖所示，第一上游引物序列21包含接頭序列213、標(biāo)簽序列212以及第一上游基礎(chǔ)引物序列211，第一下游引物序列22包含接頭序列223、標(biāo)簽序列222以及第一下游基礎(chǔ)引物序列221。該原理包括步驟S301 :第一上游引物序列21與第一下游引物序列22和DNA序列11的溶液混合，進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一 DNA產(chǎn)物41。第一 DNA產(chǎn)物41的每條單鏈的兩端均包含第一上游引物序列21與第一下游引物序列22的互補(bǔ)序列，或包含第一上游引物序列21的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列22。步驟S302 :將第一 DNA產(chǎn)物41與第二上游引物序列31和第二下游引物序列32的溶液混合，進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第二 DNA產(chǎn)物42。第二上游引物序列31包含第一上游引物序列21中的接頭序列213，第二下游引物序列32包含第一下游引物序列22中的接頭序列223。參閱圖4，圖4是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法中兩次PCR反應(yīng)的另一原理示意圖，如圖所示，第一上游引物序列61包含接頭序列613、標(biāo)簽序列612以及第一上游基礎(chǔ)引物序列611，接頭序列613包括測(cè)序引物序列6131、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列6132以及測(cè)序公司接頭序列6133 ;第一下游引物序列62包含接頭序列623、標(biāo)簽序列622以及第一下游基礎(chǔ)引物序列621，接頭序列623包括測(cè)序引物序列6231、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列6232以及測(cè)序公司接頭序列6233。該原理包括步驟S401 :第一上游引物序列61與第一下游引物序列62和DNA序列51的溶液混合，進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一 DNA產(chǎn)物81。第一 DNA產(chǎn)物81的每條單鏈的兩端均包含第一上游引物序列61與第一下游引物序列62的互補(bǔ)序列，或包含第一上游引物序列61的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列62。步驟S402 :將第一 DNA產(chǎn)物81與第二上游引物序列71和第二下游引物序列72的溶液混合，進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第二 DNA產(chǎn)物82。第二上游引物序列71包含第一上游引物序列61中的接頭序列613中的測(cè)序公司接頭序列6133，第二下游引物序列72包含第一下游引物序列62中的接頭序列623中的測(cè)序公司接頭序列6233。本發(fā)明主要利用了一對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列，這對(duì)引物序列除了包含基礎(chǔ)引物序列外，還包含接頭序列和標(biāo)簽序列，標(biāo)簽序列使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)以及測(cè)序后，即可獲得每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，通過(guò)分析每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，可以辨別每個(gè)DNA序列的每個(gè)位置的堿基是否是其它外部實(shí)驗(yàn)因素導(dǎo)致的基因突變，因而可以提高基因測(cè)序的準(zhǔn)確性，顯著減少基因測(cè)序的錯(cuò)誤率；另外通過(guò)計(jì)算標(biāo)簽序列可以準(zhǔn)確測(cè)定每個(gè)DNA片段的拷貝數(shù)。參閱圖5，圖5是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的裝置一實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)示意圖，該裝置包括第一獲`得模塊101、第二獲得模塊102、第三獲得模塊103、第四獲得模塊104以及測(cè)序結(jié)果獲得模塊105。第一獲得模塊101用于將M對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列和免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體和/或B淋巴細(xì)胞受體的N個(gè)DNA序列的溶液混合，并進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一 PCR產(chǎn)物，其中，M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，第一上游引物序列或第一下游引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及第一上游基礎(chǔ)引物序列或第一下游基礎(chǔ)引物序列，每對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列的標(biāo)簽序列使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，接頭序列是使每個(gè)DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列，第一上游基礎(chǔ)引物序列與第一下游基礎(chǔ)引物序列分別與DNA序列兩條單鏈的3’末端互補(bǔ)。其中，接頭序列包括測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列，測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列順序連接，測(cè)序引物序列連接第一上游引物序列或第一下游引物序列的標(biāo)簽序列，測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列用于區(qū)別來(lái)自不同樣本的多個(gè)DNA序列。其中，標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)，或者七個(gè)，或者六個(gè)。第二獲得模塊102用于對(duì)第一 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第一 DNA產(chǎn)物，第一DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含第一上游引物序列與第一下游引物序列的互補(bǔ)序列，或包含第一上游引物序列的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列。
