專利名稱：檢測尿液中病毒特異性核酸的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及跨腎病毒核酸在制備用于診斷病毒感染的藥物中的用途。還涉及檢測跨腎病毒存在的試劑盒。
背景技術(shù)：
目前存在三種類型的體外診斷系統(tǒng)，廣泛用于檢測病原體。這些是生物樣品的病原體的直接培養(yǎng)；基于傳染劑產(chǎn)物或抗原檢測的免疫測定；和可以檢測傳染過程中對抗傳染劑產(chǎn)生的抗體的間接免疫測定。在第一個(gè)系統(tǒng)中，主要缺陷是認(rèn)為生物樣品存在傳播病原體的危險(xiǎn)。在第二個(gè)和第三個(gè)系統(tǒng)中，缺陷包括樣品提取，這通常是入侵性的并在收集時(shí)可能是傳染性樣品。在第三個(gè)系統(tǒng)中，一個(gè)主要的缺陷是在過去和現(xiàn)在傳染之間通常存在很小的區(qū)分可能性。最近，基于取自個(gè)體的血液或血漿樣品，或細(xì)胞培養(yǎng)物中的病原體核酸檢測，已經(jīng)產(chǎn)生了分子診斷方法。這些測定通常比免疫測定靈敏得多。然而，它們需要特定設(shè)備和專業(yè)人員的存在。此外，生物樣品——在血漿、血液或細(xì)胞培養(yǎng)物的情況中——難以存儲而沒有發(fā)生變化，除非在受控的溫度條件下，并且認(rèn)為對操作人員是有生物危害性的。最近，已經(jīng)描述了基于跨腎(transrenal)DNA(Tr-DNA)的分子診斷方法，用于監(jiān)控異源移植的進(jìn)展、診斷胎 兒的性別和檢測腫瘤標(biāo)記的存在。(Botezau等，ClinicalChemistry 46(8) :1078-84(2000) ;Su 等，Ann. NY Acad. Sc1. 1022 :81-89 (2004))。例如，U.S.專利No. 6，251，638描述了在懷孕婦女尿液中檢測男性胎兒DNA的分析方法。U.S.專利No. 6，287，820描述了目的在于診斷腫瘤的系統(tǒng)，特別是結(jié)腸和胰腺的腺癌。U.S.專利No. 6, 492, 144教導(dǎo)了可以用于監(jiān)控異源移植進(jìn)展的Tr-DNA核酸分析方法。Al-Yatama等(2001)中，Prenat Diagn, 21 :399-402 ;和 Utting，Μ.等(2002)，Clin Cancer Res, 8 35-40o Keiko Koide,等，Prenat Diagn, 2005 ;25 :604-607 ;Mengiun Wang,等，ClinicalChemistry, 2004, 50 :211-213 ；Y. -H. Su，等，J. Mol. Diagn.，2004，6 :101-107 中還描述了跨腎DNA以小于1000個(gè)堿基對的核酸片段的形式存在于尿液中。已經(jīng)將跨腎DNA的存在解釋為凋亡現(xiàn)象的結(jié)果。在凋亡或程序化細(xì)胞死亡的過程中，核DNA分裂成核小體和寡聚物，其隨后，作為凋亡過程的一部分，被吞噬并從生物體中排出。(Umansky, S. R.,等(1982) ;Biochim. Biophys. Acta, 655 :9_17)。盡管該降解 DNA的一部分避開了吞卩遼作用，但出現(xiàn)于血流中(Lichtenstein, A. V.等(2001), Ann NY AcadSci, 945 :239-249),并且，如上述提及的專利中所證實(shí)的，也存在于尿液中。在本申請之前，還沒有描述尿液中存在來源于尿道外來源的病毒DNA。已經(jīng)表明了從血漿中轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組釋放的病毒DNA的循環(huán)。例如，在鼻咽癌個(gè)體的血漿中檢測到EB病毒 DNA 的片段(Chan, K. C.，等(2002)，Cancer Res 63 :2028-2032)。此外，在宮頸癌個(gè)體的血漿中已經(jīng)檢測到人乳頭狀瘤病毒(HPV)的病毒DNA(Pornthanakasem，W.，等(2001)；BMC Cancer 1:2)。然而，在個(gè)體尿液中沒有檢測到這些病毒DNA。本發(fā)明描述了通過檢測個(gè)體尿液中那些病原體的DNA序列來檢測個(gè)體中病毒病原體存在的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及通過檢測和定量個(gè)體尿液中跨腎病毒(transrenal virus)核酸特異性序列來診斷和監(jiān)控個(gè)體病毒感染的方法。一實(shí)施方案中，核酸是分離的或純化的。可以使用化學(xué)或物理方法來進(jìn)行該純化。這些方法包括有機(jī)溶劑提取、過濾、沉淀、具有核酸親和性的固體基質(zhì)的吸附和色譜。這些方法中使用的固體基質(zhì)可以由硅膠基的樹脂、離子交換樹脂或羥磷灰石構(gòu)成。另一個(gè)實(shí)施方案中，固體基質(zhì)是硅膠基樹脂，且所述分離和純化在離液劑(chaotropic agent)存在下進(jìn)行。另一個(gè)實(shí)施方案中，將一種或多種抑制核酸降解的試劑加入尿樣中。這些試劑包括離子螯合劑、變性劑和離子去污劑。本發(fā)明方法中使用的離子螯合劑實(shí)例是EDTA。本發(fā)明方法中使用的變性劑實(shí)例是鹽酸胍或異硫氰酸胍。本發(fā)明方法中使用的離子去污劑實(shí)例是N-月桂酰肌氨酸或十二烷基硫酸鈉。一實(shí)施方案中，將分離或純化的核酸用于病毒核酸的檢測。另一實(shí)施方案中，該方法還包括尿樣的分級分離，例如，通過離心或過濾，從細(xì)胞體相連的部分分離出無細(xì)胞級份。使用以下技術(shù)中的一種來進(jìn)行核酸的分析核酸雜交、循環(huán)探針反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、半巢式PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增和限制性片段長度多態(tài)性。另一實(shí)施方案中，使用一個(gè)或多個(gè)HIV-1 GAG或POL基因特異性的引物來進(jìn)行PCR。這些引物的實(shí)例在說明書中描述為SEQ ID NO =1-1l0`
另一實(shí)施方案中，病毒核酸大小小于約lOOObp。優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒核酸為約100至約200bp大小。本發(fā)明的方法適用于所有病毒病原體，包括RNA、DNA、游離基因和整合病毒。它們還適用于重組病毒，如基因治療中使用的腺病毒或慢病毒。特別地，該方法適用于以下病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括重組的和天然的HIV-1、HIV-2，天花病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)、丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)和腺病毒(AAV)。一些實(shí)施方案中，病毒劑是EB病毒(EBV)和HIV-1。一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是在體外進(jìn)行的。