專利名稱：高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，尤其是涉及一種以RNA或mRNA為模板，高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法。
背景技術(shù)：
在有互補的寡核苷酸引物的存在下，各種RNA依賴的DNA聚合酶可利用RNA作為模板，合成 cDNA (Karkas，JD，PROC。NATL ACAD。美國 70:3834-3838，1973)，這種反應(yīng)被稱之為逆轉(zhuǎn)錄。通常來講，使用逆轉(zhuǎn)錄酶，如來自鳥類成髓細胞瘤病毒(AMV)或莫洛尼氏鼠白 血病病毒(MMLV)的逆轉(zhuǎn)錄酶(鮑威爾，LM等，細胞50:831-840，1987)，cDNA的合成率是比較低下的。使用耐熱(大于50°C )的DNA依賴的DNA聚合酶，(Myers, T. ff. and Gelfand,
D.H. Biochemistry 30:7661-7666，1991 和 U.S. Pat. Nos. 5,322,770; 5,310,652;and 5, 407, 800)作為逆轉(zhuǎn)錄酶用于cDNA合成，可以提高cDNA的合成量，但仍不能達到令人滿意的效果。而從微量RNA或mRNA含量的樣本提取靶核酸，進行cDNA合成時，高產(chǎn)量的cDNA的合成對后續(xù)實驗攸關(guān)重要，比如血清HCV RNA病毒檢測。美國專利777946和8071311公開了利用一種由5’ RNA部分和3’的DNA部分組成的復(fù)合引物進行常溫DNA擴增方法。其中的復(fù)合引物在合成cDNA后，其5’RNA部分可被核糖核酸酶H酶(RNAH)降解掉，暴露出互補的3’單鏈末端，使后續(xù)的引物有機會結(jié)合在同一模板上，形成下一次擴增循環(huán)，使DNA擴增量提高。但是這種反應(yīng)比較復(fù)雜，需要多種酶參與反應(yīng)。因此，采用一種更簡單的方法來增加cDNA的擴增量對于微量RNA模板的樣品來講尤其重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法，它是以正鏈RNA或mRNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行cDNA的合成；其中
所選逆轉(zhuǎn)錄模板的目標區(qū)段的3’端依次稱為特異性引物結(jié)合區(qū)R1、間隔區(qū)S和部分模板片段區(qū)R2 ；
所用的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物由分別含有模板負鏈序列和正鏈序列的兩段脫氧核苷酸片段組合而成其中逆轉(zhuǎn)錄引物的3’端的Pl區(qū)是一組和模板特異性引物結(jié)合區(qū)Rl相互補的特異性脫氧核苷酸序列，逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端的P2區(qū)是一組和部分模板片段區(qū)R2序列相同的特異性脫氧核苷酸序列。所述和模板特異性引物結(jié)合區(qū)Rl相互補的逆轉(zhuǎn)錄引物的3’端的Pl區(qū)的脫氧核苷酸序列長度為15-24bp。所述和部分模板片段區(qū)R2序列相同的逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端的P2區(qū)的脫氧核苷酸序列長度為12-18 bp。
所述逆轉(zhuǎn)錄模板的特異性引物結(jié)合區(qū)R1、部分模板片段區(qū)R2之間的間隔區(qū)S的序列長度與逆轉(zhuǎn)錄引物Pl區(qū)的序列長度相等或加/減Ibp時，即S長度=Pl長度或S長度=Pl長度±lbp時，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的合成量更高。本發(fā)明的優(yōu)點在于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)簡單、高效，大大提高了 cDNA的合成量，進而使后續(xù)PCR的擴增量大大提高。本發(fā)明中的RNA或mRNA包括來自微生物(如病毒、細菌、衣原體和真菌等)、人和動植物等細胞。本發(fā)明所述的逆轉(zhuǎn)錄初始反應(yīng)中，逆轉(zhuǎn)錄引物的Pl區(qū)段和模板RNA結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成和RNA互補的第一條cDNA鏈，由于逆轉(zhuǎn)錄引物的P2區(qū)含有可以和部分新合成的cDNA鏈互補的序列，在一定程度上可以隨機在新的cDNA鏈的5’端形成一個發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，使得模板RNA上的引物Pl區(qū)段所結(jié)合區(qū)域重新暴露出來，新的引物再結(jié)合其上，開設(shè)新一輪的cDNA合成。這樣重復(fù)進行，形成一個在RNA模板上產(chǎn)生多個cDNA拷貝的逆轉(zhuǎn)·錄反應(yīng)。


圖I是本發(fā)明的反應(yīng)模式圖。圖2是實施例I的逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計圖。圖3是實施例I的實驗結(jié)果圖。圖4是實施例2的逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計圖。圖5是實施例2的實時熒光PCR檢測HAV及參照品反應(yīng)圖。圖6是實施例2的實時熒光PCR檢測HAV參照品反應(yīng)圖。圖7是實施例2的逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計對比實驗結(jié)果圖。
具體實施例方式本發(fā)明高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法，它是以正鏈RNA或mRNA為模板，使用特殊設(shè)計的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行cDNA的合成；其中