第三獲得模塊103用于將獲得的第一 DNA產(chǎn)物與第二上游引物序列和第二下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第二 PCR產(chǎn)物，其中，第二上游引物序列包含第一上游引物序列中的接頭序列，第二下游引物序列包含第一下游引物序列中的接頭序列。其中，第二上游引物序列包含第一上游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列，第二下游引物序列包含第一下游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列。第四獲得模塊104用于對(duì)第二 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第二 DNA產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果獲得模塊105用于對(duì)第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果。其中，測(cè)序結(jié)果獲得模塊包括第一獲得單元、第二獲得單元、統(tǒng)計(jì)單元、判斷單元以及確定單元。第一獲得單元用于對(duì)第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，獲得DNA測(cè)序結(jié)果；第二獲得單元用于將DNA測(cè)序結(jié)果按照標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，獲得屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果； 統(tǒng)計(jì)單元用于比較屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)所有的DNA測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置出現(xiàn)相 同堿基的頻次；判斷單元用于判斷每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次是否達(dá)到預(yù)定的閾值；確定單元用于在達(dá)到預(yù)定的閾值時(shí)，確定屬于同一個(gè)DNA序列的位置的堿基，直到確定屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。本發(fā)明主要利用了一對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列，這對(duì)引物序列除了包含基礎(chǔ)引物序列外，還包含接頭序列和標(biāo)簽序列，標(biāo)簽序列使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)以及測(cè)序后，即可獲得每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，通過(guò)分析每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，可以辨別每個(gè)DNA序列的每個(gè)位置的堿基是否是其它外部實(shí)驗(yàn)因素導(dǎo)致的基因突變，因而可以提高基因測(cè)序的準(zhǔn)確性，顯著減少基因測(cè)序的錯(cuò)誤率；另外通過(guò)計(jì)算標(biāo)簽序列可以準(zhǔn)確測(cè)定每個(gè)DNA片段的拷貝數(shù)。參閱圖6，圖6是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法一實(shí)施方式的流程圖。如果在實(shí)際應(yīng)用中，獲得的免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體TCR和/或B淋巴細(xì)胞受體BCR的模板序列是RNA序列，依然可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程以及專門(mén)設(shè)計(jì)的引物序列獲得最終的測(cè)序結(jié)果。本實(shí)施方法即為針對(duì)模板序列是RNA序列的情況，該方法包括步驟S501 :將M個(gè)反轉(zhuǎn)錄引物序列與免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體TCR和/或B淋巴細(xì)胞受體BCR的N個(gè)RNA序列的溶液混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA序列的產(chǎn)物，其中，M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，反轉(zhuǎn)錄引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列，反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列與RNA序列的3’末端互補(bǔ)。cDNA序列是與RNA序列互補(bǔ)的單鏈DNA序列。本步驟S501是反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，在反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，反轉(zhuǎn)錄酶也是不可缺少的。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄引物序列的標(biāo)簽序列連接在cDNA序列上。M大于或等于一百倍的N，是為了保證反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的每條單鏈cDNA序列可以獲得唯一的區(qū)別于其它反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cDNA序列的標(biāo)簽序列。反轉(zhuǎn)錄引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列，反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列與RNA序列的3’末端互補(bǔ)，因而反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列與RNA序列的3’末端結(jié)合后，發(fā)生反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。接頭序列主要起兩個(gè)作用一是為了使每個(gè)DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)，二是在后續(xù)的進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)時(shí)，第二次PCR的引物由于包含該接頭序列，因此，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物除了原來(lái)的DNA序列外，還包括標(biāo)簽序列。