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及監(jiān)控個(gè)體病毒感染的方法，包括以下步驟定量所述個(gè)體第一次尿樣中跨腎病毒核酸的含量；定量所述個(gè)體第二次尿樣中所述跨腎病毒核酸的含量；和比較所述個(gè)體所述第一次和所述第二次尿樣中所述跨腎病毒核酸的含量，因此監(jiān)控所述個(gè)體中的所述病毒感染。該實(shí)施方案的另一方面中，該方法進(jìn)一步包括將減輕或抑制所述病毒感染的化合物給藥于所述個(gè)體的步驟。任選地，病毒感染是HIV感染和所述化合物是抗病毒劑。該實(shí)施方案的另一方面中，通過選自以下的方法來進(jìn)行定量與那些病原體特異性的分子探針配對、雜交、PCR、巢式PCR、半巢式PCR、SSCP、LCR和SDA。該實(shí)施方案的另一方面中，該方法進(jìn)一步包括將所述尿樣分離成含有所述跨腎核酸的無細(xì)胞級份的步驟?？梢允褂秒x心來進(jìn)行該分離。該實(shí)施方案的核酸為100至200bp。該實(shí)施方案的另一方面中，個(gè)體處于產(chǎn)生重復(fù)病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)中。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測尿液中病毒核酸的試劑盒，該試劑盒包括用于從尿液分離和/或提取跨腎病毒核酸的試劑和/或材料、DNA探針或至少一種病毒劑特異性寡核苷酸對(引物)。該實(shí)施方案的一方面中，探針是HIV-1 GAG或POL基因特異性的用于PCR反應(yīng)的引物。這些引物的實(shí)例在說明書中描述為SEQ ID NO =1-1l0除非另外限定，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明涉及領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)中可以使用在此所述那些相似或相等的方法和材料，以下描述了合適的方法和材料。在此提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)以其整體引入作為參考。在沖突的情況中，將以本說明書為準(zhǔn)，包括定義。此外，材料、方法和實(shí)施例只是說明性的并不是用來限制。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將從以下的詳述和權(quán)利要求變得清楚。


圖1是攝影圖像，顯示了通過感染HIV-1個(gè)體的非分級尿樣的跨腎DNA的巢式PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳的結(jié)果(使用468/602引物對[134bp]的20個(gè)循環(huán)，接著使用518/596 [79bp]的35個(gè)循環(huán))。引物是HIV-1GAG片段特異性的。圖2是攝影圖像，顯示了通過從8E5 LAV細(xì)胞提取的基因組DNA的巢式PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳的結(jié)果(使用468/602引物對[134bp]的20個(gè)循環(huán)，接著使用518/596 [79bp]的35個(gè)循環(huán))。引物是HIV-1GAG片段特異性的。圖3是攝影圖像，顯示了通過感染HIV-1個(gè)體尿樣的跨腎DNA的巢式PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳的結(jié)果(CP :全部；SN :上清液；PT :沉淀)。A-102bp/60bp(HIV-l POL片段的特異性引物);B-317bp/60bp(P0L特異性的);C_569bp/132bp (TAT特異性的)；NI 非感染的；IN 1-3 :感染HIV的個(gè)體。
具體實(shí)施例方式為了本發(fā)明，提供現(xiàn)在的定義擴(kuò)增子任何相對小的DNA片段的術(shù)語，例如通過PCR復(fù)制的。擴(kuò)增可以在體內(nèi)或體外發(fā)生的特定DNA片段的拷貝數(shù)量的增加。凋亡細(xì)胞健康和狀況的年齡或狀態(tài)支配時(shí)正常起作用的人和動物細(xì)胞的程序化細(xì)胞死亡。需要垂死細(xì)胞的代謝活動的活性過程，特征在于DNA分裂成片段，獲得所謂核小體大小的DNA片段及其寡聚物的階梯模式。離液(Chaotropic):干擾水熱力學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)(例如，離子，如SCN_、C104_和胍)的特性。這使得較小極性和較大疏水性物質(zhì)在水中變得更可溶。在生物水平的效果是蛋白質(zhì)的變性。游離基因可以獨(dú)立于細(xì)胞染色體復(fù)制或作為染色體的一部分整合和復(fù)制的環(huán)狀DNA分子?；蚝芯幋amRNA和控制那些序列表達(dá)必需的序列的DNA片段?；蚪M在真核生物中，染色體結(jié)構(gòu)包圍的生物體的一整套基因。循環(huán)探針反應(yīng)在恒定的特定溫度下進(jìn)行CPT反應(yīng)，這使得嵌合探針與其互補(bǔ)的單鏈目標(biāo)DNA雜交。在所得到的目標(biāo)-探針雙鏈體內(nèi)，RNase H識別DNA-RNA雜交體并特異性地分裂探針的RNA部分。分裂的片段在反應(yīng)溫度不穩(wěn)定并且從目標(biāo)分離出來。目標(biāo)然后與另一個(gè)探針分子自由雜交，重復(fù)該循環(huán)。探針片段累積，作為目標(biāo)檢測的基礎(chǔ)。隨著時(shí)間，分裂探針片段的累積遵循線性動力學(xué)并因此可以定量目標(biāo)的含量。雜交廣泛使用的技術(shù)，其利用了單鏈DNA或RNA互補(bǔ)序列相互配對來形成雙鏈體的能力。雜交可以發(fā)生在兩個(gè)互補(bǔ)DNA序列之間，單鏈DNA和互補(bǔ)RNA之間，或兩個(gè)RNA序列之間。使用該技術(shù)來檢測和分離特定序列，測量同源性，或限定一條或兩條鏈的其他特征。感染身體組織中的微生物入侵和擴(kuò)增，其可以在臨床上是不明顯的或由于競爭性代謝、毒素、胞內(nèi)復(fù)制或抗原抗體應(yīng)答導(dǎo)致局部細(xì)胞損傷。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與PCR相似的DNA擴(kuò)增方法。LCR不同于PCR，因?yàn)槠鋽U(kuò)增探針分子而不是通過核苷酸的聚合產(chǎn)生擴(kuò)增子。每條DNA鏈?zhǔn)褂脙蓚€(gè)探針并連接在一起來形成單個(gè)探針。LCR使用DNA聚合酶和DNA連接酶來驅(qū)動反應(yīng)。和PCR —樣，LCR需要熱循環(huán)儀來驅(qū)動反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)導(dǎo)致目標(biāo)核酸分子的倍增。LCR可以具有比PCR更大的特異性。巢式PCR :使用最初內(nèi)部的引物在早些PCR產(chǎn)物上進(jìn)行的第二種PCR。這顯著提高了 PCR的靈敏度和特異性。巢式引物使用第一個(gè)PCR循環(huán)獲得的擴(kuò)增子內(nèi)部的選定引物。使用至少一個(gè)巢式引物的擴(kuò)增過程提高了特異性，因?yàn)榈谝粋€(gè)循環(huán)的非特異性產(chǎn)物在第二個(gè)循環(huán)中沒有得到擴(kuò)增。核酸通過3’5’磷酸二酯鍵連接的核苷酸的線性聚合物。在DNA (脫氧核糖核酸)中，糖基是脫氧核糖，核苷酸的堿基是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。RNA (核糖核酸)具有核糖作為糖和尿嘧啶替代胸腺嘧啶。DNA作為堿基序列形式的遺傳信息的穩(wěn)定存儲。RNA在一些病毒中具有相似的功能，但更常見的是，在結(jié)構(gòu)能力中，作為信息媒介(mRNA)、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)者(tRNA)，或在一些新發(fā)現(xiàn)的情況中，作為酶。

