專(zhuān)利名稱(chēng)：同步檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同步檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙草叢頂病(tobacco bushy top disease)于1957年在津巴布韋北部的春克旺里煙 區(qū)首次發(fā)生，此后爆發(fā)流行并造成很大損失。煙草叢頂病在我國(guó)的云南早有出現(xiàn)，但長(zhǎng)期 以來(lái)由于該病僅為零星發(fā)生，未對(duì)煙草生產(chǎn)造成重大損失而被忽視，直到1993年在云南保 山、大理等地大面積爆發(fā)流行后才逐漸受到關(guān)注。此后該病在我國(guó)云南中西部煙區(qū)大規(guī)模 流行，給部分煙區(qū)造成毀滅性損失，發(fā)病區(qū)域除涉及保山、大理、楚雄3個(gè)州市外，昆明、玉 溪、紅河、思茅、文山、西雙版納及怒江等州市也有煙草叢頂病零星發(fā)生。截止2001年，云南 省累計(jì)發(fā)病面積達(dá)51300 hm2，其中8700 hm2絕收，1400 hm2改種，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)2. 1億 元，煙草叢頂病已經(jīng)成為云南省自20世紀(jì)90年代以來(lái)唯一導(dǎo)致大面積絕產(chǎn)的煙草病害。煙草叢頂病由幽影病毒屬的煙草叢頂病毒(TbAacco bushy top virus, TBTV)和 黃癥病毒科馬鈴薯卷葉病毒屬的煙草扭脈病毒(TbAacco vein distorting virus, TVDV) 復(fù)合侵染引起。另外在云南煙草叢頂病的感病煙株中常檢測(cè)到一條伴隨TBTV出現(xiàn)且其分 子量約為1000 bp的小分子RNA，根據(jù)目前的研究推測(cè)該小分子RNA為T(mén)BTV的衛(wèi)星RNA， 稱(chēng)其為煙草叢頂病毒類(lèi)似衛(wèi)星 RNA (Tobacco bushy top virus satellite-like RNA, Sat-TBTV)。2010年又從感染煙草叢頂病的植株中檢測(cè)到了大小為3. 0 kbp與煙草叢頂病 相關(guān)的RNA,第九次國(guó)際病毒分類(lèi)報(bào)告中將其命名為T(mén)VDVaRNA (Tobacco vein distorting virus-associated RNA，TVDVaRNA)。TBTV基因組不含編碼外殼蛋白的基因，它可通過(guò)摩擦 接種傳播，在輔助病毒TVDV的幫助下可通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播。目前的研究結(jié)果表明，自然條件下 表現(xiàn)典型煙草叢頂病癥狀的煙株，都由上述4種病原物復(fù)合侵染引起，而云南煙草叢頂病 發(fā)病區(qū)很多未表現(xiàn)癥狀的煙株，也經(jīng)常能夠檢測(cè)到TVDV及TVDVaRNA。迄今，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)特 別有效的植物病毒病防治藥劑，因此除了嚴(yán)防蚜蟲(chóng)的傳播外加強(qiáng)煙株及蚜蟲(chóng)中煙草叢頂病 4種病原物的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，對(duì)于準(zhǔn)確診斷病害和防止病毒病的傳播流行具有重要的現(xiàn)實(shí)意 義，是生產(chǎn)上對(duì)煙草叢頂病進(jìn)行綜合治理的重要措施之一。通常檢測(cè)鑒定植物病毒的方法有生物學(xué)、電鏡技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技 術(shù)等。生物學(xué)方法操作簡(jiǎn)單，但該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低，還受到季節(jié)、環(huán)境以及病毒種 類(lèi)等方面的影響，因此很難用于煙草叢頂病4種病原物的準(zhǔn)確診斷。由于TBTV、Sat-TBTV 和TVDVaRNA不編碼外殼蛋白，沒(méi)有粒體結(jié)構(gòu)，電鏡技術(shù)和常規(guī)血清學(xué)技術(shù)無(wú)法用于這3種 煙草叢頂病病原物的檢測(cè)鑒定；電鏡技術(shù)僅能觀察到病毒的粒體形態(tài)，很難準(zhǔn)確鑒定出病 毒種類(lèi)，且設(shè)備昂貴，不適合作為T(mén)VDV檢測(cè)的普通方法。TVDV的基因組能夠編碼外殼蛋白， 病毒具有完整的粒體結(jié)構(gòu)，可以用來(lái)作為抗原制備抗血清，但由于TVDV的分布局限于韌皮 部，且病毒含量較低，不易直接從病株里提純到病毒粒子，因此目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)TVDV 抗血清方面的報(bào)道。分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是RT-PCR技術(shù)不但操作簡(jiǎn)單，而且特異性強(qiáng)、靈 敏度高，但普通RT-PCR方法每次只能檢測(cè)一種病毒，對(duì)于多種病原物復(fù)合侵染的情況，則 需要針對(duì)每種病毒進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)，工作量大，成本高，且效率低。