所選逆轉(zhuǎn)錄模板的目標區(qū)段的3’端依次稱為特異性引物結(jié)合區(qū)R1、間隔區(qū)S和部分模板片段區(qū)R2 ；
主導(dǎo)cDNA合成反應(yīng)的酶是RNA逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcripatase),也可以是RNA為模板的DNA聚合酶。本發(fā)明設(shè)計的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物是由分別含有模板RNA負鏈序列和正鏈序列的兩段脫氧核苷酸片段組合而成的復(fù)合序列引物其中該逆轉(zhuǎn)錄引物的3’端的Pl區(qū)是一組和模板RNA的特異性引物結(jié)合區(qū)Rl相互補的特異性脫氧核苷酸序列，逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端的P2區(qū)是一組和部分模板RNA片段區(qū)R2序列相同的特異性脫氧核苷酸序列。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液包括dNTPs，250mMTris-HCl pH8. 3 ；375mM KCl ；15mM MgCl2 ；50mM DTT，等。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑應(yīng)順序加入，反應(yīng)應(yīng)在37-42°C進行，合成反應(yīng)應(yīng)在30_60分鐘內(nèi)完成。和模板特異性引物結(jié)合區(qū)Rl相互補的逆轉(zhuǎn)錄引物的3’端的Pl區(qū)的脫氧核苷酸序列長度為15-24bp。和部分模板片段區(qū)R2序列相同的逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端的P2區(qū)的脫氧核苷酸序列長度為12-18 bp ;逆轉(zhuǎn)錄模板的特異性引物結(jié)合區(qū)R1、部分模板片段區(qū)R2之間的間隔區(qū)S的序列長度與逆轉(zhuǎn)錄引物Pl區(qū)的序列長度相等或加/減lbp。如圖I所示，在在本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，引物的Pl區(qū)段和模板RNA結(jié)合，合成和RNA互補的第一條cDNA鏈，其包括了可和引物P2區(qū)段互補結(jié)合的對應(yīng)區(qū)段。通過引物P2區(qū)和新合成的cDNA鏈含有的P2互補序列區(qū)段的隨機結(jié)合，在cDNA鏈的5’端可形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致模 板RNA的Rl區(qū)恢復(fù)到單鏈狀態(tài)，新的引物Pl區(qū)段得以再次結(jié)合于同一模板RNA的Rl區(qū)，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，啟動新的cDNA鏈的合成。即在和其它逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相同的條件下，使用本發(fā)明特殊設(shè)計的逆轉(zhuǎn)錄引物，可以使用同一 RNA模板，連續(xù)重復(fù)合成多個cDNA鏈，使cDNA合成量提高數(shù)倍，實現(xiàn)了高效合成單鏈cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實施例I :
如圖2所示，采用HCV病毒RNA用于cDNA合成的目標模板RNA，逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列弓I物為5MCT化Γ7似以6KGTGCACGGTCTACGAGACCTC，特異性引物的3’端有和模板RNA相互補的特異性脫氧核苷酸序列(Pl)，19bp，可結(jié)合于模版RNA的Rl區(qū)。特異性引物的5’端有可和模版RNA序列R2區(qū)域相同的特異性脫氧核苷酸序列(P2)，14bp。在圖2中顯示RNA模板的Rl和R2區(qū)間相隔S區(qū)長度為Pl序列長度加lbp，即20bp。使用常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物5’ TGCACGGTCTACGAGACCTC作為對比反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)設(shè)置
反應(yīng)配置的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包括I微克的HCV RNA模板，dNTPs (dATP，dCTP，dGTP和 dTTP)，50 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25。C)，75 mM KCl, 3 mM MgC12, 10 mM DTT和5單位的逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)混合物分為兩組，一組(A管)使用“常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物”，另一組(B管)使用本發(fā)明所述的“逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物”。I. RNA /引物混合物反應(yīng)管A管和B管 A管HCV RNA I微克
20 uM常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物Iul
10 mM的dNTP混合物Iul
DEPC H20 至IOul