寡核苷酸/多核苷酸通過磷酸二酯鍵連接的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸的線性序列。超過約20個(gè)核苷酸長度時(shí)，通常使用術(shù)語“多核苷酸”。病原體病原體是可以引起宿主疾病的生物物質(zhì)。病原體的同義詞是“傳染劑”。術(shù)語“病原體”最常用于破壞多細(xì)胞生物體的正常生理學(xué)的物質(zhì)。沉淀沉淀物，細(xì)胞存在時(shí)，通常包括細(xì)胞級份，或可以通過離心生物樣品獲得。聚合酶核酸擴(kuò)增中使用的酶。該術(shù)語包括各種DNA聚合酶的變體。引物短的預(yù)先存在的多核苷酸鏈，通過DNA聚合酶可以將新的脫氧核糖核苷酸添加至該鏈上。PCR:涉及兩個(gè)合成寡核苷酸引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這兩引物與待擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的兩個(gè)片段是互補(bǔ)的(每條鏈一個(gè))，在過量的脫氧核苷酸和Taq聚合酶(一種熱穩(wěn)定性DNA聚合酶)存在下，添加至目標(biāo)DNA(不需要是純的)。在一系列(通常30個(gè))的溫度循環(huán)中，目標(biāo)DNA重復(fù)變性(約90°C )、與引物退火(通常60°C )和子鏈從引物的延伸(72 0C )。因?yàn)樽渔溩陨碜鳛殡S后循環(huán)的模板，與兩個(gè)引物配對的DNA片段按指數(shù)規(guī)律擴(kuò)增，而不是線性地?cái)U(kuò)增。探針已經(jīng)放射性標(biāo)記或用一些其他檢測分子如生物素、digoxygenin或熒光素標(biāo)記的對應(yīng)于目標(biāo)基因或序列的DNA或RNA片段的一般術(shù)語。
純化/去雜/滅菌指的是從樣品除去污染物的過程，其中結(jié)果是樣品含有60%，優(yōu)選75%，更優(yōu)選90%純化程序所針對的物質(zhì)。限制性片段長度多態(tài)性(RFLP):允許通過比較擴(kuò)增(通常通過PCR)特定基因組DNA片段并用特定限制性酶切割時(shí)獲得的特征性多態(tài)模式來建立遺傳相關(guān)性的方法。通過形成或消除這些酶的識別位點(diǎn)的突變來產(chǎn)生這種模式的變化。樣品廣義地解釋該術(shù)語并包括在溶液中含有核酸(DNA或RNA)或連接固體物質(zhì)的任何形式，其中“核酸”的定義包括基因組DNA(例如，與固體物質(zhì)連接時(shí)，如在DNA印跡中，或在溶液中)、cDNA和其他形式。通過雜交形成兩個(gè)核酸序列的結(jié)合歸功于G和C或A和T堿基或這些堿基類似物之間的氫鍵。這些結(jié)合是互補(bǔ)性的，且DNA螺旋是反平行的?？梢允褂萌芤褐械囊粋€(gè)序列(或螺旋)和另一個(gè)連接固相的序列來形成該雜交結(jié)合(如，例如，在FISH[原位熒光雜交]方法中)，要不兩個(gè)序列都在溶液中。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) :SSCP是基于序列中微妙差異(通常是一個(gè)堿基對)的單鏈核酸的電泳分離，該微妙差異導(dǎo)致不同的二級結(jié)構(gòu)和通過凝膠的遷移率的可測量差異。鏈置換擴(kuò)增(STA) :STA是等溫的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，基于HincII切斷其識別位點(diǎn)半硫逐磷酸酯形式的未修飾鏈的能力，和DNA聚合酶的外切核酸酶缺乏Klenow片段(外-klenow)在缺口延伸3’ -端并置換下游DNA鏈的能力。由結(jié)合正義和反義反應(yīng)獲得指數(shù)擴(kuò)增，其中從正義反應(yīng)置換的鏈作為反義反應(yīng)的目標(biāo)，反之亦然。目標(biāo)序列通過雜交、擴(kuò)增或其他方法或方法組合來分析的核酸序列。Tm(解鏈溫度)特異性雙鏈DNA群分解成單鏈聚合物的溫度。計(jì)算多核苷酸片段的該溫度的公式是本領(lǐng)域公知的Tm = 81. 5+0. 41 ( % G+C) (Anderson &Young, “Quantitative Filter `Hybridization，，(定量濾膜雜交)，在 Nucleic AcidHybridization[1985]中)。對于少于40個(gè)堿基對的寡核苷酸,可以使用簡化的公式Tm =3°C X (G+C) +2X (A+T)。Tr-DNA/RNA :跨腎DNA/RNA，或已經(jīng)穿過腎臟屏障的尿液中存在的DNA/RNA。尿道包括參與尿從身體排出的器官和導(dǎo)管。病毒病原體感染中的尿核酸本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)在病毒感染后，病毒或病毒來源的核酸分裂成在尿液中發(fā)現(xiàn)的相對短的片段。許多這些病原體特異性核酸穿過跨腎屏障(這些核酸通常稱為TrNA，或TrDNA或TtRNA)并且通過分子方法可以作為無細(xì)胞低分子量片段(其長度小于1000個(gè)核苷酸，但優(yōu)選小于500bp長，更優(yōu)選短于250-300bp長或短于250bp長)在尿液中檢測到。這些跨腎核酸源自位于個(gè)體尿道外的病毒。如在此所用的，術(shù)語“病毒核酸”包括病原來源的核酸。其他病毒特異性核酸可以通過腎臟內(nèi)的病毒或細(xì)胞流出，并因此不必定穿過跨腎屏障以便在尿液中得到檢測。此外，可以在尿液中發(fā)現(xiàn)一些通過穿過跨腎屏障以外的其他機(jī)制或通過腎臟內(nèi)的病毒產(chǎn)生的病毒特異性核酸。之前只在經(jīng)歷過異種組織或器官移植宿主中，在懷有男性胎兒婦女的情況中以及在特征在于特異性標(biāo)記基因的腫瘤的情況中，檢測到尿液中跨腎核酸(Tr-NA)的存在。根據(jù)本發(fā)明，還優(yōu)選在非尿道感染的情況中檢測到病毒感染情況中病毒來源的跨腎核酸的存在，甚至在血尿癥或?qū)е履I臟屏障破裂的病理學(xué)不存在的情況中或改變腎臟屏障正常完整性的情況中檢測到。病毒來源的跨腎核酸(Tr-NA)與尿道中流失或釋放并且在尿液中發(fā)現(xiàn)的病毒的基因組不相關(guān)，并且不是源自這些病毒的基因組。替代的是，跨腎核酸是通過腎小球-腎臟過濾機(jī)制過濾的。