專利名稱：一種發(fā)酵液中提取硫酸軟骨素的方法
技術領域：
一種發(fā)酵液中提取硫酸軟骨素的方法，屬于生物工程領域，特別是從發(fā)酵液中而非動物中提取硫酸軟骨素。
背景技術：
硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)是一種酸性的黏多糖,其二糖單體由葡糖醛酸(D-GlcUA)與N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β _1，3鍵相連，糖鏈生成后由磺基轉移酶在GalNAc的碳4位或碳6位進行硫酸化，如圖I。根據(jù)其化學組成和結構差異可分為Α、Β、C、D、Ε、F、H等多種，通常從哺乳動物組織中提取得到的硫酸軟骨素以CS-A、CS-C為主。CS是一類重要的生物高分子，具有廣泛的生物活性，其作為安全有效的保健食品 和藥品在世界各國得到了廣泛應用。硫酸軟骨素具有以下生物活性鎮(zhèn)痛抗炎作用；促進成骨細胞增生，誘導新骨形成；抗腫瘤作用；抗粘連作用；免疫調(diào)節(jié)作用；調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化作用；抗氧化、清除自由基和廷緩衰老的作用。CS還具有抗炎、抗病毒、抗過敏和加速傷口愈合的作用，如抗HIV活性。在歐、美、日等發(fā)達國家，硫酸軟骨素作為保健品長期應用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗塞、冠狀動脈機能不全、心肌缺血等疾病，無明顯的毒副作用，能顯著降低冠心病患者的發(fā)病率和死亡率?，F(xiàn)今硫酸軟骨素工業(yè)生產(chǎn)方法是從豬、牛、雞、鯊魚等動物軟骨中提取，主要使用酶法和堿法相結合的方法，但是該方法存在收集原料的成本高、質(zhì)量不穩(wěn)定、純度不好控制、提取復雜、生產(chǎn)造成污染等諸多問題。發(fā)酵法生產(chǎn)CS不受原材料限制，成本低、環(huán)境友好，但是尚處于初級階段，國內(nèi)使用發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素尚屬空白，國外有發(fā)酵液中小量制備硫酸軟骨素類似物的相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵液中提取硫酸軟骨的方法，該提取方法具有回收率聞、提取簡單、環(huán)境友好等優(yōu)點。本發(fā)明的技術方案I、發(fā)酵液的制備取O. ImL篩選的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis BN)接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37°C，裝液量50mL/500mL，搖床轉速200rpm，培養(yǎng)12h后按照10%接種量接種于7L發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵，培養(yǎng)溫度為37°C，裝液量為3L/7L，轉速為400rpm，通氣量為1.7L/min，發(fā)酵周期為24h。菌種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis BN)是由本研究室選育，主要用來生產(chǎn)硫酸軟骨素，該菌株已申請中國專利，并且進入實質(zhì)性審查，申請?zhí)枮?01110127831. I。種子培養(yǎng)基葡萄糖1.5%，大豆蛋白胨0.8%，酵母粉0.8%，K2HPO4 · 3H20O. 04%, KH2PO4O. 04%。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖2 %，酵母粉 5 %，(NH4)2SO4O. 2 %, K2HPO4O. 15 %,KH2PO4 · 3Η200· 15%, MgSO4 · 7Η20 O. 04%, MnCl2 · 4Η20 O. 02%。2、發(fā)酵液中樣品分離純化I)取發(fā)酵液在旋轉蒸發(fā)儀中45°C進行濃縮，將發(fā)酵液體積濃縮至原來的三分之。用三氯乙酸調(diào)pH至4. 5,常溫下靜置Ih,用5mol/L的NaOH調(diào)pH至6. 0,8000rpm離心15min除去菌體；2)取上清液，加入上清體積2-3倍的乙醇，機械攪拌Ih后低溫靜置24h。傾去部分上清，殘余液在4000rpm下離心20min,收集沉淀,加入O. 3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解，加入O. 7-1倍體積的氯仿，攪拌Ih后靜置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清體積2-3倍的無水乙醇，攪拌30min，靜置24h虹吸部分上清液，殘余液離心20min，收集沉淀，重復上述過程2次；3)加入O. 3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速攪拌12h， 6000rpm離心20min，收集上清液再次加入上清體積2_3倍的無水乙醇，攪拌30min，靜置24h，將提純樣品溶于適量去離子水中；4)得到的提純樣品在超濾離心管中離心濃縮，超濾離心管的過濾膜截留分子量為IOkDa, 5000rpm離心濃縮至原體積的十分之一，再將濃縮液加入去離子水至原體積,再次進行超濾離心，反復三次除去發(fā)酵液中小分子物質(zhì)和有機溶劑。