專利名稱：乙酰乳酸合成酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物遺傳育種領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及乙酰乳酸合成酶突變體及其應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及乙酰乳酸合成酶突變體、分離的核酸、表達(dá)盒、載體或細(xì)胞、獲得具有除草劑抗性的植物的方法以及由權(quán)利要求8或9所述方法獲得的植物的鑒定方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)田中雜草是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力資源和成本很高，而且不便于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)，嚴(yán)重制約了農(nóng)作物種植向高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低成本方向的發(fā)展進(jìn)程。因此，除草劑就運(yùn)應(yīng)而生。然而，除草劑通常也能殺死農(nóng)作物本身，因此對(duì)一般不具有除草劑抗性(耐受性)的農(nóng)作物而言，除草劑的使用在時(shí)間和空間上受到了極大限制。為此，人們研究開發(fā)具有除草劑抗性(耐受性)的植物(農(nóng)作物)，這樣可以在種植 期間使用除草劑，殺死雜草，但不影響植物本身的生長(zhǎng)，由此拓寬了除草劑的使用范圍。然而，具有除草劑抗性的植物及其起決定性的物質(zhì)(如蛋白、基因等)目前還沒(méi)有理論來(lái)定向設(shè)計(jì)出。因此，目前尋找使植物具有除草劑抗性的蛋白質(zhì)并對(duì)其加以應(yīng)用的方法仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種新的使植物具有除草劑抗性的蛋白質(zhì)，以及將其應(yīng)用于具有除草劑。為此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種乙酰乳酸合成酶突變體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與野生型乙酰乳酸合成酶相比，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體的Alal73和Trp542的至少之一具有突變。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人分離到乙酰乳酸合成酶的新突變體，并分析確定了該突變體能夠使植物具備除草劑抗性，從而通過(guò)使植物表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體，能夠該植物具備除草劑抗性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提出了一種分離的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該分離的核酸編碼前面所述的乙酰乳酸合成酶突變體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將本發(fā)明分離到的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸導(dǎo)入植物，使其表達(dá)前述本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體，能夠使該植物具備除草劑抗性。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種表達(dá)盒、載體或細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該表達(dá)盒、載體或細(xì)胞包含前面所述的本發(fā)明的核酸。由此，利用本發(fā)明的表達(dá)盒和載體能夠有效地將本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸導(dǎo)入植物，使該植物表達(dá)前述本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體，從而使其具備除草劑抗性。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的細(xì)胞能夠表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體，具備除草劑抗性，經(jīng)培養(yǎng)后能夠有效地成為具備除草劑抗性的植物。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的乙酰乳酸合成酶突變體、核酸以及表達(dá)盒、載體或細(xì)胞，在獲得具有除草劑抗性的植物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，如前所述，利用本發(fā)明的表達(dá)盒、載體及細(xì)胞能夠有效地獲得具備除草劑抗性的植物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種獲得具有除草劑抗性的植物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法通過(guò)下列途徑的至少之一實(shí)現(xiàn)(1)使植物包含本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸；(2)使植物表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用該方法能夠有效地獲得具備除草劑抗性的植物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提出了一種由前面所述的獲得具有除草劑抗性的植物的方法而獲得的植物的鑒定方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括如下步驟的至少之一 (I)測(cè)定所述植物是否包含本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸；(2 )測(cè)定所述植物是否表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體。由此，利用該方法，能夠有效地鑒定通過(guò)本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的植物的方法而獲得的植物是否具備除草劑抗性。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體及其應(yīng)用，是本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)艱苦的創(chuàng)造性勞動(dòng)和優(yōu)化的工作而完成的。 