因此，跨腎核酸片段的大小通常小于約1000個(gè)堿基對，例如，小于約500，小于約300，小于約250，或在約100至約200個(gè)堿基對之間，與DNA通常具有高分子量和長度超過1000個(gè)堿基或堿基對的其他情況相反。因此，在本發(fā)明中，病毒來源的跨腎核酸(TrNA)通常沒有在尿液沉淀物中發(fā)現(xiàn)，而是在可溶性部分中，盡管痕量的TrNA在離心過程中與細(xì)胞一起沉淀。該發(fā)現(xiàn)證實(shí)了源自尿液中病原體病毒的尿核酸或跨腎核酸的存在，因此適用于診斷所有由病毒病原體引起的傳染病?！ひ虼?，在實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及診斷或監(jiān)控病毒感染的方法，通過測定尿樣中病毒核酸的存在，優(yōu)選病毒DNA或病毒來源的RNA。該方法包括測定跨腎病毒核酸存在的步驟，使用實(shí)驗(yàn)室操作中常用的方法，如雜交、PCR、巢式PCR、半巢式PCR、SSCP, LCR和SDA。在特定實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括在測定跨腎病毒核酸存在之前尿樣的初步處理。一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用抑制DNA或RNA降解的試劑預(yù)處理尿樣。這些試劑包括酶抑制劑，如螯合劑、去污劑或變性劑、DNase或RNase抑制劑，其優(yōu)選選自EDTA、鹽酸胍、異氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和十二烷基硫酸鈉。另一實(shí)施方案中，跨腎病毒核酸存在的測定任選地在為了分離尿液的細(xì)胞部分與無細(xì)胞低分子量核酸(DNA/RNA)的尿樣離心或過濾之前。然而，還可以使用沒有分級的尿樣。優(yōu)選在2500g至4500g的速度進(jìn)行離心，更優(yōu)選3000g至4000g。優(yōu)選通過具有O.1至5. O μ m孔徑的濾器來進(jìn)行過濾，更優(yōu)選使用O. 2至1. O μ m的孔徑，甚至更優(yōu)選O. 45至
O.8 μ m。也可以使用從細(xì)胞部分分離可溶性部分的等價(jià)方法。通過使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)或物理方法來實(shí)現(xiàn)跨腎核酸的任選分離或純化和定量。這包括至少一個(gè)純化步驟，使用選自以下的方法有機(jī)溶劑提取、過濾、沉淀、固體基質(zhì)吸附(例如，通過離子交換)、親和色譜或分子排阻色譜或這些方法的組合。然而，純化方法必須適于分離小于1000個(gè)核苷酸長的DNA(單鏈或雙鏈)，這些DNA具有相應(yīng)的分子量，假定，作為平均分子量，核苷酸具有330道爾頓的值。在一些實(shí)施方案中，純化對于小于500個(gè)核苷酸(nt)長的具有相應(yīng)分子量的片段是特異性的，如長度小于300nt的片段，長度小于250nt的片段，或長度為100至200個(gè)核酸堿基對(nt)的片段。通過使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)或物理方法來實(shí)現(xiàn)跨腎核酸的分離和/或純化。這包括一個(gè)或多個(gè)純化步驟，使用選自以下的方法有機(jī)溶劑提取、過濾、沉淀、固體基質(zhì)吸附(例如，硅膠樹脂、羥磷灰石或離子交換)、親和色譜(例如，通過序列特異性捕獲或核酸特異性配體)或分子排阻色譜。然而，純化方法必須適于分離大小小于1000個(gè)核苷酸對的DNA (單鏈或雙鏈)。再更優(yōu)選，純化對于小于500個(gè)核苷酸的片段是特異性的，更優(yōu)選，長度小于300或250nt的片段，或長度為100至200個(gè)堿基或堿基對的片段。純化優(yōu)選在包括但不限于硅膠樹脂的基質(zhì)上進(jìn)行。—個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過在室溫用變性劑預(yù)處理尿樣來進(jìn)行DNA分離方法，變性劑如上所述，例如為脲、鹽酸胍或異氰酸胍。優(yōu)選使用異氰酸胍。然后將樣品穿過固相，優(yōu)選由硅膠樹脂構(gòu)成的基質(zhì)，在離液鹽(異氰酸胍)存在下，結(jié)合核酸。然后在緩沖劑如Tris-EDTA(Tris IOmM，EDTA ImM)中或在水中收集或洗脫的樣品。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過選自以下的技術(shù)進(jìn)行跨腎病毒NA存在的表征和測定核酸雜交、循環(huán)探針反應(yīng)(F. Bekkaoui等,在BioTechniques 20 :240-248 [1996])、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (PCR實(shí)驗(yàn)方案方法和應(yīng)用指南)，M.1nnis等；Elsevier Publication, 1990)、巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR) (F.Barany，在PNAS USA, 88 :189-93 [1991])、鏈置換擴(kuò)增(SDA) (G. K. Terrance Walker，等，在 NucleicAcid Res, 22 :2670-77 [1994]和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以使用這些方法的組合，例如，PCR-限制性長度多態(tài)性，其中核酸得到擴(kuò)增，然后分成等份并用限制酶消化，然后通過電泳分離。聚合酶反應(yīng)(PCR)是用于檢測和/或定量分析核酸的優(yōu)選方法。再一更優(yōu)選的是巢式PCR方法，如上所述，或半巢式PCR方法，其中兩個(gè)引物中只有一個(gè)是擴(kuò)增子內(nèi)部的。該方法的優(yōu)勢主要與易于收集生物樣品；跨腎核酸不是感染性的事實(shí)；可以應(yīng)用至核酸，甚至是片段形式的分子診斷方法的敏感性相關(guān)。診斷方法適用于所有病毒病原體，包括RNA、DNA、游離基因或整合的病毒。還適用于重組病毒，如基因治療中使用的腺病毒或慢病毒。特別地，該方法優(yōu)選適用于以下病毒重組和天然HIV-l、HIV-2、天花病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)、丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)和腺病毒(AAV)。優(yōu)選將該方法應(yīng)用于HIV-1病毒，選擇GAG、POL或TAT片段中的探針或引物寡核苷酸用于檢測。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，特別地，通過巢式(GAG)或半巢式(POL)PCR進(jìn)行檢測時(shí)，特別優(yōu)選的引物對是由HIV GAG片段的特異性序列構(gòu)成的，并優(yōu)選對應(yīng)于IDN1-4序列，和HIV-1P0L片段特異性的，優(yōu)選對應(yīng)于IDN 5-7片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測和監(jiān)控尿液中跨腎病毒NA的試劑盒，該試劑盒包括用于從尿樣中分離和/或純化跨腎DNA的試劑和/或材料、DNA探針，或至少一種病毒劑特異性的寡核 苷酸對(引物)?？