步驟S502 :將獲得的cDNA序列的產(chǎn)物與M個(gè)前端引物序列的溶液混合反應(yīng)后，再進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第三PCR產(chǎn)物，其中，前端引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及前端基礎(chǔ)弓I物序列，前端基礎(chǔ)弓I物序列與cDNA序列的3’末端互補(bǔ)。步驟S501獲得的cDNA序列是單鏈DNA序列，在步驟S502中加入前端引物序列，前端引物序列的前端基礎(chǔ)引物序列與cDNA序列的3’末端互補(bǔ)，在前端引物序列和相關(guān)酶的作用下，合成一條與cDNA序列互補(bǔ)的兩端分別包含前端引物序列和反轉(zhuǎn)錄引物序列互補(bǔ)的單鏈DNA序列。然后，在反轉(zhuǎn)錄弓I物序列和前端引物序列為引物的情況下，通過(guò)一個(gè)循環(huán)的PCR，從而可以獲得完整的且兩端分別包含反轉(zhuǎn)錄引物序列互補(bǔ)的序列和前端引物序列，或包含反轉(zhuǎn)錄引物序列和前端引物序列互補(bǔ)的序列的DNA雙鏈。其中，標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)，或者七個(gè)，或者六個(gè)。例如，標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)時(shí)，可以獲得IO9個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合；標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是七個(gè)時(shí)，可以獲得IO8個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合；標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是六個(gè)時(shí)，可以獲得IO7個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合。 步驟S503 :對(duì)第三PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第三DNA產(chǎn)物，第三DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含反轉(zhuǎn)錄引物序列與前端引物序列的互補(bǔ)序列，或包含反轉(zhuǎn)錄引物序列的互補(bǔ)序列與前端引物序列；第三PCR產(chǎn)物是包含第三DNA產(chǎn)物的混合物，經(jīng)過(guò)分離純化后，獲得片段大小基本一致的第三DNA產(chǎn)物的混合物，第三DNA產(chǎn)物是個(gè)包含多條各不相同的DNA雙鏈序列的混合物。且第三DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含反轉(zhuǎn)錄引物序列與前端引物序列的互補(bǔ)序列，或包含反轉(zhuǎn)錄弓I物序列的互補(bǔ)序列與前端引物序列。步驟S504 :將獲得的第三DNA產(chǎn)物與第三上游引物序列和第三下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第四PCR產(chǎn)物，其中，第三上游引物序列包含前端引物序列中的接頭序列，第三下游引物序列包含反轉(zhuǎn)錄弓I物序列中的接頭序列；第三DNA產(chǎn)物是在經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄和一個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)后得到的，數(shù)量和質(zhì)量都很少，無(wú)法滿足后續(xù)要求，因此，要得到大量的滿足要求的第三DNA產(chǎn)物，需要進(jìn)行第二次的PCR反應(yīng)。第三上游引物序列包含前端引物序列中的接頭序列，第三下游引物序列包含反轉(zhuǎn)錄引物序列中的接頭序列，因此，通過(guò)二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，可以獲得大量的包含第三DNA產(chǎn)物的DNA序列，即第四PCR產(chǎn)物。其中，第三上游引物序列或第三下游引物序列包含測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司結(jié)合序列，第三上游引物序列的測(cè)序引物序列包含前端引物序列中的接頭序列，第三下游引物序列的測(cè)序弓I物序列包含反轉(zhuǎn)錄弓I物序列中的接頭序列。步驟S505 :對(duì)第四PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第四DNA產(chǎn)物；步驟S506 :對(duì)第四DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果；其中，反轉(zhuǎn)錄引物序列與前端引物序列的標(biāo)簽序列使得每個(gè)第三DNA產(chǎn)物的DNA序列具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，接頭序列是使每個(gè)第三DNA產(chǎn)物的DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列。其中，步驟S506具體包括A :對(duì)第四DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，獲得DNA測(cè)序結(jié)果。B :將DNA測(cè)序結(jié)果按照標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，獲得屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果。C 比較屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)所有的DNA測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次。例如，同一個(gè)DNA序列，總共有10個(gè)DNA測(cè)序結(jié)果，第5個(gè)位置有7個(gè)測(cè)序結(jié)果是A，兩個(gè)測(cè)序結(jié)果是G，一個(gè)測(cè)序結(jié)果是T，則第5個(gè)位置出現(xiàn)A的頻次是0. 7，出現(xiàn)G的頻次是0.2，出現(xiàn)T的頻次是0.1。D :判斷每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次是否達(dá)到預(yù)定的閾值。E :若達(dá)到預(yù)定的 閾值，則確定屬于同一個(gè)DNA序列的所述位置的堿基，按照方法，即可確定屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。