專利名稱：OGP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。
背景技術(shù)：
老年人骨質(zhì)疏松發(fā)病率較高，全球有2億骨質(zhì)疏松患者，并且女性多于男性。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)國(guó)家健康和營(yíng)養(yǎng)調(diào)查(NHANESIII，1988 1994年)結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折，一旦患者經(jīng)歷了第一次骨質(zhì)疏松性骨折，繼發(fā)性骨折的危險(xiǎn)明顯加大。中國(guó)老年人居于世界首位，現(xiàn)有骨質(zhì)疏松癥患者9000萬(wàn)，占總?cè)丝诘?br> 7.1%。隨著社會(huì)老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2050年將增加到
2.21億，那時(shí)全世界一半以上的骨質(zhì)疏松性骨折將發(fā)生在亞洲，絕大部分在中國(guó)。有學(xué)者對(duì)1995 1996年美國(guó)骨質(zhì)疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發(fā)生數(shù)進(jìn)行調(diào)查顯示，每年發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折150萬(wàn)次，其中椎體骨折70萬(wàn)次，腕部骨折20萬(wàn)次，髖部骨折30萬(wàn)次，其它骨折30萬(wàn)次。血栓形成是一種涉及許多彼此相互作用的遺傳和環(huán)境因素的多因素變化的過(guò)程。而對(duì)于老年人其凝血系統(tǒng)又有其特殊性，老年人纖維蛋白原(FIB)含量、組織型纖溶酶原激活物增加以及纖溶酶原激活物抑制劑復(fù)合物的增加都導(dǎo)致老年人的高凝狀態(tài)，所以更容易形成血栓；其中研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)期后的女性的血栓發(fā)生率遠(yuǎn)高于男性。對(duì)于老年人骨質(zhì)疏松和血栓已成為常見多發(fā)病，且往往同時(shí)存在。如果患者服用多種藥物同時(shí)治療骨質(zhì)疏松和血栓，容易產(chǎn)生藥物拮抗反應(yīng)；若要錯(cuò)開服藥時(shí)間一方面要靠考慮藥物的半衰期，另一方面還要考慮藥物有效濃度，而且給患者造成不便。目前缺乏一種可以同時(shí)有效治療骨質(zhì)疏松和血栓的藥品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前尚無(wú)同時(shí)有效治療骨質(zhì)疏松和血栓藥品的缺陷，而提供的一種0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/AcAP5)，大腸桿菌BL21(DE3-0GP/AcAP5)按以下步驟制備一、將含有0GP-AcAP5融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC (0GP/AcAP5)用BamH I和EcoRI雙酶切，獲得0GP-AcAP5融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、0GP-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過(guò)雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過(guò)夜，得到載體pGEX-0GP/AcAP5 ；四、用載體PGEX-0GP/ACAP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，選擇陽(yáng)性重組子，即獲得0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/AcAP5)。本發(fā)明中0GP_AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。
本發(fā)明中0GP_AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/AcAP5)發(fā)酵產(chǎn)生的0GP-AcAP5融合蛋白含有成骨生長(zhǎng)肽(OGP)和犬鉤蟲抗凝血肽(AcAP5)，共94個(gè)氨基酸，成骨生長(zhǎng)肽和犬鉤蟲抗凝血肽之間用GlyThr相連接。本發(fā)明0GP_AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)發(fā)酵產(chǎn)生的0GP_AcAP5融合蛋白可用于同時(shí)治療骨質(zhì)疏松和血栓，適合同時(shí)患有這兩種疾病的患者使用。且0GP-AcAP5融合蛋白為微生物制劑，不產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，使用安全。本發(fā)明采用生物基因工程手段獲得大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)。采用本發(fā)明基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)0GP_AcAP5融合蛋白，具有廣泛應(yīng)用前景。本發(fā)明為治療骨質(zhì)疏松和血栓奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式0GP_AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)，大腸桿菌 BL21 (DE3_0GP/AcAP5)按以下步驟制備一、將含有0GP-AcAP5融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC (0GP/AcAP5)用BamH I和EcoRI雙酶切，獲得0GP-AcAP5融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、0GP-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過(guò)雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過(guò)夜，得到載體pGEX-0GP/AcAP5 ；四、用載體pGEX-0GP/AcAP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，選擇陽(yáng)性重組子，即獲得0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/AcAP5)。本實(shí)施方式步驟四采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟一中質(zhì)粒載體pUC(0GP/AcAP5)酶切反應(yīng)體系為
