專利名稱：高活熱穩(wěn)定性納豆激酶菌株及其發(fā)酵制品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物領域，特別是涉及一種新的高活、熱穩(wěn)定性納豆激酶生產(chǎn)菌株及其在發(fā)酵生產(chǎn)納豆及納豆激酶方面的應用，本發(fā)明還涉及該菌株產(chǎn)生的發(fā)酵制品。
背景技術：
納豆激酶(nattokinase,NK)是由納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus natto)分泌表達的高效纖維蛋白溶解酶，最早從傳統(tǒng)的日本大豆發(fā)酵產(chǎn)品納豆中發(fā)現(xiàn)。與臨床應用的溶栓藥物相比，具有溶纖活性高、安全可靠、無毒副作用、半衰期長、在胃腸道中穩(wěn)定性好，生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點。盡管國內(nèi)外學者從不同的大豆發(fā)酵產(chǎn)品中分離和篩選出了一些高產(chǎn)納豆激酶菌 株，并進行了優(yōu)化發(fā)酵條件以提高納豆激酶的產(chǎn)量、異源表達提高納豆激酶的純度、通過菌種選育提高納豆激酶的活力等研究，但對提高納豆激酶熱穩(wěn)定方面的研究鮮有報道。實踐中真正可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)納豆激酶的菌株很少。特別是，由于納豆激酶對熱不穩(wěn)定，一直是限制該酶在保健食品、醫(yī)藥領域應用的瓶頸。因此，得到高活性和熱穩(wěn)定性的納豆激酶菌株需求十分迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供新的高活、熱穩(wěn)定性納豆激酶生產(chǎn)菌；本發(fā)明的直接目的是篩選出一種新的納豆枯草芽孢桿菌，使其可用于較大量生產(chǎn)納豆及高活、熱穩(wěn)定性納豆激酶。本發(fā)明人通過800Gy6°Co- Y射線輻照誘變納豆枯草芽孢桿菌BSNK-5，采用酪蛋白平板法經(jīng)過多次點板傳代反復篩選，結合65°C處理得到了高活、熱穩(wěn)定性突變菌株一納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus natto)BSNK_T160,該新菌株已于2012年10月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6714。本發(fā)明所述的納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160特征為形態(tài)特征菌株的菌落在LB平板上呈圓形，直徑2_4mm，乳白色，不透明，邊緣不整齊，表面干燥，有皺褶，用接種環(huán)挑菌落有拉絲現(xiàn)象，菌落與培養(yǎng)基不結合，菌落正反面顏色相同。顯微鏡下個體形態(tài)觀察，菌株桿狀，長3-4 μ m，寬O. 8-1 μ m,兩端鈍圓，革蘭氏染色呈陽性，產(chǎn)芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生，見圖I和圖2。培養(yǎng)特征BSNK-T160生長所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，輻照誘變所用的篩選培養(yǎng)基為酪蛋白培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30-37°C。所述酪蛋白培養(yǎng)基的配方為酪蛋白1%、酵母提取物O. 5%、NaCl O. 9%、瓊脂2%，ρΗ7· 2-7. 4，121°C 滅菌 20min，現(xiàn)用現(xiàn)配。本發(fā)明固體發(fā)酵所用的培養(yǎng)基為大豆，發(fā)酵溫度為38_40°C。
由納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵制品也屬于本專利的的保護范圍。所述發(fā)酵制品可為發(fā)酵產(chǎn)品本身、經(jīng)稀釋過的發(fā)酵產(chǎn)品或經(jīng)純化的發(fā)酵產(chǎn)品；所述發(fā)酵制品可采用顆粒、粉末、片劑等固體外形或是液體、糊狀、膠狀等流體外形。發(fā)明效果經(jīng)酪蛋白平板法篩選，纖維蛋白平板法檢測篩選菌株的纖維蛋白溶解活性和熱穩(wěn)定性，固體發(fā)酵驗證菌體的發(fā)酵能力等實驗證實與野生型菌株BSNK-5相比，突變菌株BSNK-T160具有以下有益效果I、提高了酪蛋白水解活性和熱穩(wěn)定性在37°C的酪蛋白水解活性提高了 46. 9%，65°C熱穩(wěn)定性提高約8倍(圖3)2、提高了纖維蛋白溶解活性，特別是在65°C高溫下的活性·
