專利名稱：儀隴坨坨麥抗條銹病基因相連鎖的特異分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程和小麥抗病遺傳育種領(lǐng)域，具體地涉儀隴坨坨麥抗條銹病基因相連鎖的特異分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由條型柄鎊菌(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici,Pst)引起的小麥條銹病是小麥危害程度最重的典型氣傳病害之一，早在小麥作為人類的主要糧食作物之前就已經(jīng)存在，在全世界除南極洲之外的各大洲60多個(gè)國(guó)家均有不同程度發(fā)生。中國(guó)是世界上最大且相對(duì)獨(dú)立的小麥條銹病流行區(qū)，小麥條銹病一直是威脅我國(guó)西北、西南、黃淮海等地冬麥區(qū)和西北春麥區(qū)最重要的小麥病害之一。近年來(lái)由于新毒性小種條中32和條中33的出現(xiàn)和流行更加劇了條銹病成災(zāi)趨勢(shì)，我國(guó)小麥條銹病自2000年以來(lái)一直處于大流行狀態(tài)。因此，迫切需要發(fā)掘新的抗條銹病基因并高效轉(zhuǎn)育到現(xiàn)有主栽品種中，增強(qiáng)小麥栽培品種的抗性?？共⌒禄虻陌l(fā)掘及利用是育種工作的基礎(chǔ)，也是解決抗性喪失這一難題的根本途徑。雖然傳統(tǒng)的藥劑防治可以從一定程度上減輕條銹病的危害，但是大量使用農(nóng)藥不僅增加了生產(chǎn)成本，還會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生很大的威脅。因此，選育抗病品種是防治條銹病經(jīng)濟(jì)、安全、有效的方法。近年來(lái)，我國(guó)條銹病發(fā)生表現(xiàn)出爆發(fā)頻率高、范圍廣、危害逐年加重、發(fā)病時(shí)間早等特點(diǎn)。因此， 從小麥野生近緣種屬、稀有種和地方小麥中發(fā)掘新的抗條銹病基因，并有效利用，選育推廣新的抗條銹病品種，已經(jīng)成為我國(guó)小麥抗條銹病育種中重要任務(wù)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在分子選擇輔助育種領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。分子標(biāo)記技術(shù)能夠在基因水平上對(duì)作物種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)和鑒定，同時(shí)為抗病基因的定位、克隆和聚合提供了依據(jù)。正是由于分子標(biāo)記技術(shù)較傳統(tǒng)標(biāo)記手段具有速度快，標(biāo)記位點(diǎn)多，共顯性，不易受環(huán)境影響的特點(diǎn)，所以，近年來(lái)分子標(biāo)記技術(shù)得到了迅速發(fā)展的。目前，主要利用RAPD、SSR、AFLP, RGAP, RFLP等幾種DNA分子標(biāo)記技術(shù)在50個(gè)正式命名的抗條銹病主效基因和暫定名的抗條銹主效基因中已經(jīng)找到了與48個(gè)抗條銹基因連鎖的分子標(biāo)記。在所有的標(biāo)記技術(shù)中，Litt等于1989年開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性高和等位基因多樣性高等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳多樣性、種質(zhì)資源鑒定、遺傳作圖、基因定位及分子標(biāo)記育種等研究方面得到了廣泛的應(yīng)用。目前利用該技術(shù)已成功篩選和鑒定多個(gè)條銹病抗性基因，例如 Yr2、Yr5、Yr24、Yr26、Yr30、Yr33、Yr34、Yr36、YrZH84、YrSph 等。但基于單一或少數(shù)組合的分離群體而得到的條銹病抗性基因連鎖標(biāo)記，通用性常受品種背景的限制；而且多數(shù)標(biāo)記距目標(biāo)基因較遠(yuǎn)，導(dǎo)致這些標(biāo)記在育種中的應(yīng)用不多。來(lái)自中國(guó)四川的地方小麥品種儀隴坨麥，經(jīng)多年多點(diǎn)田間條銹病抗性鑒定表明，該種質(zhì)對(duì)我國(guó)目前條銹病菌流行生理小種具有良好抗性。遺傳分析表明，儀隴坨麥含有一對(duì)能夠抗我國(guó)條中31、32和33混合生理小種的顯性基因。因此，篩選該抗性基因連鎖分子標(biāo)記，有望直接應(yīng)用于小麥抗病品種的選育，以提高選擇效率和加快小麥抗病育種進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本申請(qǐng)的發(fā)明人提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的之一是提供與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的目的之二是提供獲得上述與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法。