梢匀芜x地存在反應(yīng)管、預(yù)處理樣品的試劑、標(biāo)記探針的酶和用于DNA擴(kuò)增的酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包括重組和天然的HIV-1、HIV-2、天花病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)、丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)和腺病毒(AAV)特異性的寡核苷酸引物對；或，再更優(yōu)選，引物選自以下所示序列，和用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)優(yōu)選在巢式或半巢式形式中的特異性試劑。擴(kuò)增和檢測尿核酸的方法術(shù)語核酸指的是寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其片段/部分以及天然(例如，基因組)或合成來源的DNA或RNA?？梢跃哂须p或單螺旋，并還可以表示序列的正義或反義方向。平行螺旋(5，— 3’ );反平行螺旋(3’ 一 5’)。術(shù)語寡核苷酸、多核苷酸和核酸聚合物是相等的，并理解為指的是由超過兩個(gè)的脫氧核糖核酸堿基或核糖核酸堿基構(gòu)成的分子。核苷酸(堿基)的數(shù)目和寡核苷酸片段的長度可以改變?？梢砸圆煌姆绞胶铣伞Ｐ蛄性趥鹘y(tǒng)上定義為起始于5’并終止于3’。這些數(shù)字表示序列的方向。為了檢測，然后擴(kuò)增從個(gè)體尿液分離的DNA。擴(kuò)增方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、巢式PCR、半巢式PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)和鏈置換擴(kuò)增(SDA)。還可以通過至少一個(gè)標(biāo)記引物的雜交來進(jìn)行跨腎DNA的檢測。
雜交是允許兩個(gè)核酸序列作相互識別為補(bǔ)體并連接在一起(退火)的方法?；パa(bǔ)/補(bǔ)體序列是彼此相互作用的多核苷酸序列，取決于堿基之間的相互作用。例如，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Watson Crick堿基配對,AGTC與TCAG互補(bǔ)。然而,其他組合如Hoogstein堿基配對是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的?？梢跃哂腥炕虿糠只パa(bǔ)序列，并且這決定了兩個(gè)序列之間的效率或吸引力。平均互補(bǔ)性在允許保持連接的條件下，將防止雜交的強(qiáng)烈互補(bǔ)性。核酸序列雜交的能力是公知現(xiàn)象。第一種雜交方法描述于Marmur& Lane, PNASUSA, 46 =453(1960)和461 (1960)中，但是從那時(shí)起已經(jīng)完全成為分子生物中的技術(shù)?，F(xiàn)今，術(shù)語“雜交”包括，特別是，狹線/印跡和印跡雜交。允許核苷酸序列相互識別(雜交)的條件可以改變，以這樣的方式來產(chǎn)生完全雜交(具有高特異性的互補(bǔ)性)或部分雜交(具有平均特異性的互補(bǔ)性)。在本申請中，無論何時(shí)使用術(shù)語“雜交”，應(yīng)當(dāng)將條件理解為指的是允許平均或高互補(bǔ)性的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以計(jì)算需要多少人工序列來促使兩個(gè)相對方向的互補(bǔ)序列之間的雜交，稱為反平行結(jié)合。探針是可以人工或天然產(chǎn)生 ，并且與另一核酸序列形成組合的寡核苷酸。探針用于發(fā)現(xiàn)含未知DNA樣品中的特定序列。在本專利中，所有的探針可以結(jié)合信號分子(或報(bào)道分子)。報(bào)道分子使得可以檢測探針(例如，通過酶反應(yīng)(例如，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測試))、放射性、熒光或其他系統(tǒng))。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是使用互補(bǔ)引物和熱敏感性聚合酶的DNA序列擴(kuò)增方法。特定核酸擴(kuò)增中所用的一類酶是稱為Taq(水生棲熱菌(Thermus aquaticus))聚合酶的DNA聚合酶。引物是寡核苷酸，在合適的條件下，可以從其啟動多核苷酸序列的合成。引物可以天然存在(例如，在多核苷酸的酶消化中)，或可以通過化學(xué)合成獲得。PCR中擴(kuò)增的產(chǎn)物通常稱為擴(kuò)增子。巢式PCR是第二種PCR，其使用第一套引物內(nèi)部的第二套引物(稱為巢式引物)在早先的PCR產(chǎn)物上進(jìn)行。這顯著提高了 PCR的敏感性和特異性。巢式引物是第一個(gè)PCR循環(huán)獲得的擴(kuò)增子內(nèi)部的。使用至少一個(gè)巢式引物的擴(kuò)增過程提高了特異性，因?yàn)榈谝粋€(gè)循環(huán)的非特異性產(chǎn)物在第二個(gè)循環(huán)中沒有得到擴(kuò)增，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙賹?yīng)于巢式引物的序列。半巢式PCR是使用一個(gè)新引物和一個(gè)最初引物的第二種PCR。該方法也提高了特異性。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)是與PCR相似的DNA擴(kuò)增方法。LCR不同于PCR，因?yàn)槠鋽U(kuò)增探針分子而不是通過核苷酸的聚合產(chǎn)生擴(kuò)增子。每個(gè)DNA使用兩個(gè)探針并連接在一起來形成單個(gè)探針。LCR使用DNA聚合酶和DNA連接酶來啟動反應(yīng)。和PCR—樣，LCR需要熱循環(huán)儀來啟動反應(yīng)且每個(gè)循環(huán)導(dǎo)致目標(biāo)核酸分子的倍增。LCR可以具有比PCR更高的特異性。在單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析中，使小的PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)變性并通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。因此，隨著PCR產(chǎn)物移動至凝膠中并通過凝膠(并遠(yuǎn)離變性劑)，將恢復(fù)序列依賴性的二級結(jié)構(gòu)(與RNA 二級結(jié)構(gòu)相似)。單鏈PCR產(chǎn)物的遷移率將取決于它們的二級結(jié)構(gòu)。因此，含有實(shí)質(zhì)性序列差異以及插入和刪除的PCR產(chǎn)物具有不同的遷移率。鏈置換擴(kuò)增(SDA)是等溫核酸擴(kuò)增方法，基于引物指引的限制酶的缺口活性和外核酸酶-缺失聚合酶的置換活性。