pUC (OGP/AcAP5)20 μ
IOXMbuffer6μ1
BamHl3μ1
EcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1ο其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二的不同點(diǎn)在于步驟三中質(zhì)粒pGEX-6P-l酶切反應(yīng)體系為載體 pGEX-6P-l20 μ
IOXMbuffer6μ1
BamHl3μ1
EcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一、二或三的不同點(diǎn)在于步驟二中酶連接反應(yīng)體系為·
雙酶切的載體pGEX-6P-l3 μ
融合蛋白的DNA片段13μ1
10 X Τ4 DNA 連接酶 buffer2μΙ
Τ4 DNA連接酶2μ1。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一、二或三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一的不同點(diǎn)在于步驟一中0GP-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID Ν0:1所示。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。本實(shí)施方式0GP_AcAP5融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的質(zhì)粒載體pUC(0GP/AcAP5)。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一的不同點(diǎn)在于步驟一中0GP-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方
式一至五之一相同O具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式0GP_AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21(DE3-0GP/AcAP5)，大腸桿菌 BL21(DE3-0GP/AcAP5)按以下步驟制備一、將含有0GP_AcAP5融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC (0GP/AcAP5)用BamH I和EcoRI雙酶切，獲得0GP-AcAP5融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、0GP_AcAP5融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過(guò)雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過(guò)夜，得到載體pGEX-0GP/AcAP5 ；四、用載體pGEX-0GP/AcAP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，選擇陽(yáng)性重組子，即獲得0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/AcAP5)；其中步驟一中質(zhì)粒載體pUC(0GP/AcAP5)酶切反應(yīng)體系為
pUC (OGP/AcAP5)20 μ
IOXMbuffer6μ1
ΒατηΥ .3μ1
EcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1；其中步驟三中質(zhì)粒pGEX-6P-l酶切反應(yīng)體系為載體 pGEX-6P-l20 μIOXMbuffer 6μ1
Βατη .3μ1EcoR I 3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1；其中步驟二中酶連接反應(yīng)體系為
雙酶切的載體pGEX-6P-l3 μ
融合蛋白的DNA片段13μ1
10ΧΤ4 DNA 連接酶 buffer2μ1
Τ4 DNA連接酶2μ1ο其中步驟一中0GP_AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO :1所示；步驟一中0GP-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。本實(shí)施方式中0GP_AcAP5融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的質(zhì)粒載體pUC(0GP/AcAP5)。本實(shí)施方式在構(gòu)建0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/AcAP5)時(shí)去除了 AcAP5基因的原始信號(hào)肽，而且在成骨生長(zhǎng)肽和犬鉤蟲抗凝血肽之間插入Kpn I酶切位點(diǎn)，既可以提高所編碼融合蛋白的穩(wěn)定性，同時(shí)也改變?nèi)诤系鞍椎亩?jí)結(jié)構(gòu)，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因兩側(cè)分別加上BamHI和EcoR I酶切位點(diǎn)，而且根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子的特點(diǎn)，重新設(shè)計(jì)了融合基因編碼堿基序列。載體pGEX-6P-l上不含有Kpn I酶切位點(diǎn)，本實(shí)施方式合成的pGEX_0GP/AcAP5均能為Kpn I單酶切開，說(shuō)明本實(shí)施方式0GP-AcAP5融合蛋白成功導(dǎo)入質(zhì)粒pGEX-6P-l中。然后將質(zhì)粒pGEX-0GP/AcAP5導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，選取陽(yáng)性克隆。隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)菌落37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)DNA，用KpnI進(jìn)行單酶切，并用相應(yīng)的空白質(zhì)粒pGEX_6P_l作為對(duì)照，將含有Kpn I酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序工作委托生物公司進(jìn)行，大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)內(nèi)含有 SEQ ID NO 1 所示 DNA。