本發(fā)明采用一步法RT-PCR，針對(duì)煙草叢頂病的4種病原物，分別設(shè)計(jì)4對(duì)煙草叢頂 病病原物的特異性引物，可通過(guò)一次PCR檢測(cè)出4種煙草叢頂病的病原物，具有高效、快速、 特異、靈敏及節(jié)約時(shí)間和減少成本等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)在對(duì)煙草叢頂病多種病原物復(fù)合侵染煙草和傳毒介體昆蟲(chóng) 進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的不足，提供了一種高效、靈敏、特異且低成本的檢測(cè)煙草及傳毒介體昆蟲(chóng)中 TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 4 種病原物的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為同步檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，按照 下面步驟進(jìn)行
(1)引物設(shè)計(jì)合成
(a)分別設(shè)計(jì)合成檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 的正向引物 TBTVdF、TVDVdF、 SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下
TBTVdF :5’ -TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，
TVDVdF :5’ -GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，
SatTBTVdF :5’ -TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，
TVDVaRNAdF :5’ -GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，
(b)分別設(shè)計(jì)合成檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 的反向引物 TBTVdR、TVDVdR、 SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下
TBTVdR :5’ -CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，
TVDVdR :5’ -CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中，序列中的 R=A 或 G，
SatTBTVdR :5’ -TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，
TVDVaRNAdR :5’ -TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’ ；
(2)CTAB法提取染病植物組織或傳毒介體昆蟲(chóng)的總核酸，作為RT-PCR擴(kuò)增模板；
(3)一步法RT-PCR擴(kuò)增；
(4)電泳檢測(cè)；
(5)檢測(cè)結(jié)果分析根據(jù)每對(duì)引物擴(kuò)增片段大小與病毒的關(guān)系，觀察感染TBTV、 TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的煙草材料或傳毒介體昆蟲(chóng)中檢測(cè)到的不同核酸帶，判斷發(fā)病 煙草或傳毒介體昆蟲(chóng)中具體感染的TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV病原物的種類(lèi)。所述CTAB法提取感病植物組織或傳毒介體昆蟲(chóng)的總核酸，步驟如下
第一步、樣品準(zhǔn)備
(1)感病植物組織準(zhǔn)備將3飛片病葉疊加在一起，稱(chēng)取5(Tl00mg至研缽中；
(2)傳毒介體昆蟲(chóng)準(zhǔn)備取3(T50頭蚜蟲(chóng)至研缽中；
第二步、加入1. 2 mL的CTAB緩沖液，該緩沖液由質(zhì)量百分比為2 %的CTAB、2 %的 PVP-40 以及 pH 8. 0 的 100 mM 的 Tris_HCl、l. 4 M 的 NaCl 和 20 mM 的 EDTA 組成混合液， 最后根據(jù)混合溶液的體積加入0. 2%巰基乙醇；
第三步、恒溫處理充分研磨后，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中，在65°C溫浴下處理15飛0
min ；
第四步、離心處理首先，將離心管放入離心機(jī)中1200(Tl3000 r/min離心處理15 min,取750 U L上清液至另一 1. 5 mL的離心管，加入750 iiL體積比為24 1的氯仿異戊醇，渦旋震蕩混勻30 s ;然后，再將裝有上清液的離心管放入離心機(jī)中1200(Tl3000 r/ min離心處理10 min，接著，用微量移液器吸取600 yL上清液至又一 1.5 mL的離心管中， 并加入600 UL異丙醇，顛倒離心管充分混勻液體，室溫下放置10 min，最后將裝有上清液 和異丙醇的離心管放入離心機(jī)中1200(Tl3000 r/min離心處理15 min，用微量移液器吸出 上清液；沉淀部分加入500 uL 70 %乙醇，并放入離心機(jī)中1200(Tl3000 r/min離心處理 10 min ；
第五步、干燥用微量移液器吸出液體，沉淀部分在20°C 25°C條件下自然干燥1(T15
min ；