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的2株玉米京21號(hào)乙酰乳酸合成酶突變植株。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。首先，需要說(shuō)明的是，乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS),其酶分類編號(hào)為EC4，I. 3. 18。乙酰乳酸合成酶是支鏈氨基酸合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶，如在纈氨酸和亮氨酸的合成中催化丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在異亮氨酸的合成中催化丙酮酸與丁酮酸生成2-乙醛基-2-羥基丁酸。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ALS突變蛋白在不同植物(包括玉米、小麥、水稻、油菜、和向日葵等)的同源蛋白的第122、155、197、205、574、653、和/或654等位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生突變，從而使得相應(yīng)植物對(duì)咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑嘧啶類和嘧啶水楊酸類等除草劑產(chǎn)生抗性(可參見(jiàn) Tan S，Evzns R R, Dahmer M L, et al. Imidazolinone-tolerant crops:History,current status and Future. Pest Management Science. 2005，61:246—257 ;Tan Sj EvznsR R，Dahmer M L，et al. Imidazolinone-tolerant crops:History，current status andFuture [J] · Pest Management Science. 2005，61:246-257，通過(guò)參照將其全文并入本文)。然而，沒(méi)有報(bào)道表明，在來(lái)自玉米的ALS的第173或542位突變，會(huì)使得相應(yīng)植物(尤其是玉米)具有除草劑抗性。然而，本發(fā)明的發(fā)明人從突變的玉米植株中發(fā)現(xiàn)并分離得到了在第173或542位具有突變的新的乙酰乳酸合成酶突變體，且發(fā)現(xiàn)這些突變能夠使植物具備除草劑抗性。乙酰乳酸合成酶突變體及其編碼核酸為此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種乙酰乳酸合成酶突變體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與野生型乙酰乳酸合成酶相比，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體的Alal73和Trp542的至少之一具有突變。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人分離到乙酰乳酸合成酶的新突變體，并分析確定了該突變體能夠使植物具備除草劑抗性，從而通過(guò)使植物表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體，能夠使該植物具備除草劑抗性。目前，以抑制ALS為靶位的除草劑包括磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類等除草劑。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體能夠使植物對(duì)上述除草劑均具備抗性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體能夠使植物具備良好的咪唑啉酮類除草劑抗性，尤其是咪草煙抗性。其中咪草煙的化學(xué)名稱為(RS)5-乙基-2- (4-異丙基-4-甲基-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)煙酸，CAS號(hào)為81335_77_5。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體的Alal73和Trp542突變的突變類型不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，與野生型乙酰乳酸合成酶相比，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體具有選自下列的至少一種突變Alal73Val和Trp542Cys，即從野生型乙酰乳酸合成酶氨基酸序列的第173位的Ala突變?yōu)閂al或第542位的Trp突變?yōu)镃ys。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體具有SEQ ID NO 2或4所示的氨基酸序列。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，在蛋白質(zhì)序列已知的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力通過(guò)改變已知蛋白質(zhì)的編碼基因序列并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，就可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，北京科學(xué)出版社，2002年，通過(guò)參照將其全文并入本文)等文獻(xiàn)中，因此，除了上述列舉的SEQ ID N0:2或4所示的氨基酸序列之外，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體還可以包括對(duì)前述氨基酸序列進(jìn)行氨基酸取代、添加或缺失而不影響其性質(zhì)的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提出了一種分離的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該分離的核酸編碼前面所述的乙酰乳酸合成酶突變體。其中，在本文中，有時(shí)也將本發(fā)明的核酸稱為本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將本發(fā)明分離到的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸導(dǎo)入植物，能夠使其表達(dá)前述本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體，從而能夠使該植物具備除草劑抗性。