專利名稱：一種提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，屬于酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
膽固醇氧化酶(COD)是膽固醇代謝過程中關(guān)鍵酶，能專一性催化膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾-4-烯-3-酮，它作為一種膽固醇檢測酶應(yīng)用于醫(yī)療檢測領(lǐng)域。同時，在食品開發(fā)、抗蟲基因工程、生物農(nóng)藥等方面也具有廣泛應(yīng)用價值。由于膽固醇氧化酶在保存、運輸過程中易失活，因此提高其穩(wěn)定性是該酶大量應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，提高酶穩(wěn)定性方法主要有，蛋白質(zhì)工程、固定化、添加保護劑、化學(xué)修飾等，其中固定化是較為常用的方法。戊二醛作為雙功能試劑，廣泛應(yīng)用于酶固定化中，但考慮到操作復(fù)雜且試劑具有毒性，本實驗中使用碳二亞胺法固定膽固醇氧化酶，I-乙基-(3- 二甲 基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)是一種將氨基和羧基偶聯(lián)的縮合劑，載體或蛋白羧基被碳二亞胺活化，生成中間產(chǎn)物，該產(chǎn)物再與蛋白氨基反應(yīng)形成結(jié)合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，本發(fā)明設(shè)計巧妙、條件溫和、易操作、成本低、環(huán)境污染小、適于大規(guī)模應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性方法，其特點是，包括以下步驟(I)合成四種不同類型的羧基瓊脂糖顆粒載體；(2)固定時間為16-20小時，所述固定溫度為4-1 (TC。為了實現(xiàn)上述目的，在步驟(I)之前需要研究膽固醇氧化酶分子表面堿性氨基酸數(shù)目，所述單個膽固醇氧化酶分子表面堿性氨基酸數(shù)目為60個。較佳地，在步驟(I)中，合成四種不同類型的四種不同類型的，以瓊脂糖(如Sepharose4B)為基質(zhì)，分別連接天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)和脯氨酸(Pro)四種氨基酸,制備帶有不同氨基酸的羧基載體，其中優(yōu)選Asp。較佳地，所述連接Asp、Glu兩種氨基酸的載體羧基密度基本為40-50μπιΟ1/^，連接Ser、Pro兩種氨基酸的載體羧基為20-30 μ mol/g。較佳地，在步驟(2)中，所述羧基載體為連接Asp的瓊脂糖顆粒，所述酶分子游離氨基與載體羧基摩爾比I : 10，總羧基與EDC摩爾比為I : 2，所述固定pH為6. O。較佳地,所述固定時間為16-20小時,所述固定溫度為4_10°C。較佳地，所述固定化后使用O. 6mol/L NaCl溶液洗去非特異性吸附。所述固定化酶的熱、pH和存儲穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶。本發(fā)明的有益效果具體如下I、本發(fā)明在固定前，分析了膽固醇氧化酶分子表面堿性氨基酸分布情況，便于其后進行固定化；
2、本發(fā)明以瓊脂糖為基質(zhì)，通過化學(xué)合成法連接四種不同氨基酸，形成了四種不同類型的羧基載體；3、本發(fā)明優(yōu)化了膽固醇氧化酶固定化條件，增強了操作的精確性。


圖I是膽固醇氧化酶分子表面堿性氨基酸分布圖。圖2是不同pH對固定化COD活力的影響圖3是總羧基與EDC摩爾比對固定化COD活力的影響
圖4是游離酶和固定酶的熱穩(wěn)定性圖5是游離酶和固定酶的pH穩(wěn)定性圖6是游離酶和固定酶的存儲穩(wěn)定性
具體實施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實施例詳細說明。實施例I不同氨基酸載體對固定化COD活力的影響稱取四種不同氨基酸的羧基載體Ig于15mL的離心管中，按照總羧基與EDC摩爾比I : 10、載體羧基與膽固醇氧化酶氨基摩爾比25 I的比例加入EDC和膽固醇氧化酶的量，加入磷酸緩沖液至溶液總體積為10mL，調(diào)節(jié)溶液pH至7. 0，4-10°C、50r/min振蕩固定16-20小時?；旌衔?000rpm離心5min,取出沉淀后,用8mL0. 6mol/L NaCl于4°C洗漆lh,混合物SOOOrpm離心5min，測定上清液未偶聯(lián)的酶活力，過濾除去上清液得固定化酶，測定
固定化酶活力，計算相對酶活力(％ ) O
相對酶活Jj (%)=-初始固定酶話力-*ιοο
加入酶總活力-上清未偶聯(lián)酶活力將不同固定化酶置于37°C水浴鍋內(nèi)，24小時后測定酶活力，計算酶活力保留率
(% )o
酶活力保留率(%)=24小T口,固I酶活力*100 初始固定酶活力不同載體表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定效果，為了增強酶穩(wěn)定性，選擇載體-Asp作為最佳的固定載體，結(jié)果見表I。表I不同氨基酸載體對固定化COD活力的影響
羧基種類酶活(U/g)相對酶活力(%) 酶活力保留率(%)
-Asp7.0825.4850.58
-Glu9. 3732. 5744.25
-Ser10. 1367. 5422.23
-Pro7.9552.9828.68實施例2膽固醇氧化酶氨基與載體羧基摩爾比對固定化COD活力的影響
稱取連接Asp的羧基載體Ig于15mL的離心管中，按照總羧基與EDC摩爾比I 10、不同膽固醇氧化酶氨基與載體羧基摩爾比(I 5、1 IOU 20,1 40,1 80、I 120)加入EDC和膽固醇氧化酶的量，加入磷酸緩沖液至溶液總體積為10mL，調(diào)節(jié)溶液pH至7. 0,4_10°C、50r/min振蕩固定16-20小時。混合物6000rpm離心5min,取出沉淀后，用8mL0. 6mol/LNaCl于4 V洗洚Ih,混合物8000rpm離心5min,測定上清液未偶聯(lián)的酶活
力，過濾除去上清液得固定化酶，測定固定化酶活力，計算相對酶活力(％ )。
權(quán)利要求
1.一種提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性方法，其特征在于，包括以下步驟 調(diào)整膽固醇氧化酶分子游離氨基與羧基瓊脂糖顆粒載體羧基摩爾比為I : 10，總羧基與交聯(lián)劑I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺摩爾比為I : 2，固定16-20小時，控制固定溫度為4-10°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述羧基瓊脂糖顆粒載體以瓊脂糖基質(zhì)，添加Asp、Glu、Ser和Pro四種氨基酸,制備帶有不同氨基酸的羧基瓊脂糖載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述羧基瓊脂糖顆粒載體為使用Asp的羧基瓊脂糖載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述方法，其特征在于，連接Asp、Glu兩種氨基酸的載體羧基密度為40-50 μ mol/g,連接Ser、Pro兩種氨基酸的載體羧基為20-30 μ mol/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述方法，其特征在于，所述固定pH為6.O。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述瓊脂糖為Sephar0Se4B。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述固定化后使用O.6mol/L NaCl溶液洗去非特異性吸附。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述固定溫度為4°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性方法，屬于酶工程領(lǐng)域。通過交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)對膽固醇氧化酶進行固定，優(yōu)化固定時間及溫度后，固定化酶在熱、pH和存儲穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶，本發(fā)明易操作、成本低、環(huán)境污染小、適于大規(guī)模應(yīng)用。
文檔編號C12N11/10GK102943071SQ20121047255
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者楊海麟, 辛瑜, 王武, 張玲, 陳亦 申請人:江南大學(xué)