將得到濃縮液至于平板中，放置于-70°C超低溫冰箱中冷凍，然后進行冷凍干燥濃縮液后得到硫酸軟骨素純品。3、硫酸軟骨素含量的測定將提純樣品稀釋合適倍數(shù)與標準溶液經(jīng)O. 22 μ m微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜法測定硫酸軟骨素的含量。色譜條件色譜柱NUCLE0DURC18Pyramid ；流動相乙腈+戊烷磺酸鈉(10+90)；柱溫35°C；檢測波長192nm;進樣量10μ L流速0.8ml/min。液相色譜標準樣品通過高效液相色譜的檢測結果如圖2，提純樣品檢測結果如圖3。


圖I硫酸軟骨素的結構式，R和R1相同或不同，代表H或SO3Na,但不能同時為H，η = 5-50圖2鯊魚軟骨素標準品的高相液相色譜結果圖3硫酸軟骨素提純樣品高效液相色譜結果
具體實施例方式實施例I :按照常規(guī)動物軟骨中提取硫酸軟骨素的方法，硫酸軟骨素含量為3. 5g/L的發(fā)酵液IL離心除去菌體，置于含堿性蛋白酶(5% )的50mmol/L碳酸鈉緩沖液中，60°C保溫12h，加熱煮沸IOmin滅活蛋白酶后冷卻至4°C。處理液中加6. lmol/L三氯醋酸溶液使?jié)舛葹?% (v/v)沉淀蛋白質(zhì)，4°C離心除去。溶液加乙醇至80% (v/v)沉淀24h，4°C離心分離。沉淀溶于水，與氯化十六烷基吡啶混合終達I % (w/v)，室溫lh，4°C離心收集沉淀。沉淀溶于2.5mol/L氯化鈉，乙醇再沉淀(80%，v/v)，4°C離心。最后的沉淀再溶于水，4°C透析48h，凍干得產(chǎn)品。該方法操作相對簡單，但是回收率低，回收硫酸軟骨素凍干質(zhì)量為
2.60g，回收率為74%。實施例2 :收集發(fā)酵液，用三氯乙酸調(diào)pH至4. 5，常溫下靜置lh，用5mol/L的NaOH調(diào)pH至6. 0,8000rpm離心15min除去菌體。取上清液，加入上清體積2_3倍的乙醇，機械攪拌Ih后低溫靜置24h。傾去部分上清,殘余液在4000rpm下離心20min,收集沉淀,加入 O. 3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解，加入O. 7-1倍體積的氯仿，攪拌Ih后靜置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清體積2-3倍的無水乙醇，攪拌30min，收集沉淀，重復上述過程2次。加入O. 3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解，加入胰蛋白酶50mg/L，低速攪拌12h，6000rpm離心20min，收集上清液再次加入上清體積2_3倍的無水乙醇，攪拌30min，靜置24h收集沉淀并溶于適量去離子水中。利用超濾離心管反復超濾三次除去發(fā)酵液中小分子物質(zhì)和有機溶劑。將得到濃縮液置于平板中，放置于_70°C超低溫冰箱中冷凍，然后進行真空冷凍干燥后得到硫酸軟骨素純品。發(fā)酵液不經(jīng)濃縮，使用了大量的乙醇，且使得乙醇沉淀的損失量加大，并且硫酸軟骨素損失也大，最終冷凍干燥得到硫酸軟骨素質(zhì)量為2. 56g，回收率為73%。實施例3 :取發(fā)酵液在旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮溫度為45°C，用三氯乙酸調(diào)pH至
4.5,常溫下靜置Ih,用5mol/L的NaOH調(diào)pH至6. 0,8000rpm離心15min除去菌體。取上清液，加入上清體積2-3倍的乙醇，機械攪拌Ih后低溫靜置24h。傾去部分上清，殘余液在4000rpm下離心20min，收集沉淀，加入O. 3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解，加入O. 7-1倍體積的氯仿，攪拌Ih后靜置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清體積2-3倍的無水乙醇，攪拌30min，收集沉淀，重復上述過程2次。加入O. 3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L,低速攪拌12h,6000rpm離心20min,收集上清液再次加入上清體積2-3倍的無水乙醇，攪拌30min，靜置24h，將提純樣品溶于去離子水中。使用IOkDa透析膜透析48h，放置于_70°C超低溫冰箱中冷凍，然后進行真空冷凍干燥濃縮液后得到硫酸軟骨素純品。使用透析膜透析，廉價但是費時長且最終得到樣品體積大，冷凍干燥量也增大。最終冷凍干燥的得到硫酸軟骨素純品量為2. 85g/L，回收率為81%。實施例4 :取發(fā)酵液在旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮溫度為45°C。用三氯乙酸調(diào)pH至