將大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)置于LB培養(yǎng)基28°C環(huán)境條件下培養(yǎng)15h，然后采用GST標(biāo)簽融合蛋白純化方法進(jìn)行蛋白的分離純化，本實(shí)施方式用于治療骨質(zhì)疏松和血栓的融合蛋白的純度為98%，融合蛋白的表達(dá)量為38%。利用本實(shí)施方式大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)發(fā)酵獲得的0GP_AcAP5融合蛋白進(jìn)行試驗(yàn)0GP-AcAP5融合蛋白治療骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)取雌性SD大鼠，無(wú)菌條件下摘除雙側(cè)卵巢，陰性對(duì)照組切除雙側(cè)一小塊脂肪。5天后取存活健康大鼠32只，隨機(jī)分為4組，每組8只，分別口服一下藥物陰性對(duì)照組(control):質(zhì)量濃度為O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；模型組(model):質(zhì)量濃度為O. 5%的0GP_AcAP5融合蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；(獲得的用于治療骨質(zhì)疏松和血栓的融合蛋白用無(wú)菌水溶解)陽(yáng)性對(duì)照組I :阿侖膦酸鈉(Alen) 5mg/kg。陽(yáng)性對(duì)照組2 :質(zhì)量濃度為O. 5%的OGP蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg。
連續(xù)給藥三個(gè)月，處死后各取大鼠股骨頭8只，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金剛石鋸將股骨頭矢面鋸開，取其一片，經(jīng)清洗，10%次氯酸鈉浸泡6h，超聲清洗15min，乙醇梯度脫水，乙醚浸泡，干燥，離子濺射鍍膜，SX-40掃描電鏡觀察，加速電壓20kV。觀察骨質(zhì)疏松治療對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，結(jié)果表明模型組、陽(yáng)性對(duì)照組I和陽(yáng)性對(duì)照組2都具有治療骨質(zhì)疏松的作用，且模型組的效果最好。表4骨小梁寬度的比較和骨面積(X土SD)
權(quán)利要求
1.0GP-ACAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于0GP-ACAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)，大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/AcAP5)按以下步驟制備 一、將含有0GP-AcAP5融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC(0GP/AcAP5)用BamHI和EcoRI雙酶切，獲得0GP-AcAP5融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ； 三、0GP-AcAP5融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過(guò)雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過(guò)夜，得到載體pGEX-0GP/AcAP5 ； 四、用載體pGEX-0GP/AcAP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，選擇陽(yáng)性重組子，即獲得0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/AcAP5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中質(zhì)粒載體pUC(0GP/AcAP5)酶切反應(yīng)體系為 pUC (0GP/AcAP5)20 μ IOXMbuffer6μ1 JSawHI3μ1 EcoR I3μ1 不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟三中質(zhì)粒pGEX-6P-l酶切反應(yīng)體系為 載體 pGEX-6P-l20 μ IOXMbufFer6μ1 Bamm3μ1 EcoR I3μ1 不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟二中酶連接反應(yīng)體系為雙酶切的載體pGEX-6P-l3 μ 融合蛋白的DNA片段13μ110 X Τ4 DNA 連接酶 buffer2μ1Τ4 DNA連接酶2μ1ο
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中0GP-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的0GP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中0GP-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
全文摘要
OGP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，它涉及一種融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。解決目前尚無(wú)同時(shí)有效治療骨質(zhì)疏松和血栓藥品的缺陷。OGP-AcAP5融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3-OGP/AcAP5)按以下步驟制備一、獲得融合蛋白DAN片段；二、雙酶切質(zhì)粒；三、酶連接；四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。本發(fā)明可用于醫(yī)藥制備領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102911907SQ20121047595
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者余瓊 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)