B管HCV RNA I微克 20 uM逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物Iul
10 mM的dNTP混合物Iul
DEPC H20 至IOul
2.孵育A，B管樣品65°C 5分鐘，冰浴I分鐘。3.再在每個反應(yīng)中加入
5X逆轉(zhuǎn)錄溶液4ul，
逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/ul)lul,
DEPC H2O5 ul
25°C 10 分鐘，42°C 50 分鐘，70°C 10 分鐘。按照上述步驟，兩組反應(yīng)同時進行cDNA合成的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到的逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物放-20°C保存。
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，分別取等量的逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物為模板，進行平行樣品的PCR擴增。擴增結(jié)束后，取5ul PCR產(chǎn)物，采用電泳方法測定。以電泳條帶的強弱來比對各個反應(yīng)管產(chǎn)物的量的差別。結(jié)果見圖3，PCR產(chǎn)物應(yīng)為380bp。樣品1，2，5，和6為使用常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物的逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板的PCR結(jié)果。樣品3，4，7，和8為使用逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物的逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板的PCR結(jié)果。電泳凝膠上的帶型表明，在其它逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的各個條件相同的情況下，使用本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物可以提高cDNA合成量，進而使PCR擴增大大提高。實施例2
采用HAV RNA為cDNA合成的目標模板RNA，使用本發(fā)明所述的特異性逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合引物和常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物首先進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成目標cDNA。采用實時熒光PCR技術(shù)進行PCR擴增，對比兩種引物的逆轉(zhuǎn)錄效果。如圖4所示，逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物為RT-I 5’ aggaggtttggattctCCatttcaagagtccacaca,特異性引物的3’端有和模板RNA相互補的特異性脫氧核苷酸序列(Pl)，20bp，可結(jié)合于模版RNA的Rl區(qū)。特異性引物的5’端有可和模版RNA 序列R2區(qū)域相同的特異性脫氧核苷酸序列(P2)，16bp。在圖4中顯示RNA模板的Rl和R2區(qū)間相隔S區(qū)長度為19bp。使用常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物RT-2 5’ CCatttcaagagtccacaca作為對比反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)設(shè)置(同實施例I)。反應(yīng)配置的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物包括I微克的HAV RNA模板，dNTPs (dATP, dCTP，dGTP 和 dTTP)，50 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25° C)，75 mM KCl, 3 mM MgC12, 10 mMDTT和5單位的逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)混合物分為兩組，一組(A管)使用“常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物，，,另一組(B管)使用本發(fā)明所述的“逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物”。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)設(shè)置如下
1.RNA /引物混合物反應(yīng)管A和B管
A管HAV RNA I微克
20 uM常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物Iul
10 mM的dNTP混合物Iul
DEPC H2O 至IOul
B管HAV RNA I微克 20 uM逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物Iul
10 mM的dNTP混合物Iul
DEPC H20 至IOul
2.孵育A，B管樣品65°C5分鐘，冰浴I分鐘。3.再在每個反應(yīng)中加入
5X逆轉(zhuǎn)錄溶液4ul，
逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/ul)lul,
DEPC H2O5 ul