本發(fā)明的目的之三是提供上述與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)上述研究背景，以儀隴坨麥/臺(tái)長(zhǎng)29的F2群體為作圖群體，通過(guò)抗病性鑒定結(jié)果和SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)間的連鎖分析，獲得了與小麥條銹病抗性基因連鎖的標(biāo)記Xgpw7342_35一，該標(biāo)記可應(yīng)用于小麥條銹病抗病品種的輔助選擇育種。 根據(jù)本發(fā)明的與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記Xgpw7342_35(lbp,通過(guò)使用SSR引物:正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’擴(kuò)增而得，所述分子標(biāo)記的大小為350bp，其定位在小麥7B短臂上，遺傳距離為1.8cM。本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記在鑒定小麥抗條銹病方面的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例方式，以抗病品種儀隴坨麥與感病品種臺(tái)長(zhǎng)29為親本的雜交組合的高代(F3)單個(gè)小麥株系(L1-L4)對(duì)象,通過(guò)檢測(cè)其特異分子標(biāo)記Xgpw7342_35(lbp的帶型數(shù)據(jù)，結(jié)合田間抗病鑒定表型數(shù)據(jù)，可以預(yù)測(cè)該株系對(duì)小麥條銹病的抗性。根據(jù)本發(fā)明的鑒定小麥抗條銹病的方法包括使用SSR引物:正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’ 進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。根據(jù)本發(fā)明的獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法，所述方法包括以下步驟:(I)以感病小麥品種臺(tái)長(zhǎng)29為母本，以四川省地方小麥品種儀隴坨麥為父本，構(gòu)建F2和F2:3遺傳作圖群體，構(gòu)建的F2群體為抗條銹病基因遺傳作圖群體；(2)用CTAB方法提取小麥親本幼苗及其F2群體單株DNA ；(3)采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行小麥條銹病抗性分子標(biāo)記的篩選，其中，使用 SSR 引物 Xgpw7342_350bP (正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3，;反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’)擴(kuò)增抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體，經(jīng)過(guò)連鎖性鑒定，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與小麥條銹病抗性基因相連鎖。根據(jù)本發(fā)明的獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法，其中，采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行篩選與小麥抗條銹病基因相連鎖分子標(biāo)記的方法是:(I)使用SSR引物在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體中進(jìn)行DNA多態(tài)性分析；

(2)對(duì)儀隴坨麥與感病親本臺(tái)長(zhǎng)29雜交獲得的F2單株抗性進(jìn)行田間鑒定，調(diào)查F2單株的抗病性，提取&群體單株DNA，用與步驟(I)同樣的反應(yīng)體系、引物及程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)抗、感株系標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計(jì)算交換值，用MAPMARKER/EXP 3.0b計(jì)算標(biāo)記與抗條銹病基因之間的遺傳距離。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明所提供的與小麥條銹病抗性基因連鎖的SSR標(biāo)記Xgpw7342_35(lbp,是通過(guò)以下方法獲得的:
I)以感病小麥品種臺(tái)長(zhǎng)29為母本，抗病品種儀隴坨麥為父本，構(gòu)建F2遺傳作圖群體，對(duì)獲得的F2單株抗性進(jìn)行抗性鑒定。2)以CTAB方法提取親本、抗病基因池、感病基因池及F2群體單株DNA。3)根據(jù) GrainGenes (http://www.wheat, pw.usda.gov)上公布的 SSR 引物序列合成引物，PCR后采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)；4)利用條中31、32和條中33條銹病生理混合小種對(duì)儀隴坨麥與感病親本臺(tái)長(zhǎng)29雜交、自交獲得的F2單株抗性進(jìn)行田間鑒定，條銹病接種在兩葉一心的小麥苗，將條銹病菌人工接種至病害鑒定圃的誘發(fā)行上，通過(guò)自然傳播接種，當(dāng)誘發(fā)行完全發(fā)病時(shí)，測(cè)定F2單株的抗病性，調(diào)查級(jí)別分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、感(S)和高感(HS)五級(jí)。其中，測(cè)定病級(jí)為高抗(HR)、抗(R)或中抗的單株確定為抗病，而測(cè)定病級(jí)為中感或高感的單株確定為感病。5)利用條中31、32和條中33條銹病生理混合小種對(duì)儀隴坨麥與感病親本臺(tái)長(zhǎng)29雜交、自交獲得的F2:3株系抗性進(jìn)行田間鑒定，條銹病接種在分蘗期的小麥苗，將條銹病菌人工接種至病害鑒定圃的誘發(fā)行上，通過(guò)自然傳播接種，當(dāng)誘發(fā)行完全發(fā)病時(shí)，測(cè)定F2:3株系各單株抗病性，調(diào)查級(jí)別分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、感(S)和高感(HS)五級(jí)。其中，測(cè)定病級(jí)為高抗(HR)、抗(R)或中抗(MR)的單株確定為抗病，而測(cè)定病級(jí)為感(S)或高感(HS)的單株確定為感病。6)結(jié)合4)和5)結(jié)果，確定F2單株抗病性及攜帶抗病基因雜合性。7)用CTAB法提取小麥親本幼苗及其F2群體單株DNA ;并根據(jù)6)結(jié)果，分別篩選15個(gè)抗病基因純合F2單株和15個(gè)感病基因純合F2單株等量DNA混合，構(gòu)建抗病基因池和感病基因池。

8)采用SSR分子標(biāo)記方法進(jìn)行小麥條銹病抗性基因分子標(biāo)記的篩選，其具體獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法是:(I)SSR引物在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及其它們的F2單株間DNA多態(tài)性分析:用SSR 標(biāo)記技術(shù)篩選,根據(jù) GrainGenes (http://www.wheat, pw.usda.gov)上公布的SSR引物序列合成引物，在AB1-9700 PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:50ng/y I 小麥基因組DNA 1.0 μ 1,10XPCR Buffer (with Mg2+) 2.0 μ 1,2.5mM dNTPl.6μ I,100 μ M 引物 1.0 μ 1,2.5υ/μ I Taq DNA 聚合酶 0.3 μ 1，ddH20 13.1 μ 1，總體系 20 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 V變性5分鐘，94 V變性30秒，60 V退火30秒，72 °C延伸I分鐘，40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；產(chǎn)物檢測(cè):6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，點(diǎn)擊緩沖液為1XTBE，恒定功率80瓦。凝膠染色采用硝酸銀染色；照相并在白光燈箱上記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)分子標(biāo)記的連鎖性鑒定:根據(jù)連鎖遺傳定律，按照MapmakerEXP3.0b軟件要求，將抗病親本儀隴坨麥和抗病基因池相同的帶型賦值為“A”，與感病親本臺(tái)長(zhǎng)29和感病基因池相同的帶型賦值為“B”，同時(shí)擴(kuò)增出抗病親本、抗病基因池和感病親本、感病基因池兩種帶型的賦值為“H”，帶型不清楚或缺失的賦值為結(jié)合4)田間抗病性鑒定結(jié)果，用Kosambi函數(shù)算出遺傳距離。9) 篩選出一個(gè)SSR分子標(biāo)記Xgpw7342_35(lbp (正向弓丨物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’)，擴(kuò)增抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體，發(fā)現(xiàn)在350bp處存在一標(biāo)記，經(jīng)過(guò)連鎖性鑒定，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與小麥條銹病抗性基因連鎖。SR分子標(biāo)記Xgpw7342_35(lbp在抗性基因輔助選擇的應(yīng)用，其具體的方法是:(I)利用條中31、32和條中33條銹病生理混合小種對(duì)抗病品種儀隴坨麥與感病品種川農(nóng)16為親本的雜交組合的高代(F5)4個(gè)小麥株系(Ll-L4)、4個(gè)與抗病品種儀隴坨麥不同的四川地方小麥品種(包括:巴中挖麥、開(kāi)江白麥子、宜賓豬JL麥、合江轉(zhuǎn)載小麥)、 ο個(gè)與抗病品種儀隴挖麥無(wú)親緣關(guān)系的小麥育成品種(包括:內(nèi)麥8號(hào)、內(nèi)麥9號(hào)、川麥47、科成麥2號(hào)、川麥42、川農(nóng)16、川福5號(hào)、綿農(nóng)3號(hào)、綿陽(yáng)26、川麥22)抗性進(jìn)行田間鑒定，條銹病接種在兩葉一心的小麥苗，將條銹病菌人工接種至病害鑒定圃的誘發(fā)行上，通過(guò)自然傳播接種，當(dāng)誘發(fā)行完全發(fā)病時(shí)，測(cè)定抗病性，調(diào)查級(jí)別分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、感(S)和高感(HS)五級(jí)。