在本文中，本發(fā)明的分離的核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與乙酰乳酸合成酶突變體的編碼基因相對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA，優(yōu)選DNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與野生型乙酰乳酸合成酶基因相t匕，本發(fā)明的分離的核酸具有選自下列的至少一種突變c.C518T和C.G1626T。其中，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，本發(fā)明的分離的核酸具有SEQ ID NO :1或3所示的核苷酸序列。此夕卜，在知曉所編碼蛋白序列或核酸序列的前提下，通過(guò)常規(guī)的密碼子對(duì)應(yīng)關(guān)系和宿主表達(dá)頻率，運(yùn)用PCR方法、DNA重組法或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力獲得并優(yōu)化編碼本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體的核酸。進(jìn)而，獲得本發(fā)明的核酸后，可以將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)的宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖，從中分離得到大量的核酸。表達(dá)盒、載體或細(xì)胞
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種表達(dá)盒、載體或細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該表達(dá)盒、載體或細(xì)胞包含前面所述的本發(fā)明的核酸。由此，利用本發(fā)明的表達(dá)盒和載體能夠有效地將本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸導(dǎo)入植物，使該植物表達(dá)前述本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體，從而使其具備除草劑抗性。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的細(xì)胞能夠表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體，具備除草劑抗性，經(jīng)培養(yǎng)后能夠有效地成為具備除草劑抗性的植物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選地，本發(fā)明的表達(dá)盒適于在植物中表達(dá)本發(fā)明的核酸。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，本發(fā)明的表達(dá)盒在5’ -3’的轉(zhuǎn)錄方向上依次包含啟動(dòng)子區(qū)、本發(fā)明的核酸以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，在本發(fā)明的表達(dá)盒中，啟動(dòng)子可以選自CaMV 35S啟動(dòng)子、稻肌動(dòng)蛋白I基因、玉米醇脫氫酶基因、玉米矮縮I基因和煙草花葉病毒(TMV) Ω元件的啟動(dòng)子的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，在本發(fā)明的表達(dá)盒中，轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止區(qū)可以包括轉(zhuǎn)錄終止元件或多聚腺苷酸化信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的表達(dá)盒可以進(jìn)一步包括在細(xì)菌中復(fù)制所需的復(fù)制起點(diǎn)(例如，來(lái)自pBR322或P15A ori的ORI區(qū))，以及土壤桿菌T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的元件(例如，T-DNA的左邊界和/或右邊界)，從而方便從細(xì)菌往植物中的轉(zhuǎn)化過(guò)程。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，本發(fā)明的表達(dá)盒還可以進(jìn)一步包括增強(qiáng)子、內(nèi)含子、多克隆位點(diǎn)、操縱基因、阻遏物結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，例如可以采用選自TMV、玉米褪綠斑點(diǎn)病毒(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列的至少之一作為增強(qiáng)子,可以采用選自Adh Ubronze I、肌動(dòng)蛋白I和肌動(dòng)蛋白2的至少之一作為內(nèi)含子。需要說(shuō)明的是，在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、動(dòng)物病毒及其它各種病毒載體。根據(jù)所應(yīng)用的目的不同，載體可以分為克隆載體、表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化載體，其目的分別為針對(duì)克隆并驗(yàn)證基因、表達(dá)相應(yīng)基因和將相應(yīng)基因轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的載體可以包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)用的載體(原核表達(dá)載體)、在酵母中表達(dá)用的載體(如畢赤酵母載體)、在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用的載體(痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達(dá)用的植物病毒載體以及在哺乳動(dòng)物乳腺中表達(dá)用的各種載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的載體可以為轉(zhuǎn)化載體，優(yōu)選為植物轉(zhuǎn)化載體，更優(yōu)選為適合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的細(xì)胞的類型不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。