25°C 10 分鐘，42°C 50 分鐘，70°C 10 分鐘。按照上述步驟，兩組反應(yīng)同時進行cDNA合成的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。得到的逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物放-20°C保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，分別取等量的逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物為模板，使用Bio-Rad SYBR Green Supermix (2X)實時熒光反應(yīng)試劑進行PCR擴增。
PCR擴增反應(yīng)引物為
HAV-F 5’ acagattctacatttggattggtHAV-R 5’ aacttcattattteatgetcct實時熒光反應(yīng)設(shè)置(反應(yīng)為雙管平行設(shè)置)
A管HAV常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物cDNA I ul
HAV-FO. 5 ul
HAV-RO. 5 ul
DEPC H2O 至13 ul
2X Bio-Rad SYBR Green Supermix 15 ul B管HAV復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄引物cDNAIul
HAV-FO. 5 ul
HAV-RO. 5 ul
DEPC H2O 至13 ul
2X Bio-Rad SYBR Green Supermix 15 ul PCR 擴增程序為94°C 2 分鐘，94°C 30 秒，54°C 30 秒，72 °C 30 秒 X40 循環(huán)?！皹藴是€”使用已知HAV cDNA以10倍稀釋至7個稀釋度作為反應(yīng)參照品。結(jié)果如圖5-圖7所示使用常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄引物的cDNA為模板的實時熒光PCR反應(yīng)的Ct值為27。使用復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄引物的cDNA為模板的實時熒光PCR反應(yīng)的Ct值為23。結(jié)果表明，在其它逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的各個條件相同的情況下，使用逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物可以提高cDNA合成量，進而使PCR擴增大大提高。
權(quán)利要求
1.一種高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA的方法，它是以正鏈RNA或mRNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行cDNA的合成；其特征在于 所選逆轉(zhuǎn)錄模板的目標區(qū)段的3’端依次稱為特異性引物結(jié)合區(qū)R1、間隔區(qū)S和部分模板片段區(qū)R2 ； 所用的逆轉(zhuǎn)錄引物由分別含有模板負鏈序列和正鏈序列的兩段脫氧核苷酸片段組合而成的復(fù)合序列引物其中逆轉(zhuǎn)錄引物3’端的Pl區(qū)是一組和模板特異性引物結(jié)合區(qū)Rl相互補的特異性脫氧核苷酸序列，逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端的P2區(qū)是一組和部分模板片段區(qū)R2序列相同的特異性脫氧核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法，其特征在于所述和模板特異性引物結(jié)合區(qū)Rl相互補的逆轉(zhuǎn)錄引物的3’端的Pl區(qū)的脫氧核苷酸序列長度為15-24bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法，其特征在于所述和部分模板片段區(qū)R2序列相同的逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端的P2區(qū)的脫氧核苷酸序列長度為12-18 bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法，其特征在于所述逆轉(zhuǎn)錄模板的特異性引物結(jié)合區(qū)R1、部分模板片段區(qū)R2之間的間隔區(qū)S的序列長度與逆轉(zhuǎn)錄引物Pl區(qū)的序列長度相等或加/減lbp。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法，它是以正鏈RNA或mRNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行cDNA的合成；其中所選逆轉(zhuǎn)錄模板的目標區(qū)段的3’端依次稱為特異性引物結(jié)合區(qū)R1、間隔區(qū)S和部分模板片段區(qū)R2；所用的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合序列引物由分別含有模板負鏈序列和正鏈序列的兩段脫氧核苷酸片段組合而成其中逆轉(zhuǎn)錄引物的3’端的P1區(qū)是一組和模板特異性引物結(jié)合區(qū)R1相互補的特異性脫氧核苷酸序列，逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端的P2區(qū)是一組和部分模板片段區(qū)R2序列相同的特異性脫氧核苷酸序列。
文檔編號C12P19/34GK102943100SQ20121047899
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者白憲鶴, 付光宇, 李桂林, 高利飛, 張嵐, 馬建軍, 吳學(xué)煒, 苗擁軍 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司