纖維蛋白平板檢測結果表明BSNK-T160在37°C的溶解圈面積增加了 20. 93%，相對于尿激酶的活性提高了 29. 62% ;65°C熱處理后溶解圈面積增加了 32. 13%，相對于尿激酶的活性提高了 82.31% (圖4)。3、由納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵制品質(zhì)量好固態(tài)發(fā)酵實驗進一步證實接種BSNK-T160菌株24h后便在大豆表面形成一層白膜，呈粘性，拉絲較長，所得納豆顏色發(fā)黃，有金屬光澤，具有醬香味(圖5)。本發(fā)明的BSNK-T160的優(yōu)點如下I、較高的纖維蛋白水解活性；2、較好的熱穩(wěn)定性；3、發(fā)酵速度快，24小時就可發(fā)酵大豆產(chǎn)納豆,大于市場納豆菌發(fā)酵產(chǎn)納豆最少需要 48h。4、發(fā)酵所得納豆品質(zhì)好，沒有氨臭味，具有醬香味。因此，BSNK-T160菌株是理想的研究、應用的出發(fā)材料菌株。在納豆激酶及納豆的生產(chǎn)領域中具有實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化的極大可能，并具有廣闊的醫(yī)藥、食品應用和市場前景。


圖I為納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160的菌落形態(tài)圖；圖2為納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160的菌體形態(tài)圖；圖3為不同溫度處理后BSNK-T160的酪蛋白水解活性圖；圖4為不同溫度處理后BSNK-T160相對于尿激酶的活性圖；圖5為BSNK-T160固體發(fā)酵產(chǎn)納豆圖。生物材料保藏信息名稱納豆枯草芽抱桿菌(Bacillussutilis natto) BSNK-T160保藏編號CGMCCNo. 6714保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏時間2012年10月29日。
具體實施例方式以下實施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例I高活熱穩(wěn)定性突變菌株BSNK-T160篩選I.材料I. I 菌種BSNK-5,由發(fā)明人實驗室從我國黑豆豆豉分離、篩選和鑒定的納豆枯草芽孢桿菌。I. 2培養(yǎng)基種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基酪蛋白平板培養(yǎng)基。I. 3活力測定方法酪蛋白平板法將平板(9cmX 9cm)放在水平儀上調(diào)水平，用IOmM pH7. 2PBS溶液配制1%的瓊脂糖，微波爐加熱使之融化，加入pH8. OTris-HCl緩沖液配制的等體積酪蛋白溶液，使終濃度為3mg/ml，趁熱倒入平板中，將氣泡趕至邊緣，室溫下凝固。用直徑5_的打孔器打孔，將待測樣品點入孔內(nèi)，37°C保溫18h，小心取出平板，考馬斯亮藍染色，7%冰乙酸脫色，酪蛋白被水解后，點樣孔周圍顯示透明圈，其余部位為藍色。2 方法2. I菌懸液制備從活化好的BSNK-5平板接單菌落到20ml LB液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)大約8_10h，到0D600為O. 8-1. 0，取出，離心收集菌體(6000rpm，5min)，生理鹽水清洗2次，用等體積生理
鹽水溶解，備用。2. 2 60Co- Y射線輻照誘變?nèi)ml上述菌液，加入9ml生理鹽水，SOOGy進行輻照誘變。將輻照誘變菌液進行倍比稀釋，取100 μ I涂酪蛋白平板，每個梯度涂10個酪蛋白平板，30°C過夜培養(yǎng)。2. 3高活菌株篩選高活菌株初篩隨機選取照射后生長菌株點酪蛋白平板，以未經(jīng)照射菌株為對照，30°C過夜培養(yǎng)。次日取出，選取正突變株(即酪蛋白平板溶解圈直徑與菌落直徑比值比對照菌株溶解圈直徑與菌落直徑比值增大10%的菌株)，重復點酪蛋白平板多次，進行溶解圈觀察。高活菌株復篩將最終確認穩(wěn)定菌株經(jīng)3ml LB液體培養(yǎng)基、30°C、220rpm培養(yǎng)5h，取發(fā)酵液10 μ I點酪蛋白平板，30°C培養(yǎng)18h，計算溶解圈面積，選取誘變菌株溶解圈面積比對照菌溶解圈面積增大10%的菌株進行熱穩(wěn)定性分析。2. 4熱穩(wěn)定性菌株篩選將篩選菌株發(fā)酵液經(jīng)37、55、60和65°C處理15min，酪蛋白平板檢測活性，將熱處理后溶解圈面積比對照菌株大的菌株作為正突變菌株。3 結果利用SOOGy6ciCo- Y輻照BSNK-5菌株，結合熱處理，酪蛋白平板法篩菌得到活性和熱穩(wěn)定提高菌株BSNK-T160(菌落與菌體形態(tài)見圖I和2)。野生型菌株BSNK-5在37°C的酪蛋白溶解圈面積為123. 44mm2，突變菌株BSNK-T160為181. 34mm2，活性提高了 46. 9% ；65°C處理15min后，突變菌株BSNK-T160酪蛋白平板的溶解圈面積仍為37. 09mm2,而BSNK-5的溶解圈面積為4. 12mm2，熱穩(wěn)定性提高了 8倍(圖3)。實施例2BSNK-T160纖維蛋白水解活性測定
I、活力測定方法瓊脂糖-纖維蛋白平板的配制含有1%瓊脂糖的pH7. 2PBS溶液，50°C恒溫水浴45min，加入凝血酶(最終活性