其中，測(cè)定病級(jí)為高抗(HR)、抗(R)或中抗的材料確定為抗病，而測(cè)定病級(jí)為中感或高感的材料確定為感病。(2 )用SDS法提取(I)提及小麥材料DNA ；(3)分子標(biāo)記 Xgpw7342_35(lbp 在(2) DNA 多態(tài)性分析:SSR分子標(biāo)記Xgpw7342_35(lbp在AB1-9700PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:50ng/y I 小麥基因組 DNA 1.0 μ 1，10XPCR Buffer (with Mg2+) 2.0 μ 1,2.5mMdNTPl.6 μ 1，100 μ M 引物 1.0 μ 1，2.5υ/μ I Taq DNA 聚合酶 0.3 μ 1，ddH20 13.1 μ 1，總體系20 μ I。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94°C變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；產(chǎn)物檢測(cè):6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，點(diǎn)擊緩沖液為1XTBE，恒定功率80瓦。凝膠染色采用硝酸銀染色；照相并在白光燈箱上記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(4)利用分子標(biāo)記Xgpw7342_35Qbp對(duì)抗性基因的鑒定:在抗病親本、抗病基因池、及抗病品種儀隴坨麥與感病品種川農(nóng)16為親本的雜交組合的高代(F5)4個(gè)小麥株系(L1-L4)材料間擴(kuò)增出了一條350bp大小的多態(tài)性帶紋，而在感病親本、感病基因池、4個(gè)與抗病品種儀隴坨麥不同的四川地方小麥品種(包括:巴中坨麥、開(kāi)江白麥子、宜賓豬兒麥、合江轉(zhuǎn)載小麥)和10個(gè)與抗病品種儀隴挖麥無(wú)親緣關(guān)系的小麥育成品種(包括:內(nèi)麥8號(hào)、內(nèi)麥9號(hào)、川麥47、科成麥2號(hào)、川麥42、川農(nóng)16、川福5號(hào)、綿農(nóng)3號(hào)、綿陽(yáng)26、川麥22)中均不能擴(kuò)增出這一 350bp的特異帶型。因此，結(jié)合田間表型抗性鑒定結(jié)果，從而證實(shí)該抗性基因特異分子標(biāo)記Xgpw7342_35(lbp可以鑒定該抗性基因在小麥材料中的存在。本發(fā)明的積極性效果及應(yīng)用如下:1、本發(fā)明使用的PCR體系，不需要特殊的PCR儀器和特殊的反應(yīng)試劑，普通商業(yè)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品均能達(dá)到要求。2、本發(fā)明獲得的與條銹病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，是在對(duì)我國(guó)條銹病高抗的四川地方小麥品種儀隴坨麥及其遺傳作圖群體中獲得的新的標(biāo)記，該標(biāo)記與抗性基因遺傳距離近，PCR擴(kuò)增重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，可以用于小麥條銹病品種鑒定和小麥抗病后代的分子輔助選擇，進(jìn)而加快抗病品種的育種進(jìn)程。

3、為克隆小麥抗條銹病基因、基因序列分析以及轉(zhuǎn)抗條銹病基因小麥研究奠定了良好的基礎(chǔ)。


圖1顯示SSR標(biāo)記Xgpw7342_35Qbp在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及其F2群體中的擴(kuò)增。(RP為抗病親本儀隴坨麥；SP為感病親本臺(tái)長(zhǎng)29 ;RB為抗病基因池；SB為感病基因池；R為抗病表型；H為雜合型；S為感病表型；“ + ”為具有特異標(biāo)記