第六步、溶解加入100 UL 20 mmol/L pH8. 0的Tris_HCl并置于冰上10 min，用微 量移液器吹打5 10次使沉淀部分充分溶解；
第七步、保存核酸沉淀溶解液-20°C保存?zhèn)溆?；或者將所獲得的總核酸以干粉狀態(tài)放 入-80°C進(jìn)行長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩Ｋ鲆徊椒≧T-PCR采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2 試劑盒，反應(yīng)體系為 15 ML，由 0. 6 ML 的 PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、7. 5 ML 的 2X1 Step Buffer、各 0.6 ML 的 10 ii M 正反向引物 TBTVdF 和 TBTVdR、各 0. 5 ML 的 10 ii M 正反向引物 TVDVaRNAdF 和 TVDVaRNAdR、各 0. 4 ML 的 10 uM 正反向引物SatTBTVdF和SatTBTVdR、各0. 3 ML的10 uM正反向引物TVDVdF和TVDVdR、 2. 8 ML的ddH20和0. 5 ML的RNA模板混合而成。所述一步法RT-PCR的反應(yīng)條件為在由RNA合成cDNA的RT-PCR反應(yīng)中控制溫度 為50°C，反應(yīng)時(shí)間30 min ;然后在溫度為94°C時(shí)，保持2 min，使RTase失活；溫度控制在 94°C進(jìn)行變性30 sec，在溫度55°C 60°C間進(jìn)行退火處理30 sec，然后，溫度控制在72°C， 延伸1 min，從變性到延伸共計(jì)進(jìn)行30次循環(huán)，最后72°C再延伸10 min后的PCR產(chǎn)物在溫 度_4 °C進(jìn)行保存。
在電泳檢測(cè)中采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，配制1. 0 %的瓊脂糖凝膠，在配好的 凝膠中每100 mL加入5 ML Gold View染色劑混勻。在0. 5 X TBE緩沖液環(huán)境中，90 V穩(wěn) 壓電泳60 min，然后于凝膠成像儀觀察拍照。所述的檢測(cè)引物擴(kuò)增片段大小與所檢測(cè)病原物的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表1所示
權(quán)利要求
1.同步檢測(cè)TBTV、TVDV,Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，同步檢測(cè)按照下面步驟進(jìn)行 (I)引物設(shè)計(jì)合成 (a)分別設(shè)計(jì)合成檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 的正向引物 TBTVdF、TVDVdF、SatTBTVdF和TVDVaRNAdF，引物序列如下TBTVdF :5’ -TACCACACCTAAACAGCGTTG-3’，TVDVdF :5’ -GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3’，SatTBTVdF :5’ -TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3’，TVDVaRNAdF :5’ -GCGTACTGCGGAAGTCTCAC-3’，(b)分別設(shè)計(jì)合成檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV 和 TVDVaRNA 的反向引物 TBTVdR、TVDVdR、SatTBTVdR和TVDVaRNAdR，引物序列如下TBTVdR :5’ -CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3’，TVDVdR :5’ -CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3’，其中，序列中的 R=A 或 G，SatTBTVdR :5’ -TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3’，TVDVaRNAdR :5’ -TGTACTGGAGTGCTTCAACCG-3’ ； (2)CTAB法提取染病植物組織或傳毒介體昆蟲(chóng)的總核酸，作為RT-PCR擴(kuò)增模板； (3)ー步法RT-PCR擴(kuò)增； (4)電泳檢測(cè)； (5)檢測(cè)結(jié)果分析根據(jù)每對(duì)引物擴(kuò)增片段大小與病毒的關(guān)系，觀察感染TBTV、TVDVaRNA、Sat-TBTV和TVDV的煙草材料或傳毒介體昆蟲(chóng)中檢測(cè)到的不同核酸帶，判斷發(fā)病煙草或傳毒介體昆蟲(chóng)中具體感染的TBTV、TVDVaRNA, Sat-TBTV和TVDV病原物的種類(lèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，所述CTAB法提取感病植物組織或傳毒介體昆蟲(chóng)的總核酸，步驟如下 第一歩、樣品準(zhǔn)備 (1)感病植物組織準(zhǔn)備將3飛片病葉疊加在一起，稱(chēng)取5(Tl00mg至研缽中； (2)傳毒介體昆蟲(chóng)準(zhǔn)備取3(T50頭蚜蟲(chóng)至研缽中； 第二歩、加入I. 2 mL的CTAB緩沖液，該緩沖液由質(zhì)量百分比為2 %的CTAB、2 %的PVP-40 以及 pH 8. O 的 100 mM 的 Tris-HCl、I. 4 M 的 NaCl 和 20 mM 的 EDTA 組成混合液，最后根據(jù)混合溶液的體積加入0. 