術(shù)語純化或分離指的是從樣品中除去污染物的過程，其中結(jié)果是含有50%、60%、70%>90%或超過90%純化程序所針對物質(zhì)的樣品。對于核酸雜交情況中的嚴(yán)謹(jǐn)溫度條件，這些術(shù)語通常指的是最大值和最小值之間的可變溫度，對于核酸，最大溫度由低于Tm 5°C來表不,最小溫度由低于Tm 25°C來表不。本領(lǐng)域中所用的技術(shù)利用了嚴(yán)謹(jǐn)溫度條件，結(jié)合其他參數(shù)(例如鹽水濃度)，來區(qū)分具有擬似精確同源性的序列。嚴(yán)謹(jǐn)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并可以在Ausubel，等(編輯)，⑶RRENTPROTOCOLS IN MLECULAR BIOLGYJohn Wiley &Sons,N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6.3· 6 中找到。優(yōu)選，條件使得序列彼此至少約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%同源，通常保持彼此雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的非限制性實(shí)例是在含有6X SSC、50mMTris-HCl(pH7. 5) UmMEDTA,O. 02% PVP,O. 02% FicollUO. 02% BSA和 500mg/ml 變性鮭魚精子DNA 的高鹽緩沖劑中在65°C雜交，接著在O. 2X SSC、0. 01% BSA中50°C洗滌一次或兩次。在第二個(gè)實(shí)施方案中，提供了在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與包括核苷酸序列或其片段、類似物或衍生物的核酸分子可雜交的核酸序列。中度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的非限制性實(shí)例是在6XSSC、5X Reinhardt’ s 溶液、O. 5% SDS 和 100mg/ml 變性鮭魚精子 DNA 中 55°C雜交，接著在IX SSC、0. 1% SDS中37°C洗滌一次或多次?？梢允褂玫钠渌卸葒?yán)謹(jǐn)條件是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Ausubel 等(編輯)，I"3，CURRENTPR0T0C0LS IN MLECULAR BIOLGY，John Wiley & Sons，NYjPKrieger，1990 ；GENE TRANSFER AND EXPRES SION,ALAB0RAT0RYMANUAL, Stockton Press, NY。在第三個(gè)實(shí)施方案中，提供了在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與核酸分子或其片段、類似物或衍生物可雜交的核酸。低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的非限制性實(shí)例是在35%甲酰胺、5X SSC、50mMTris-HCl (ρΗ7· 5)、5mM EDTA,O. 02% PVP.0. 02% Ficoll.O. 2% BSA、lOOmg/ml 變性鮭魚精子 DNA、10% (wt/vol)硫酸葡聚糖中 40°C雜交，接著在 2XSSC、25mM Tris-HCl (pH7. 4)、5mM EDTA和0.1% SDS中50°C洗滌一次或兩次?？梢允褂玫钠渌蛧?yán)謹(jǐn)條件是本領(lǐng)域公知的(例如，和用于交叉物種雜交的一樣)。參見，例如，Ausubel，等(編輯)，1993，CURRENT PR0T0C0LSIN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons，NYjPKrieger，1990 ；GENETRANSFER AND EXPRESSION, ALAB0RAT0RY MANUAL, Stockton Press，NY ;Shilo 和 Weinberg，1981.Proc Natl Acad Sci USA 78:6789-6792。
本發(fā)明還提供了用于檢測和/或測定需要個(gè)體尿樣中病毒核酸基因型的試劑盒，包括在相同或分開包裝中的至少一個(gè)選自SEQ ID N0:l、3、5、9和11的正向引物和至少一個(gè)選自SEQ ID N0:2、4、6、8和10的反向引物，以及使用說明書。在一個(gè)實(shí)施方案中，該病毒核酸源自HIV。在以下的實(shí)施例中將進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不是限制權(quán)利要求中所述本發(fā)明范圍。實(shí)施例本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變在此所述所有方法而沒有改變基本原則概念。實(shí)施例1.樣品的穩(wěn)定和制備尿樣制備和跨腎DNA分析的所有步驟在室溫下進(jìn)行。簡而言之，從參與研究的每個(gè)個(gè)體收集大約50-60ml的樣品。在收集后的30分鐘內(nèi)，以IOmM的終濃度加入由0. 5MEDTA和0. 5M Tris-HCl構(gòu)成的溶液，pH為8. O至8. 5，以便抑制尿樣中可能存在的核酸酶。在尿液中鑒定出至少三種分解核酸的酶，DNaseKDNsae II和磷酸二酯酶。EDTA通過螯合二價(jià)金屬如Mg2+、Ca2+和/或其他對于它們的活性所需的來抑制DNase I和磷酸二酯酶的活性。DNase II在酸性環(huán)境中活性最大。尿液補(bǔ)充pH8. O的Tris-HCl提高了尿液的pH，因此抑制了 DNase II的活性。每個(gè)個(gè)體可以采取更高含量的尿液，例如，100-1000ml。將這些大量的樣品濃縮并用于形成尿液中發(fā)現(xiàn)的非常稀的病毒核酸的較高濃度。穩(wěn)定的尿液可以以5ml的等份試樣存儲于_80°C。任選地，將25ml鹽溶液冷凍來作為對照。制備尿樣和提取DNA的其它方法描述于PCT專利No. W098/54364中，以其整體引入作為參考。實(shí)施例2.尿液分級對于基于Tr-DNA的應(yīng)用，涉及定量Tr-DNA分析，通常需要尿液分級。這降低了來自尿液中存在的細(xì)胞的核蛋白對Tr-DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物、總Tr-DNA或特定遺傳標(biāo)記的精確定量的影響。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們使用了兩種方法用于尿液分級，離心和過濾。兩者都在尿液收集后和在樣本補(bǔ)充EDTA-Tris穩(wěn)定混合物之前立即進(jìn)行?？梢詫⒛蛞罕３衷谶@種條件，只要尿細(xì)胞是完整的并且它們的成分沒有漏至尿液中和細(xì)胞DNA污染Tr-DNA。對于過濾，可以使用孔徑為0.1至5 μ m的具有降低的核酸和蛋白質(zhì)結(jié)合能力的濾器。濾器的選擇取決于待分析的目標(biāo)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們使用了 Iuer-1ock 0. 