為無(wú)特異標(biāo)記帶；箭頭表示SSR標(biāo)記Xgpw7342_35(lbp)。圖2顯示SSR標(biāo)記Xgpw7342_35(lbp在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及抗病品種儀隴坨麥與感病品種川農(nóng)16為親本的雜交組合的高代(F5) 4個(gè)小麥株系(Ll-L4)、4個(gè)與抗病品種儀隴挖麥不同的四川地方小麥品種(包括:巴中挖麥、開(kāi)江白麥子、宜賓豬兒麥、合江轉(zhuǎn)載小麥)、10個(gè)與抗病品種儀隴坨麥無(wú)親緣關(guān)系的小麥育成品種(包括:內(nèi)麥8號(hào)、內(nèi)麥9號(hào)、川麥47、科成麥2號(hào)、川麥42、川農(nóng)16、川福5號(hào)、綿農(nóng)3號(hào)、綿陽(yáng)26、川麥22)的PCR擴(kuò)增。(RP為抗病親本儀隴坨麥；SP為感病親本臺(tái)長(zhǎng)29 ;RB為抗病基因池；SB為感病基因池；黑色實(shí)心箭頭表示SSR標(biāo)記Xgpw7342_35Qbp)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對(duì)本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所作的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:與四川地方小麥品種儀隴托坨麥條銹病抗性基因連鎖的SSR分子標(biāo)記Xgpw7342_350bP 的獲得1、供試材料 植物材料:以感病品種臺(tái)長(zhǎng)29為母本，抗病品種四川地方小麥儀隴坨麥為父本，構(gòu)建F2遺傳作圖群體。2010年正季將F2群體的152個(gè)單株種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)溫江試驗(yàn)基地病害鑒定圃，用于抗性鑒定。苗期取各單株的部分葉片，用于SSR分析。成熟時(shí)，收獲F2:3家系的種子，晾干保存，2011年用于抗性鑒定。條銹病菌混合生理小種:用于F2群體及F2:3家系抗性鑒定的條銹病菌混合生理小種由條中31、32和33三個(gè)小種等量混合組成。2、抗性鑒定田間試驗(yàn)設(shè)計(jì):2010年及2011年正季，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)溫江試驗(yàn)基地病害鑒定圃分別將感病品種臺(tái)長(zhǎng)29、抗病品種四川地方小麥儀隴坨麥及其F2群體和F2:3家系單粒播種，行長(zhǎng)2.0m,行距20cm，每行播種10粒，每間隔20行設(shè)置一行感病對(duì)照品種SY95-71，在鑒定圃周?chē)謩e種植I行用于條銹病誘發(fā)感病品種SY95-71和臺(tái)長(zhǎng)29?？剐澡b定:采用人工接種方式進(jìn)行田間抗性鑒定。當(dāng)小麥幼苗長(zhǎng)至二葉一心時(shí)用涂抹法對(duì)條銹病誘發(fā)感病品種SY95-71和感病親本臺(tái)長(zhǎng)29進(jìn)行單株人工接種。待感病親本臺(tái)長(zhǎng)29發(fā)病充分后，記載抗病性。按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行條銹病抗性鑒定:高抗(HR):無(wú)可見(jiàn)侵染；抗(R):僅產(chǎn)生枯死斑點(diǎn)或失綠反應(yīng),無(wú)夏孢子堆；中抗(MR):夏孢子堆較小，周?chē)锌菟阑蚴ЬG反應(yīng)；感(S):夏孢子堆中等，周?chē)鸁o(wú)枯死或失綠反應(yīng)；高感(HS):夏孢子堆大，周?chē)鸁o(wú)枯死或失綠反應(yīng)。
鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2群體中表現(xiàn)為感病的有35株，其后代F2:3株系表現(xiàn)均為感??；F2表現(xiàn)為抗病的有117株，其對(duì)應(yīng)的F2:3中全部植株表現(xiàn)為抗性的有39個(gè)株系，而表現(xiàn)為抗感分離的株系有78個(gè)。F2群體抗感分離比符合3:1，F(xiàn)2:3株系抗感分離比符合1:2:1，說(shuō)明抗病品種四川地方小麥儀隴坨麥攜帶了一個(gè)顯性主效抗條銹病基因。3、基因組DNA提取采用CTAB法提取基因組DNA。取2g新鮮幼嫩葉片，液氮研磨成細(xì)粉后加預(yù)熱至65 的 2XCTAB 提取液(2% CTAB, 1.4M NaCl,0.1MTris-HCl (pH8.0),0.1M EDTA (ρΗ8.0),臨用前加2% β -巰基·乙醇15ml，混勻。65°C水浴30_45min，其間輕搖混勻。冷卻至室溫后加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，輕輕混勻至上清液呈牛奶狀，4000rpm 離心 lOmin。取上清液，加等體積異丙醇，置于冰浴沉淀DNA。勾出DNA，用70%酒精洗2次，無(wú)水乙醇洗一次，氣干DNA，溶于適量pH8.0的TE溶液中。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。紫外分光光度法測(cè)定各樣品DNA濃度，將各樣品DNA稀釋至50ng/ μ I備用。4、SSR 分析根據(jù)GrainGenes (http://www.wheat, pw.usda.gov)上公布的 SSR 引物序列合成引物(由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成)，在AB1-9700 PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下:1) PCR 反應(yīng)體系(20 μ I)
權(quán)利要求