4.5,常溫下靜置Ih,用5mol/L的NaOH調(diào)pH至6. 0,8000rpm離心15min除去菌體。取上清液,加入上清體積2-3倍的乙醇，機械攪拌Ih后低溫靜置24h。傾去部分上清，離心收集沉淀，加入O. 3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解，加入O. 7-1倍體積的氯仿，攪拌Ih后靜置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清體積2-3倍的無水乙醇，攪拌30min，靜置24h收集沉淀，重復上述過程2次。加入O. 3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速攪拌12h，6000rpm離心20min，收集上清液再次加入上清體積2_3倍的無水乙醇，攪拌30min,靜置24h，收集沉淀溶于適量去離子水中。然后使用超濾離心管中離心濃縮，反復三次超濾離心除去發(fā)酵液中小分子物質(zhì)和有機溶劑。將得到濃縮液至于平板中，放置于_70°C超低溫冰箱中冷凍，然后進行真空冷凍干燥濃縮液后得到硫酸軟骨素純品。最終冷凍干燥的得到硫酸軟骨素純品量為3. 03g/L,回收率為8 7%。
權利要求
1.一種發(fā)酵液中提取硫酸軟骨素的方法，其特征在于提取方法包括如下步驟 1)取0.ImL篩選的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis BN)接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h后按照10%接種量接種于7L發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵，發(fā)酵周期為24h。
種子培養(yǎng)基 葡萄糖 1.5%，大豆蛋白胨 0.8%，酵母粉 0.8%,K2HPO4* 3H20 0. 04%, KH2PO4O. 04%發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 2%，酵母粉 5%，(NH4)2SO4O. 2 %, K2HPO4O. 15 %, KH2PO4 3H20 0. 15 %,MgSO4 7H20 0. 04%, MnCl2 4H20 0. 02%。
2)取發(fā)酵液在旋轉蒸發(fā)儀中進行濃縮，用三氯乙酸調(diào)pH至4.5，常溫下靜置lh，再用5mol/L 的 NaOH 調(diào) pH 至 6. 0,8000rpm 離心 15min 除去菌體； 3)取上清液,加入上清體積2-3倍的乙醇，機械攪拌Ih后低溫靜置24h。傾去部分上清，殘余液在4000rpm下離心20min,收集沉淀,加入0. 3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解,力口A0. 7-1倍體積的氯仿，攪拌Ih后靜置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清體積2-3倍的無水乙醇，攪拌30min，靜置24h虹吸部分上清液，殘余液離心20min，收集沉淀，重復上述過程2次； 4)加入0.3mol/L的NaCl將沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速攪拌12h，6000rpm離心20min，收集上清液再次加入上清體積2_3倍的無水乙醇，攪拌30min，靜置24h，將提純樣品溶于適量去離子水中； 5)去提純樣品適量于超濾離心管中，超濾離心同時去除小分子物質(zhì)和有機溶劑，濃縮液加入去離子水至原體積，再次進行超濾離心，反復三次除去發(fā)酵液中小分子物質(zhì)，濃縮液真空冷凍干燥后得到硫酸軟骨素純品。
2.根據(jù)權利要求I所述一種發(fā)酵液中提取硫酸軟骨素的方法，其特征是步驟2)中旋轉蒸發(fā)溫度為45°C，蒸發(fā)至原體積的三分之一；步驟5)中超濾離心管的截留分子量為IOkDa,轉速為5000rpm，濃縮至原體積的十分之一；步驟5)中濃縮液冷凍條件為_70°C中5_6h，然后再真空度2. 5Pa下冷凍干燥48h得硫酸軟骨素純品。
全文摘要
本發(fā)明闡述了一種發(fā)酵液中提取硫酸軟骨素的方法，即以研究室保藏產(chǎn)硫酸軟骨素菌株為生產(chǎn)菌株，在7L罐中發(fā)酵后收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液進行預處理，然后用乙醇沉淀和氯仿萃取去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再利用超濾離心管反復三次離心除去發(fā)酵液中的小分子物質(zhì)，最后將濃縮液真空冷凍干燥48h得到硫酸軟骨素純品。本發(fā)明經(jīng)過濃縮后大大節(jié)約了使用乙醇的量，氯仿可以回收利用，同時使用超濾離心管對于小量制備硫酸軟骨素純品更加快捷、方便。
文檔編號C12P19/26GK102965414SQ20121048780
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權日2012年11月27日
發(fā)明者劉立明, 劉佳, 吳秋林, 陳堅 申請人:江南大學