如果設(shè)定的每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次的預(yù)定的閾值是0.67，根據(jù)上述例子，第5個(gè)位置出現(xiàn)A的頻次是0. 7，因此第5個(gè)位置的堿基確定是A。依此類推，可以確定屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。本發(fā)明主要利用了一對(duì)反轉(zhuǎn)錄引物序列與前端引物序列，這對(duì)引物序列除了包含基礎(chǔ)引物序列外，還包含接頭序列和標(biāo)簽序列，標(biāo)簽序列使得經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)獲得的每個(gè)DNA序列具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)以及測(cè)序后，即可獲得每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，通過(guò)分析每個(gè)DNA序列的多個(gè)測(cè)序結(jié)果，可以辨別每個(gè)DNA序列的每個(gè)位置的堿基是否是其它外部實(shí)驗(yàn)因素導(dǎo)致的基因突變，因而可以提高基因測(cè)序的準(zhǔn)確性，顯著減少基因測(cè)序的錯(cuò)誤率；另外通過(guò)計(jì)算標(biāo)簽序列可以準(zhǔn)確測(cè)定每個(gè)DNA片段的拷貝數(shù)。參閱圖7，圖7是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法中反轉(zhuǎn)錄及兩次PCR反應(yīng)的原理示意圖，如圖所示，前端引物序列21’包含接頭序列213’、標(biāo)簽序列212’以及前端基礎(chǔ)引物序列211’，反轉(zhuǎn)錄引物序列22’包含接頭序列223’、標(biāo)簽序列222’以及反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列221’。該原理包括步驟S701 :反轉(zhuǎn)錄引物序列22’和RNA序列11’的溶液混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA產(chǎn)物12，。反轉(zhuǎn)錄引物序列22’的反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列221’與RNA序列11’的3’末端結(jié)合，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA產(chǎn)物12’，從而使cDNA產(chǎn)物12’帶上反轉(zhuǎn)錄引物序列22’的接頭序列223’和標(biāo)簽序列222’。
步驟S702 :將cDNA產(chǎn)物12’與前端引物序列21’混合反應(yīng)，再進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第三DNA產(chǎn)物41’。步驟S703 :將第三DNA產(chǎn)物41’與第三上游引物序列31’和第三下游引物序列32 ’的溶液混合，進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第四DNA產(chǎn)物42’。第三上游引物序列31’包含前端引物序列21’的接頭序列213’，第三下游引物序列32’包含反轉(zhuǎn)錄引物序列22’中的接頭序列223’。參閱圖8，圖8是本發(fā)明對(duì)多個(gè)混合的RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法中反轉(zhuǎn)錄及兩次PCR反應(yīng)的另一原理示意圖，如圖所示，前端引物序列61’包含接頭序列613’、標(biāo)簽序列612’以及前端基礎(chǔ)引物序列611’，反轉(zhuǎn)錄引物序列62’包含接頭序列623’、標(biāo)簽序列622’以及反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列621’。該原理包括步驟S801 :反轉(zhuǎn)錄引物序列62’和RNA序列51’的溶液混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA產(chǎn)物52，。反轉(zhuǎn)錄引物序列62’的反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列621’與RNA序列51’的3’末端結(jié)合，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA產(chǎn)物52’，從而使cDNA產(chǎn)物52’帶上反轉(zhuǎn)錄引物序列62’的接頭序列623’和標(biāo)簽序列622’。步驟S802 :將 cDNA產(chǎn)物52’與前端引物序列61’混合反應(yīng)后，再進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第三DNA產(chǎn)物81’。步驟S803 :將第三DNA產(chǎn)物81’與第三上游引物序列71，和第三下游引物序列72’的溶液混合，進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第四DNA產(chǎn)物82’。第三上游引物序列71’包含測(cè)序引物序列711’、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列712’和測(cè)序公司結(jié)合序列713’，測(cè)序引物序列711’包含前端引物序列61’的接頭序列613’;第三下游引物序列72’包含測(cè)序引物序列721’、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列722’和測(cè)序公司結(jié)合序列723’，測(cè)序引物序列721’包含反轉(zhuǎn)錄引物序列62’的接頭序列623’。