2%巰基こ醇； 第三步、恒溫處理充分研磨后，轉(zhuǎn)入I. 5 mL的離心管中，在65°C溫浴下處理15飛0min ； 第四步、離心處理首先，將離心管放入離心機(jī)中1200(Tl3000 r/min離心處理15min,取750 U L上清液至另ー I. 5 mL的離心管,加入750 iiL體積比為24 I的氯仿異戊醇，渦旋震蕩混勻30 s ;然后，再將裝有上清液的離心管放入離心機(jī)中1200(Tl3000 r/min離心處理10 min，接著，用微量移液器吸取600 U L上清液至又一 I. 5 mL的離心管中，并加入600 UL異丙醇，顛倒離心管充分混勻液體，室溫下放置10 min，最后將裝有上清液和異丙醇的離心管放入離心機(jī)中1200(Tl3000 r/min離心處理15 min，用微量移液器吸出上清液；沉淀部分加入500 UL 70%的こ醇，并放入離心機(jī)中1200(Tl3000 r/min離心處理 10 min ；第五步、干燥用微量移液器吸出液體，沉淀部分在20°C 25°C條件下自然干燥1(T15min ； 第六步、溶解加入100 UL 20 mmol/L pH 8. 0的Tris-HCl并置于冰上10 min，用微量移液器吹打5 10次使沉淀部分充分溶解； 第七步、保存核酸沉淀溶解液-20°C保存?zhèn)溆茫换蛘邔⑺@得的總核酸以干粉狀態(tài)放入-80°C進(jìn)行長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步檢測(cè)TBTV、TVDV,Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，所述ー步法RT-PCR采用寶生物工程大連有限公司生產(chǎn)的PrimeScript One StepRT-PCR Kit Ver. 2 試劑盒，反應(yīng)體系為 15 ML,由 0. 6 M-L 的 PrimeScript I Step EnzymeMix,7. 5 ML 的 2X1 Step Buffer、各 0. 6 ML 的 10 y M 正反向引物 TBTVdF 和 TBTVdR、各0.5 ML的10 UM正反向弓丨物TVDVaRNAdF和TVDVaRNAdR、各0. 4 ML的10 u M正反向弓I物 SatTBTVdF 和 SatTBTVdR、各 0. 3 ML 的 10 u M 正反向引物 TVDVdF 和 TVDVdR、2. 8 ML 的ddH20和0. 5 ML的RNA模板混合而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，所述ー步法RT-PCR的反應(yīng)條件為在由RNA合成cDNA的RT-PCR反應(yīng)中控制溫度為50°C，反應(yīng)時(shí)間30 min ;然后在溫度為94°C時(shí)，保持2 min，使RTase失活；溫度控制在94°C進(jìn)行變性30 sec，在溫度55°C飛(TC間進(jìn)行退火處理30 sec，然后，溫度控制在72°C，延伸Imin，從變性到延伸共計(jì)進(jìn)行30次循環(huán)，最后72°C再延伸10 min后的PCR產(chǎn)物在溫度_4°C進(jìn)行保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，其特征在于，在電泳檢測(cè)中采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，配制I. 0 %的瓊脂糖凝膠，在配好的凝膠中每100 mL加入5 ML Gold View染色劑混勻，在0.5 X TBE緩沖液環(huán)境中，90 V穩(wěn)壓電泳60 min，然后于凝膠成像儀觀察拍照。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同步檢測(cè)TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA的方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。通過(guò)分別設(shè)計(jì)合成TBTV、TVDV、Sat-TBTV和TVDVaRNA正反向引物，CTAB法提取染病植物組織或傳毒介體昆蟲(chóng)總RNA，采用一步法四重RT-PCR，達(dá)到對(duì)這4種病原物的同步快速檢測(cè)。所設(shè)計(jì)的引物特異性強(qiáng)，能同時(shí)擴(kuò)增出4種病原物。用CTAB法提取染病植物組織及傳毒介體昆蟲(chóng)的總RNA，既能保證所提RNA的質(zhì)量，也能降低檢測(cè)成本。反轉(zhuǎn)錄與多重PCR一步完成，極大地節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。本發(fā)明具有快速、高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，能一次實(shí)現(xiàn)對(duì)與煙草叢頂病相關(guān)的4種病原物的同步檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102952901SQ20121049217
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者李凡, 劉芳, 陳海如, 譚冠林, 蘭平秀, 王海寧, 李曉靜, 朱靜, 吳德喜, 蔡紅 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)