1.小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記通過(guò)使用以下述的 SSR 引物 Xgpw7342_350bp擴(kuò)增而得，正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5， -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3，。
2.權(quán)利要求1所述的與小麥抗體銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記在鑒定小麥品種抗條銹病方面的應(yīng)用。
3.一種鑒定小麥抗條銹病的方法，其特征在于，所述方法包括使用SSR引物 Xgpw7342_350bp:正向引物:5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’ 進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。
4.一種獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)以感病小麥品種臺(tái)長(zhǎng)29為母本，以四川地方小麥品種儀隴坨麥為父本，構(gòu)建F2和F213遺傳作圖群體，構(gòu)建的F2群體為抗條銹病基因遺傳作圖群體； (2)用CTAB方法提取小麥親本幼苗及其F2群體單株DNA； (3)采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行小麥條銹病抗性分子標(biāo)記的篩選，其中，使用SSR弓丨物Xgpw7342_350bp擴(kuò)增抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體，經(jīng)過(guò)連鎖性鑒定，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與小麥條銹病抗性基因相連鎖，所述 SSR 引物 Xgpw7342_350bp 包括正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ 和反向引物:5， -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3，。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行篩選與小麥抗條銹病基因相連鎖分子標(biāo)記的方法是: (1)使用SSR引物在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體中進(jìn)行DNA多態(tài)性分析； (2)分子標(biāo)記的連鎖性分析:對(duì)儀隴坨麥與感病親本臺(tái)長(zhǎng)29雜交獲得的F2單株抗性進(jìn)行田間鑒定，調(diào)查F2單株的抗病性，提取F2群體單株DNA，用與前面同樣的反應(yīng)體系、引物及程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)抗、感株系標(biāo)記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計(jì)算交換值，計(jì)算標(biāo)記與抗條銹病基因之間的遺傳距離。
全文摘要
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程和小麥抗病遺傳育種領(lǐng)域，具體地涉及與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標(biāo)記、其獲得方法及應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是根據(jù)連鎖分離規(guī)律，以臺(tái)長(zhǎng)29/儀隴坨麥的F2群體為作圖群體，通過(guò)田間條銹病抗性鑒定結(jié)果和SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)間的連鎖分析，獲得了與小麥條銹病抗性基因連鎖的SSR標(biāo)記Xgpw7342-350bp(正向引物5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’；反向引物5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’)。該標(biāo)記可用于小麥抗條銹病的輔助選擇育種，可克服常規(guī)育種中小麥條銹病抗性鑒定易受環(huán)境影響、穩(wěn)定性和重復(fù)性較差、工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、育種周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，進(jìn)而簡(jiǎn)化選擇方法，提高育種效率，加快小麥抗條銹病品種的育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103088016SQ20121047925
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者鄭有良, 陳國(guó)躍, 陳時(shí)盛, 魏育明, 蘭秀錦, 劉亞西, 代壽芬 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)