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施方式，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法，其特征在于，包括 將M對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列和免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體TCR和/或B淋巴細(xì)胞受體BCR的N個(gè)DNA序列的溶液混合，并進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一PCR產(chǎn)物，其中，所述M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，所述第一上游引物序列或第一下游引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及第一上游基礎(chǔ)引物序列或第一下游基礎(chǔ)弓I物序列，每對(duì)第一上游弓I物序列與第一下游弓I物序列的標(biāo)簽序列使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，所述接頭序列是使每個(gè)DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列，所述第一上游基礎(chǔ)引物序列與第一下游基礎(chǔ)引物序列分別與所述DNA序列兩條單鏈的3’末端互補(bǔ)； 對(duì)所述第一 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第一 DNA產(chǎn)物，所述第一 DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含所述第一上游引物序列與第一下游引物序列的互補(bǔ)序列，或包含所述第一上游引物序列的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列； 將所述獲得的第一 DNA產(chǎn)物與第二上游引物序列和第二下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第二 PCR產(chǎn)物，其中，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的接頭序列； 對(duì)所述第二 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第二 DNA產(chǎn)物； 對(duì)所述第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接頭序列包括測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列，所述測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列順序連接，所述測(cè)序引物序列連接所述第一上游引物序列或第一下游引物序列的標(biāo)簽序列，所述測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列用于區(qū)別來(lái)自不同樣本的多個(gè)DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)，或者七個(gè)，或者六個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述對(duì)第二DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果的步驟，包括 對(duì)所述第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，獲得DNA測(cè)序結(jié)果； 將所述DNA測(cè)序結(jié)果按照標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，獲得屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果； 比較所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)所述所有的DNA測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次； 判斷所述每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次是否達(dá)到預(yù)定的閾值； 若達(dá)到預(yù)定的閾值，則確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所述位置的堿基，按照所述方法，即可確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。
6.一種對(duì)多個(gè)混合的DNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的裝置，其特征在于，包括 第一獲得模塊，用于將M對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列和免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體和/或B淋巴細(xì)胞受體的N個(gè)DNA序列的溶液混合，并進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第一 PCR產(chǎn)物，其中，所述M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，所述第一上游引物序列或第一下游引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及第一上游基礎(chǔ)引物序列或第一下游基礎(chǔ)引物序列，每對(duì)第一上游引物序列與第一下游引物序列的標(biāo)簽序列使得每個(gè)DNA序列經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，所述接頭序列是使每個(gè)DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列，所述第一上游基礎(chǔ)引物序列與第一下游基礎(chǔ)引物序列分別與所述DNA序列兩條單鏈的3’末端互補(bǔ)； 第二獲得模塊，用于對(duì)所述第一 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第一 DNA產(chǎn)物，所述第一DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含所述第一上游引物序列與第一下游引物序列的互補(bǔ)序列，或包含所述第一上游引物序列的互補(bǔ)序列與第一下游引物序列； 第三獲得模塊，用于將所述獲得的第一 DNA產(chǎn)物與第二上游引物序列和第二下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第二 PCR產(chǎn)物，其中，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的接頭序列； 第四獲得模塊，用于對(duì)所述第二 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第二 DNA產(chǎn)物； 