O.05IU/ml)和同樣溫度下水浴IOmin的等體積含有O. 1%纖維蛋白原的pH7. 2PBS溶液，混勻。9cmX9cm的培養(yǎng)皿加入35ml此溶液，凝固后用直徑5mm打孔器打孔，上樣10ul，37°C恒溫培養(yǎng)18h，測量溶解圈的直徑，計算溶解圈的面積，根據(jù)尿激酶標準曲線計算酶的活力單位。尿激酶標準曲線制作方法尿激酶樣品(100、200、300、400、500U/ml)各IOul點樣于新配制的纖維蛋白平板上，放置lOmin，移入37°C培養(yǎng)箱，保溫18h后取出，測定溶解圈的垂直直徑，計算各溶解圈面積。以溶解圈面積為橫坐標，以酶活力為縱坐標作圖，根據(jù)標準曲線計算樣品活力。 發(fā)酵液制備方法將BSNK-5與BSNK-T160經(jīng)平板活化后，接入3ml LB液體培養(yǎng)基，30°C過夜培養(yǎng)。次日取出，以2%的接種量接入20ml LB液體培養(yǎng)基，30°C、220rpm培養(yǎng)5h，離心取發(fā)酵液10μ I點纖維蛋白平板，37°C培養(yǎng)18h，用游標卡尺測量垂直直徑，計算溶解圈面積及相對于尿激酶的活力單位。熱處理方法同實施例I的2. 4。2、結果纖維蛋白平板檢測結果表明BSNK-5在37°C的溶解圈面積為194. 09mm2,相對于尿激酶的活性為289. 53IU/ml ；BSNK-T160溶解圈面積為234. 72mm2，相對于尿激酶的活性為375. 28IU/ml ;與BSNK-5相比，BSNK-T160纖維蛋白溶解圈面積增加了 20. 93%，相對于尿激酶的活性提高了 29. 62% (圖4)。65°C熱處理后，BSNK-5的溶解圈面積為93. 42mm2，相對于尿激酶的活性為77IU/ml ；BSNK-T160溶解圈面積為123. 44mm2，相對于尿激酶的活性為140. 38IU/ml ;與BSNK-5相比，BSNK-T160溶解圈面積增加了 32. 13%，相對于尿激酶的活性提高了 82. 31%(圖4)。實施例3BSNK-T160發(fā)酵生產(chǎn)納豆I、工藝流程大豆原料一洗凈一浸泡一蒸煮一接種一發(fā)酵一后熟一納豆；取BSNK-T160菌株，按照以上工藝試制納豆。2、方法2. I菌懸液制備從LB平板接BSNK-T160菌株到3ml液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)8_9h，2%的接菌量接入20mlLB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)4_6h，離心收集菌體，生理鹽水或無菌水清洗三次，重懸菌體，用于固體發(fā)酵。2. 2大豆預處理取50g大豆清洗，去除殘渣及殘次豆，加入IOOml超純水過夜浸泡，去除多余水分，121°C高壓滅菌20min。2. 3 發(fā)酵將滅好菌的大豆放涼置38_42°C，接入制備好的菌懸液，38°C培養(yǎng)24h，大豆表面有一層白膜；停止發(fā)酵，放入4°C冰箱后熟12h。2. 4納豆感官分析BSNK-T160菌株經(jīng)過以上工藝發(fā)酵大豆24h制得納豆，成品色澤金黃，口感潤滑，有醬香味，用筷子挑起時有很長的拉絲樣粘液物質(zhì)，與市售納豆風味十分相似(圖5)。
權利要求
1.納豆枯草芽孢桿菌(Bacillusnatto) BSNK-T160, CGMCC No. 6714。
2.權利要求I所述的納豆枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)發(fā)酵制品方面的用途。
3.權利要求2所述的用途，所述發(fā)酵制品是納豆或納豆激酶。
4.用權利要求I所述的納豆枯草芽孢桿菌得到的發(fā)酵培養(yǎng)制品。
5.權利要求4所述的制品，是納豆或納豆激酶。
6.一種生產(chǎn)納豆的方法，以大豆為原料，經(jīng)浸泡、蒸煮、接種發(fā)酵菌、發(fā)酵得到，其特征為所用的發(fā)酵菌是納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus natto) BSNK-T160, CGMCC No. 6714。
全文摘要
本發(fā)明經(jīng)輻照誘變得到了一株新的納豆枯草芽孢桿菌BSNK-T160。與野生菌BSNK-5相比，BSNK-T160的酪蛋白水解活性提高了46.9%，65℃熱穩(wěn)定性提高約8倍；相對于尿激酶的纖維蛋白活性提高了29.62%，熱穩(wěn)定性提高了82.31%。本發(fā)明得到的BSNK-T160菌株可用于生產(chǎn)高活、熱穩(wěn)定性納豆激酶。用該新菌株發(fā)酵大豆24h便可產(chǎn)出納豆，且所得納豆品質(zhì)優(yōu)良。
文檔編號C12N1/20GK102943060SQ20121047938
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權日2012年11月22日
發(fā)明者唐選明, 李淑英, 聶瑩 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所