45 μ m濾器裝置(Cat. No. SLHV033RS)或 0. 45 μ m 150ml 濾器裝置 STERICAP (Cat. No. SCHVUOI RE)，兩者都來自Millipore。過濾后，將樣品補(bǔ)充EDTA-Tris保存溶液并進(jìn)行DNA提取的下游處理或等分并冷凍存儲于_80°C。通過使用已知溶解細(xì)胞的溶液(高濃度鹽或離液劑)從濾器提取來收集尿細(xì)胞級分。我們實(shí)驗(yàn)中通過離心的`尿液分級在樣品收集后和加入保存混合物之前立即進(jìn)行。在室溫在3500至4000Xg的RCF進(jìn)行離心大約15分鐘。在上述每個(gè)用于尿液過濾的程序中小心地收集和操作上清液。將主要由細(xì)胞和細(xì)胞碎片構(gòu)成的沉淀重懸浮于生理溶液中并存儲在_80°C。實(shí)施例3.從尿液提取和純化核酸在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們使用了兩種不同形式的基于硅膠的DNA提取實(shí)驗(yàn)方案。一種是真空驅(qū)動的，第二種是離心?；谡婵盏姆椒ㄏ蚰驑又屑尤?M硫氰酸胍(GITC) (AMRESC0, Cat. No. 0380)至不低于3M的終濃度。將該溶液強(qiáng)烈攪拌并每IOml最初的尿液體積補(bǔ)充0.25ml Wizard硅膠懸浮液(PR0MEGA, Cat.No.A7141)。為了捕獲DNA，將混合物在室溫連續(xù)旋轉(zhuǎn)I小時(shí)。通過將混合物裝載于裝配連接真空管道的迷你柱(PR0MEGA，Cat.No.A7211)注射器上來收集帶有捕獲的DNA的樹脂。通過施加真空來收集樹脂，用5ml的3M GITC溶液洗滌兩次。用80%乙醇和50mM NaCl構(gòu)成的溶液進(jìn)一步將樹脂洗滌兩次。然后分離迷你柱并用96 %乙醇通過在1.5ml管中在臺式微離心機(jī)上離心將樹脂另外洗滌兩次。在不超過1/20尿液初體積的體積中用熱水簡短離心來洗脫DNA?；陔x心的方法向尿樣中加入6M硫氰酸胍(GITC) (AMRESC0, Cat. No. 0380)至不低于3M的終濃度。將該溶液強(qiáng)烈攪拌并每IOml最初的尿液體積補(bǔ)充0.25ml Wizard硅膠懸浮液(PROMEGA, Cat.No.A7141)。為了捕獲DNA，將混合物在室溫連續(xù)旋轉(zhuǎn)I小時(shí)。通過在室溫在大約4000xg離心約5分鐘來收集帶有捕獲的DNA的樹脂。用GITC溶液將沉淀的樹脂洗滌一次，用洗滌緩沖劑洗滌一次，然后轉(zhuǎn)移至迷你柱并用96%乙醇再洗一次。用熱水通過簡短離心將DNA洗脫至微離心管中。用熱水在不超過1/20尿液初體積的體積中通過簡短離心來洗脫DNA。實(shí)施例4. PCR弓丨物的設(shè)計(jì)選擇用于基于使用PCR的Tr-DNA分析的引物，用于兩種不同大小的目標(biāo)片段，即，一個(gè)為60至120bp，另一個(gè)為250至400bp。還將所有的引物對完整的人基因組序列進(jìn)行了比較。使用 FastPCR 軟件包(biocenter.helsink1.fi/bi/bare_l_html/oligos)設(shè)計(jì)引物。使用引物 3 軟件包(在 frodo. w1. mit. edu/cg-1-bin/primer3/primer3_www· cgi 網(wǎng)址可以獲得)來選擇用于巢式PCR分析的引物，這樣使得內(nèi)部的巢式引物的解鏈溫度不低于外部引物的。選擇HIV引物用于識別全部9個(gè)M型HIV亞型。根據(jù)最近修訂的命名法(即，1999Nomenclature Proposal [hiv. lanl. gov/content/hiv-db/HTML/reviews/nomenclature/Nomenl])，通過HIV-1序列的系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)組來表示HIV-1M組亞型。將它們命名為Al、A2、B、C、D、F1、F2、G、H、J和K。M組含有表示歐洲全部HIV情況大約95%的病毒。從LosAlamos National Laboratory (NewMexico, hiv. lanl. gov)的數(shù)據(jù)庫獲得 HIV-1M 組亞型的完整基因組序列。通過使用BioEdit軟件包中(mbio. ncsu. edu/BioEdit/bioedit. html)包括的ClustalX算法來進(jìn)行各種亞型的共有序列的多重比對和形成。選擇以下的引物用于巢式PCR的GAG引物外部 GAG 468-F(SEQ ID NO:1) TGGGTAAAAGTAATAGAGGAGAAGGC ；GAG 602-R(SEQ ID NO :2) AACATTTGCATGGCTGCTT.產(chǎn)物134bp。內(nèi)部GAG 518-F(SEQ ID NO :3) CAGCATTATCAGAAGGAGCCACC ；GAG 596-R(SEQ ID NO :4) TGCATGGCTGCTTGATGTCC.產(chǎn)物79bp。用于半巢式-PCR,短擴(kuò)增子的POL引物外部引物POL 4368-F(SEQ ID NO :5) =GGRGAAGCCffTGCATGGAC ；POL 4468-R(SEQ ID NO :6) GCTACATGRACTGCTACCAG.產(chǎn)物102bp。內(nèi)部引物POL 4368-F(SEQ ID NO :5) =GGRGAAGCCffTGCATGGAC ；POL 4427-Rn(SEQ ID NO :7) TGTRCAATCTARTTGCCATATYCCTGG.產(chǎn)物60bp。用于半巢式-PCR,長擴(kuò)增子的POL引物
外部引物POL 4368-F(SEQ ID NO :5) =GGRGAAGCCffTGCATGGACPOL 4678-R(SEQ ID NO :8) ACTCCYTGRCTTTGGGGATTG產(chǎn)物31Ibp。內(nèi)部引物(巢式)POL 4368-F(SEQ ID NO :5) =GGRGAAGCCffTGCATGGACPOL 4427-Rn(SEQ ID NO :7) TGTRCAATCTARTTGCCATATYCCTGG.產(chǎn)物60bp。用于半巢式PCR(長擴(kuò)增子)的TAT引物外部引物TAT 5955-F(SEQ ID NO :9) GCTTAGGCATYTCCTATGGCAGTAT 6462-R(SEQ ID NO :10) TGGGGTCTGTKGGTACACAGG.產(chǎn)物569bp。內(nèi)部引物TAT 6330-Fn(SEQ ID NO :11) CffGTHTAYTATGGRGTACCTGTGTGGTAT 6462-R(SEQ ID NO :10) TGGGGTCTGTKGGTACACAGG.產(chǎn)物132bp。實(shí)施例5.基于TrDNA的HIV-1感染的診斷從10名感染HIV的個(gè)體的尿樣分離DNA，如之前實(shí)施例中所述。通過使用標(biāo)準(zhǔn)臨床分子測試來檢測HIV病毒特異性抗體的存在，這些個(gè)體在臨床上診斷為感染了 HIV。圖1顯示了 HIV-1DNA片段的電泳，如通過巢式PCR擴(kuò)增的，使用以上所示的兩對GAG-特異性引物，根據(jù)本發(fā)明中所述方法。其大小對應(yīng)于巢式PCR擴(kuò)增預(yù)期結(jié)果的條帶-如在第一個(gè)擴(kuò)增中使用468/602對引物進(jìn)行的，接著使用518/596對(79bp)-在10名個(gè)體的8名尿液中和在陽性對照中觀察到，但在陰性對照中沒有觀察到。表I顯示了分析的每名個(gè)體的病毒負(fù)載量，從其可以推斷出擴(kuò)增時(shí)陰性樣品(編號2和3)的情況中,病毒負(fù)荷量低于每ml血衆(zhòng)50個(gè)病毒拷貝。表1. HIV感染個(gè)體的病毒負(fù)載量