需要說(shuō)明的是，前述的“植物細(xì)胞”是指來(lái)自植物的細(xì)胞(可以包括細(xì)胞群，但優(yōu)選是單個(gè)細(xì)胞)，但是這些細(xì)胞不能僅僅借助光合作用而以水、二氧化碳和無(wú)機(jī)鹽等無(wú)機(jī)物合成碳水化合物、蛋白質(zhì)來(lái)發(fā)育成存活的單個(gè)植株。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸可以被插入任何適于轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞的載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，尤其是用于克隆或儲(chǔ)存核酸、或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞，例如農(nóng)桿菌、大腸桿菌，包括根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌等。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，本發(fā)明的細(xì)胞是植物細(xì)胞，優(yōu)選玉米細(xì)胞，更優(yōu)選京21玉米細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，前述植物細(xì)胞中包含的本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸可以是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入植物細(xì)胞的，例如可以導(dǎo)入到植物細(xì)胞的核、葉綠體、線粒體和/或質(zhì)體中，也可以是通過(guò)突變技術(shù)使得本發(fā)明的核酸存在于植物細(xì)胞中的。用途根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的乙酰乳酸合成酶突變體、核酸以及表達(dá)盒、載體或細(xì)胞，在獲得具有除草劑抗性的植物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，如前所述，利用本發(fā)明的表達(dá)盒、載體及細(xì)胞能夠有效地獲得具備除草劑抗性的植物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本文中所述的除草劑為以抑制ALS為靶位的除草劑，例如磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類等除草劑,優(yōu)選咪唑啉酮類除草劑抗性，更優(yōu)選咪草煙?；谇笆龅挠猛荆鶕?jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種獲得具有除草劑抗性的植物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的植物的方法可 以通過(guò)下列途徑的至少之一實(shí)現(xiàn)(1)使植物包含本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸；(2)使植物表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠有效地獲得具備除草劑抗性的植物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的植物的方法所適用的植物的種類不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的方法對(duì)是單、雙子葉植物均適用，尤其適用于水稻、小麥、油菜、玉米、棉花、谷子和苜蓿，更優(yōu)選玉米。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過(guò)本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的植物的方法獲得的植物，對(duì)以抑制ALS為靶位的除草劑例如磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類等除草劑具有良好的耐受性，其中，優(yōu)選咪唑啉酮類，更優(yōu)選咪草煙。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，獲得具有除草劑抗性的植物的方法的途徑及具體步驟不受特別限制，只要通過(guò)上述的途徑之一即可實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，可以通過(guò)制備、培育、生產(chǎn)或以其他方式產(chǎn)生獲得具有除草劑抗性的植物，具體地，包括通過(guò)轉(zhuǎn)基因育種方式獲得，例如將本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸轉(zhuǎn)化入植物后使之表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體；也包括通過(guò)非轉(zhuǎn)基因育種方式獲得，如通過(guò)雜交、回交、自交或無(wú)性繁殖獲得植物后分選出仍舊包含本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸并表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體的植物。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，可以通過(guò)選自轉(zhuǎn)基因、雜交、回交、自交和無(wú)性繁殖的至少之一獲得具有除草劑抗性的植物。其中，上述各步驟對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，都是可以獲知并實(shí)施的。由此，利用本發(fā)明的上述方法能夠有效地獲得具有除草劑抗性的植物。鑒定方法根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提出了一種由本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的植物的方法而獲得的植物的鑒定方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括如下步驟的至少之一 (I)測(cè)定所述植物是否包含本發(fā)明的編碼乙酰乳酸合成酶突變體的核酸；(2 )測(cè)定所述植物是否表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體。