測(cè)序結(jié)果獲得模塊，用于對(duì)所述第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，所述接頭序列包括測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列，所述測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司接頭序列順序連接，所述測(cè)序引物序列連接所述第一上游引物序列或第一下游引物序列的標(biāo)簽序列，所述測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列用于區(qū)別來(lái)自不同樣本的多個(gè)DNA序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其特征在于，所述第二上游引物序列包含所述第一上游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列，所述第二下游引物序列包含所述第一下游引物序列中的測(cè)序公司接頭序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)，或者七個(gè)，或者六個(gè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至8任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述測(cè)序結(jié)果獲得模塊包括 第一獲得單元，用于對(duì)所述第二 DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，獲得DNA測(cè)序結(jié)果； 第二獲得單元，用于將所述DNA測(cè)序結(jié)果按照標(biāo)簽序列進(jìn)行分類整理，獲得屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果； 統(tǒng)計(jì)單元，用于比較所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有的DNA測(cè)序結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)所述所有的DNA測(cè)序結(jié)果中每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次； 判斷單元，用于判斷所述每個(gè)位置出現(xiàn)相同堿基的頻次是否達(dá)到預(yù)定的閾值； 確定單元，用于在達(dá)到預(yù)定的閾值時(shí)，確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所述位置的堿基，直到確定所述屬于同一個(gè)DNA序列的所有位置的堿基。
11.一種對(duì)多個(gè)混合的RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法，其特征在于，包括 將M個(gè)反轉(zhuǎn)錄引物序列與免疫細(xì)胞群中T淋巴細(xì)胞受體TCR和/或B淋巴細(xì)胞受體BCR的N個(gè)RNA序列的溶液混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA序列的產(chǎn)物，其中，所述M和N是自然數(shù)，M大于或等于一百倍的N，所述反轉(zhuǎn)錄引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列，所述反轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)引物序列與所述RNA序列的3’末端互補(bǔ)； 將所述獲得的cDNA序列的產(chǎn)物與M個(gè)前端弓I物序列的溶液混合反應(yīng)后，再進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第三PCR產(chǎn)物，其中，所述前端引物序列從5’端到3’端依次包含接頭序列、標(biāo)簽序列以及前端基礎(chǔ)引物序列，所述前端基礎(chǔ)引物序列與所述cDNA序列的3’末端互補(bǔ)； 對(duì)所述第三PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第三DNA產(chǎn)物，所述第三DNA產(chǎn)物的每條單鏈的兩端均包含所述反轉(zhuǎn)錄弓I物序列與前端引物序列的互補(bǔ)序列，或包含所述反轉(zhuǎn)錄引物序列的互補(bǔ)序列與前端引物序列； 將所述獲得的第三DNA產(chǎn)物與第三上游引物序列和第三下游引物序列的溶液混合，并進(jìn)行二十五至四十個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，獲得第四PCR產(chǎn)物，其中，所述第三上游引物序列包含所述前端引物序列中的接頭序列，所述第三下游引物序列包含所述反轉(zhuǎn)錄引物序列中的接頭序列； 對(duì)所述第四PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得第四DNA產(chǎn)物； 對(duì)所述第四DNA產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果； 其中，反轉(zhuǎn)錄引物序列與前端引物序列的標(biāo)簽序列使得每個(gè)第三DNA產(chǎn)物的DNA序列具有不同于其它DNA序列的標(biāo)簽序列，所述接頭序列是使每個(gè)第三DNA產(chǎn)物的DNA序列同等地進(jìn)行PCR反應(yīng)的序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述第三上游引物序列或第三下游引物序列包含測(cè)序引物序列、測(cè)序公司標(biāo)識(shí)序列以及測(cè)序公司結(jié)合序列，所述第三上游引物序列的測(cè)序弓I物序列包含前端弓I物序列中的接頭序列，所述第三下游弓I物序列的測(cè)序弓I物序列包含反轉(zhuǎn)錄弓I物序列中的接頭序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)多個(gè)混合的DNA或RNA序列進(jìn)行基因測(cè)序的方法及裝置，主要是在建庫(kù)前給每個(gè)DNA或RNA模版序列兩端加入隨機(jī)標(biāo)簽。方法包括將含有隨機(jī)標(biāo)簽和接頭的第一上游引物與第一下游引物和DNA序列混合，進(jìn)行兩個(gè)PCR循環(huán)的多重PCR擴(kuò)增，純化該P(yáng)CR產(chǎn)物，獲得第一DNA產(chǎn)物；將第一DNA產(chǎn)物與含有樣品索引序列和接頭的第二上游引物和第二下游引物混合，進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得第二PCR產(chǎn)物；純化后獲得第二DNA產(chǎn)物；對(duì)第二DNA產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得每個(gè)DNA序列的測(cè)序結(jié)果。本發(fā)明通過(guò)引入隨機(jī)標(biāo)簽到每個(gè)DNA分子，能夠提高測(cè)序的準(zhǔn)確性，顯著減少測(cè)序的錯(cuò)誤率，且準(zhǔn)確測(cè)定每種DNA的拷貝數(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103045726SQ20121047229
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者李周芳, 賀建奎, 施國(guó)寧 申請(qǐng)人:南方科技大學(xué), 深圳市瀚?；蛏锟萍加邢薰?br>