權(quán)利要求
1.跨腎病毒核酸在制備用于診斷個(gè)體中的乙肝病毒感染的藥物中的用途，其中所述診斷包括檢測來自個(gè)體的尿液中跨腎乙肝病毒(HBV)核酸的存在，其中所述核酸的存在表明病毒感染。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述跨腎病毒核酸是跨腎DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述診斷進(jìn)一步包括定量所述跨腎病毒核酸的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述定量通過選自以下的方法來進(jìn)行用HBV特異性的分子探針配對、雜交、PCR、巢式PCR、半巢式PCR、SSCP, LCR和SDA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，進(jìn)一步包括在檢測所述跨腎病毒核酸之前將尿液分離成含所述跨腎病毒核酸的可溶性級份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所述分離是通過選自所述尿液的過濾和離心的方法進(jìn)行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6的用途，其中所述跨腎病毒核酸的長度小于300bp。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述跨腎病毒核酸包括DNA片段，且所述片段的長度為100 至 200bp。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述診斷進(jìn)一步包括分離或純化所述跨腎病毒核酸的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中通過化學(xué)或物理方法來進(jìn)行所述純化。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述分離或純化使用選自以下的方法進(jìn)行有機(jī)溶劑提取、過濾、沉淀、具有核酸親和性的固體基質(zhì)吸附和色譜。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述固體基質(zhì)由基于二氧化硅的樹脂、離子交換樹脂或羥磷灰石構(gòu)成。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中所述固體基質(zhì)是基于二氧化硅的樹脂，且所述分離或純化在離液劑的存在下進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述診斷進(jìn)一步包括通過添加DNase或RNase抑制劑而預(yù)處理所述尿液。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中所述抑制劑選自離子螯合劑、變性劑和離子去污劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述離子螯合劑是EDTA;所述變性劑是鹽酸胍或異硫氰酸胍；并且所述離子去污劑是N-月桂酰肌氨酸或十二烷基硫酸鈉。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述尿液是作為樣品從個(gè)體獲得的，或其中所述檢測是通過循環(huán)探針反應(yīng)進(jìn)行的。
18.跨腎病毒核酸在制備用于監(jiān)控個(gè)體中乙肝病毒感染的藥物中的用途，其中所述監(jiān)控包括 a)定量來自所述個(gè)體的第一尿樣中跨腎乙肝病毒(HBV)核酸的含量； b)定量來自所述個(gè)體的第二尿樣中所述跨腎乙肝病毒(HBV)核酸的含量； c)比較所述第一和所述第二尿樣中所述跨腎HBV核酸的含量，由此監(jiān)控所述個(gè)體中的HBV感染。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述監(jiān)控進(jìn)一步包括將降低或抑制HBV感染的化合物給藥于所述個(gè)體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中所述化合物是抗病毒劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述定量通過選自以下的方法來進(jìn)行用HBV特異性的分子探針配對、雜交、PCR、巢式PCR、半巢式PCR、SSCP, LCR和SDA。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，進(jìn)一步包括在定量所述跨腎病毒核酸之前將每個(gè)尿樣分離成含所述跨腎病毒核酸的可溶性級份。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其中所述分離是通過選自所述尿液的過濾和離心的方法進(jìn)行的。
24.根據(jù)權(quán)利要求18或23的用途，其中所述跨腎病毒核酸的長度小于300bp。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述跨腎病毒核酸包括DNA片段，且所述片段的長度為 100 至 200bp。
26.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述個(gè)體處于產(chǎn)生復(fù)發(fā)性HBV感染的風(fēng)險(xiǎn)中。
27.用于測定尿樣中跨腎乙肝病毒核酸存在的試劑盒，所述試劑盒包括用于從所述尿樣分離或純化所述跨腎乙肝病毒核酸的工具，和用于通過與至少一種乙肝病毒(HBV)特異性探針雜交測定所述跨腎乙肝病毒核酸存在的工具。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述HBV特異性探針包括用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測尿液中病毒特異性核酸的組合物和方法。具體地，涉及通過檢測尿樣中跨腎病毒核酸或病毒來源核酸的存在，診斷或監(jiān)控病毒感染的方法，其中使用或沒有使用從尿樣中分離核酸。通過核酸與特異性引物雜交，或通過與特異性引物的鏈擴(kuò)增反應(yīng)來進(jìn)行核酸的分析。該方法適用于所有病毒病原體，包括RNA、DNA、游離基因或整合的病毒。
文檔編號C12Q1/68GK103045758SQ20121049096
公開日2013年4月17日 申請日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月17日
發(fā)明者H.梅爾科尼揚(yáng), A.坎納斯, L.D.托梅, S.R.烏曼斯基 申請人:特羅瓦基因公司