由此，通過(guò)該方法，能夠有效判斷植物是否屬于通過(guò)本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的植物的方法獲得的植物，即能夠有效地鑒定通過(guò)本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的植物的方法而獲得的植物是否具備除草劑抗性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，鑒定的步驟不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，可以通過(guò)常規(guī)的核酸檢測(cè)和/或蛋白質(zhì)檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行，只要能夠?qū)χ参锏囊阴Ｈ樗岷铣擅富蚱渚幋a核酸進(jìn)行檢測(cè)即可，具體地，要能夠檢測(cè)出植物的乙酰乳酸合成酶是否攜帶有Alal73或Trp542突變或其編碼核酸是否具有相應(yīng)核酸突變即可，優(yōu)選通過(guò)能夠檢測(cè)出Alal73Val或Trp542Cys突變或其相應(yīng)核酸突變的方法進(jìn)行鑒定。根據(jù)本發(fā)明一些具體示例，可以通過(guò)選自蛋白質(zhì)測(cè)序、核酸測(cè)序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)和探針雜交檢測(cè)的至少之一對(duì)通過(guò)本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的植物的方法而獲得的植物進(jìn)行鑒定。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，由本發(fā)明的獲得具有除草劑抗性的植物的方法而獲得的植物的鑒定方法所適用的植物的種類不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，上述鑒定方法對(duì)單、雙子葉植物均適用，尤其適用于水稻、小麥、油菜、玉米、棉花、谷子和苜蓿，更優(yōu)選玉米。下面參考具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，需要說(shuō)明的是，這些實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，例如可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例I :抗咪唑啉酮類除草劑突變體遺傳分離分析將玉米自交系京21播種5畝地，播種量5000kg/畝。在授粉季節(jié)，將雄花和雌花分別套袋，收集新鮮雄花花粉，用含有O. 067% (w/w)甲磺酸乙酯(EMS)濃度的石蠟油處理花粉45分鐘，其中花粉與石蠟油體積比約為1:10，然后在處理完30分鐘內(nèi)將花粉與石蠟油的混合物涂到雌花花絲上并套袋。待植株成熟后收獲。然后，將收獲的種子用咪唑啉酮類除草劑咪草煙((RS) 5-乙基-2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)煙酸，CAS號(hào)81335-77-5)水劑(濃度為O. 5%，購(gòu)自山東先達(dá)化工有限公司)浸泡18小時(shí)，浙干水分后播種于試驗(yàn)田。10天后觀察玉米種子萌發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)其中有2株綠色秧苗持續(xù)生長(zhǎng)(見(jiàn)圖I)，保留并繁殖該綠色秧苗，其為抗咪唑啉酮類除草劑的京21號(hào)突變植株。分別取上述各京21號(hào)突變植株(突變植株I和突變植株2)的葉片，并以野生型京21號(hào)植株為對(duì)照，分別提取基因組DNA，并委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變植株I相對(duì)于野生型京21號(hào)，在乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的第518位點(diǎn)發(fā)生突變，由C變?yōu)門，導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白的第173位由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，即該突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO 2所示；突變植株2相對(duì)于野生型京21號(hào)，在ALS基因的第1626位點(diǎn)發(fā)生突變，由G變?yōu)門，導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白的第542位由色氨酸變?yōu)榘腚装彼?，即該突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。上述來(lái)自京21號(hào)的突變ALS蛋白質(zhì)即為本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體。實(shí)施例2乙酰乳酸合成酶突變體的抗咪唑啉酮類除草劑的離體活性測(cè)定·參照Fan ZJ 等的方法(Specific activity determination of acetolactatesynthase from maize, Zea mays L.,通過(guò)參照將其全文并入本文)，以及參見(jiàn)Han WN等編著的書(The Proceedings of the 18 th Asia-Pacific Weed Science SocietyConference. 515-522. May 28-June 2, 2001. Bei jing Standards Press of China·,通過(guò)參照將其全文并入本文)，提取實(shí)施例I中的京21號(hào)的野生型和各突變植株的ALS酶(即乙酰乳酸合成酶)，并測(cè)定相應(yīng)酶活性被咪唑啉酮類除草劑抑制的比率。具體步驟如下分別取各植株苗5g切碎后，加入IOmL pH 7的50mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(其中含 lmmol/L 丙酮酸鈉,O. Smmol /T, MgCl2,0. Smmol /T, TPP, 10 μ mol/L FAD),然后用石英砂研磨粉碎后用8層紗布過(guò)濾，濾液于4°C、20000rpm離心30分鐘。取上清液，加入硫酸銨使之達(dá)到50%飽和度，然后0°C放置2小時(shí)后，于4°C、20000rpm離心30分鐘。棄上清液，將沉淀溶解于5mL pH 7的50mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(其中含20mmol/L丙酮酸鈉，O. 5mmol/L MgCl2),分別得各植株的ALS酶液。然后，將O. ImL O. 5%咪草煙水劑(對(duì)照用水替代)、0. 5mL 酶反應(yīng)液(其中含 24mmol/L 丙酮酸鈉，O. 6mmol/L MgCl2, lmmol/L TPP,20ymol/LFAD, 50mmol/L K2HPO4-KH2PO4, pH 7)和 0. 4mLALS 酶液混合，與 35°C避光靜置反應(yīng) I 小時(shí)，然后加入O. ImL 3mol/L硫酸終止反應(yīng)，于60°C放置15分鐘脫羧。然后加入顯色劑(O. 5ml O.5% (w/w)肌酸和O. 5ml 5% (w/w) α -萘酚的混合溶液(溶于2. 5mol/L的NaOH溶液)于60°C放置15分鐘顯色，測(cè)定525nm處的吸光度。將加入對(duì)照的野生型京21號(hào)的ALS酶活性分別記為100%，計(jì)算咪唑啉酮類除草劑對(duì)來(lái)源于京21號(hào)的野生型乙酰乳酸合成酶和各突變乙酰乳酸合成酶的活性的影響。結(jié)果如下表所示，京21號(hào)的各突變ALS酶都基本保持了野生型ALS酶的活性，而且在存在咪唑啉酮類除草劑的情況下，野生型ALS酶的活性都有十分顯著的下降，而各突變ALS酶卻都保持了原有酶活性，表明突變ALS酶能夠帶來(lái)抗咪唑啉酮類除草劑的性能。咪唑啉酮類除草劑對(duì)京21號(hào)的野生型和突變ALS酶活性的影響表
除草劑濃度__O__0.5%
野生型ALS的相對(duì)酶 100%18%
活性突變植株I的ALS的93%90%
相對(duì)酶活性
突變植株2的ALS的108%101%
相對(duì)酶法性實(shí)施例3轉(zhuǎn)蛋白突變體基因的轉(zhuǎn)基因植物的獲得發(fā)明人委托北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司用常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來(lái)源于實(shí)施例I中的京21號(hào)乙酰乳酸合成酶突變植株的突變ALS酶的編碼基因(SEQ ID NO 1和3)分別轉(zhuǎn)入野生型擬南芥植株，具體步驟如下利用正向引物(5，-CCGTCCGGTCTGTAGCGTGTAC-3’SEQ ID NO :5)和反向引物(5，-CATAACAGATAGCTGACGGCCTAC-3’ SEQ ID NO :6)，分別從上述京 21 號(hào)的各突變植株的基因組DNA中PCR擴(kuò)增出突變ALS基因，測(cè)序正確后，將核苷酸序列如SEQ IDNO 1和3所示的ALS基因克隆入pCAMBIA1303質(zhì)粒(購(gòu)自Cambia公司)中，挑選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL0，培養(yǎng)菌體并轉(zhuǎn)化擬南芥，PCR鑒定轉(zhuǎn)化陽(yáng)性的擬南芥收種后得到Tl代的轉(zhuǎn)基因種子，種植時(shí)用咪唑啉酮類除草劑咪草煙噴霧處理，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而未轉(zhuǎn)基因的擬南芥苗全部枯死。由此，獲得具有咪唑啉酮類除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥。
在本說(shuō)明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
權(quán)利要求
1.一種乙酰乳酸合成酶突變體，其特征在于，與野生型乙酰乳酸合成酶相比，所述乙酰乳酸合成酶突變體的Alal73和Trp542的至少之一具有突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乙酰乳酸合成酶突變體，其特征在于，與野生型乙酰乳酸合成酶相比，所述乙酰乳酸合成酶突變體具有選自下列的至少一種突變Alal73Val和Trp542Cys0
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的乙酰乳酸合成酶突變體，其特征在于，所述乙酰乳酸合成酶突變體具有SEQ ID NO :2或4所示的氨基酸序列。
4.一種分離的核酸，其特征在于，所述分離的核酸編碼權(quán)利要求Γ3任一項(xiàng)所述的乙酰乳酸合成酶突變體， 任選地，與野生型乙酰乳酸合成酶基因相比，所述分離的核酸具有選自下列的至少一種突變c. C518T 和 c. G1626T。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的核酸，其特征在于，所述分離的核酸具有SEQID NOI或3所示的核苷酸序列。
6.—種表達(dá)盒、載體或細(xì)胞,其包含權(quán)利要求4或5所述的核酸。
7.權(quán)利要求Γ3任一項(xiàng)所述的乙酰乳酸合成酶突變體、權(quán)利要求4或5所述的核酸以及權(quán)利要求6所述的表達(dá)盒、載體或細(xì)胞，在獲得具有除草劑抗性的植物中的用途， 任選地，所述除草劑為咪唑啉酮類除草劑，優(yōu)選咪草煙。
8.一種獲得具有除草劑抗性的植物的方法，其特征在于，通過(guò)下列途徑的至少之一實(shí)現(xiàn) (1)使所述植物包含權(quán)利要求4或5所述的核酸； (2)使所述植物表達(dá)權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述的乙酰乳酸合成酶突變體， 優(yōu)選地，所述植物為水稻、小麥、油菜、玉米、棉花、谷子和苜蓿的至少一種，更優(yōu)選地，所述植物為玉米， 任選地，所述除草劑為咪唑啉酮類除草劑，優(yōu)選咪草煙。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，通過(guò)選自轉(zhuǎn)基因、雜交、回交、自交和無(wú)性繁殖的至少之一獲得具有除草劑抗性的植物。
10.一種由權(quán)利要求8或9所述方法獲得的植物的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟的至少之一 (1)測(cè)定所述植物是否包含權(quán)利要求4或5所述的核酸； (2)測(cè)定所述植物是否表達(dá)權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述的乙酰乳酸合成酶突變體， 優(yōu)選地，所述植物為水稻、小麥、油菜、玉米、棉花、谷子和苜蓿的至少一種，更優(yōu)選地，所述植物為玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開了乙酰乳酸合成酶突變體及其應(yīng)用。其中，與野生型乙酰乳酸合成酶相比，本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體的Ala173和Trp542的至少之一具有突變。通過(guò)使植物表達(dá)本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶突變體，能夠該植物具備除草劑抗性。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102936591SQ20121047935
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者黃拔嚴(yán), 石久英 申請(qǐng)人:北京興博雅生物技術(shù)有限公司