專(zhuān)利名稱(chēng)：基于全爪螨幾丁質(zhì)基因的雙靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的雙靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因載體的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
柑橘全爪螨是一種世界性柑橘害螨，對(duì)柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，目前化學(xué)防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施?；瘜W(xué)農(nóng)藥施用不當(dāng)，不僅影響果品安全，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的抗性藥。基于RNA干擾技術(shù)獲得抗昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上 取得成功。昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶參與昆蟲(chóng)(螨類(lèi))蛻皮、圍食膜降解和防御等重要生命活動(dòng)。通過(guò)柑橘全爪螨幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建RNA干擾載體，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因柑橘材料對(duì)柑橘全爪螨進(jìn)行控制具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的雙靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因載體的制備及應(yīng)用，旨在解決利用RNA干擾技術(shù)獲得抗蟲(chóng)材料的問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的雙靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其特征在于，該制備方法首先從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出2條幾丁質(zhì)酶基因Unigenel0731和Unigene7021，進(jìn)行真實(shí)性檢測(cè)后，將選出的兩個(gè)基因在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，找出保守序列，根據(jù)多基因大片段構(gòu)建策略將兩個(gè)基因拼接成一個(gè)多基因片段，將Unigenel0731與Unigene7021拼接在一起作為一個(gè)多基因；設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，將正、反向多基因幾丁質(zhì)酶目的片段先后插入到載體內(nèi)含子兩端，從而構(gòu)成反向互補(bǔ)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi干擾載體“PFGC+Ugl0731/Ug7021”，將載體轉(zhuǎn)載于農(nóng)桿菌中對(duì)柑橘苗木進(jìn)行侵染。進(jìn)一步，通過(guò)柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組搜索，將選出的兩個(gè)基因在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，找出保守序列，根據(jù)多基因大片段構(gòu)建策略將兩個(gè)基因拼接成一個(gè)多基因片段，將Unigenel0731與Unigene7021拼接在一起作為一個(gè)多基因；下面為要拼接的Unigenel0731與Unigene7021兩個(gè)基因序列。進(jìn)一步，多基因Ug 10731+Ug 7021片段的拼接設(shè)計(jì)兩對(duì)拼接引物10731F/10731R，7021 F/7021R，引物要求使片段ugl0731的3’端引物10731R末端與片段ug7021的5，端引物堿基互補(bǔ)。用引物10731F/10731R以u(píng)gl0731為模版，退火溫度為57度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增出帶有互補(bǔ)序列的ugl0731片段；用引物7021 F/7021R以u(píng)g7021為模版，退火溫度為57度，PCR擴(kuò)增出帶有互補(bǔ)序列的ug7021片段。膠回收上述兩個(gè)片段，回收產(chǎn)物按1:1混合后取Iul作為模版，以10731F/7021R為引物，退火溫度57度進(jìn)行第三次PCR，PCR對(duì)火過(guò)程中兩個(gè)帶有互補(bǔ)序列的片段ugl0731和ug7021將配對(duì)形成一條長(zhǎng)鏈，此時(shí)得到兩個(gè)基因連在一起的多基因大片段Ugl0731+Ug7021。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性，同時(shí)為了構(gòu)建干擾載體，設(shè)計(jì)引物時(shí)在引物10731F和7021R末端分別加了限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列。下列為構(gòu)建的多基因片段，以此設(shè)計(jì)構(gòu)建dsRNA。進(jìn)一步，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，將正向多基因片段10731/7021質(zhì)粒雙酶切，同時(shí)將載體PFGC5941質(zhì)粒用相同兩個(gè)酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選單克隆用通用引物Pl，F(xiàn)lPCR檢測(cè)篩選正確的菌株，提取質(zhì)粒，然后酶切驗(yàn)證得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021”;將得到的“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021”質(zhì)粒雙酶切，同時(shí)相同酶切反向多基因片段10731/7021，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌隨機(jī)挑選單克隆，酶切驗(yàn)證，得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021+反向多基因片段10731/7021”。進(jìn)一步，將獲得的農(nóng)桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進(jìn)行分子檢測(cè)將準(zhǔn)備好的外植體分別置于盛有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽生長(zhǎng)直至可以進(jìn)行嫁接。提取轉(zhuǎn)基因柑橘苗和其陰性對(duì)照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異引進(jìn)行擴(kuò)增、電泳檢測(cè)。 本發(fā)明應(yīng)用幾丁質(zhì)酶在昆蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用，通過(guò)柑橘全爪螨幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建RNA干擾載體，最終獲得含特異dsRNA的轉(zhuǎn)基因柑橘材料。該轉(zhuǎn)基因材料在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用必將對(duì)柑橘全爪螨的控制發(fā)揮重要作用，同時(shí)減少化學(xué)農(nóng)藥使用量，因而具有極其廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1是現(xiàn)有技術(shù)提供的基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的雙靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因載體的制備方法的流程圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的雙靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因載體的制備方法的流程圖。該制備方法首先從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出2條幾丁質(zhì)酶基因Unigenel0731和Unigene7021，進(jìn)行真實(shí)性檢測(cè)后，將選出的兩個(gè)基因在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，找出保守序列，根據(jù)多基因大片段構(gòu)建策略將兩個(gè)基因拼接成一個(gè)多基因片段，將Unigenel0731與Unigene7021拼接在一起作為一個(gè)多基因；設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，將正、反向多基因幾丁質(zhì)酶目的片段先后插入到載體內(nèi)含子兩端，從而構(gòu)成反向互補(bǔ)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi干擾載體“PFGC+Ugl0731/Ug7021”，將載體轉(zhuǎn)載于農(nóng)桿菌中對(duì)柑橘苗木進(jìn)行侵染。在本發(fā)明實(shí)施例中，通過(guò)柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組搜索，將選出的兩個(gè)基因在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，找出保守序列，根據(jù)多基因大片段構(gòu)建策略將兩個(gè)基因拼接成一個(gè)多基因片段，將Unigenel0731與Unigene7021拼接在一起作為一個(gè)多基因；下面為要拼接的Unigenel0731與Unigene7021兩個(gè)基因序列。
在本發(fā)明實(shí)施例中，多基因Ug 10731+Ug 7021片段的拼接設(shè)計(jì)兩對(duì)拼接引物10731F/10731R，7021 F/7021R，引物要求使片段ugl0731的3’端引物10731R末端與片段ug7021的5，端引物堿基互補(bǔ)。用引物10731F/10731R以u(píng)gl0731為模版，退火溫度為57度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增出帶有互補(bǔ)序列的ugl0731片段；用引物7021 F/7021R以u(píng)g7021為模版，退火溫度為57度，PCR擴(kuò)增出帶有互補(bǔ)序列的ug7021片段。膠回收上述兩個(gè)片段，回收產(chǎn)物按1:1混合后取Iul作為模版，以10731F/7021R為引物，退火溫度57度進(jìn)行第三次PCR，PCR對(duì)火過(guò)程中兩個(gè)帶有互補(bǔ)序列的片段ugl0731和ug7021將配對(duì)形成一條長(zhǎng)鏈，此時(shí)得到兩個(gè)基因連在一起的多基因大片段Ugl0731+Ug7021。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性，同時(shí)為了構(gòu)建干擾載體，設(shè)計(jì)引物時(shí)在引物10731F和7021R末端分別加了限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列。下列為構(gòu)建的多基因片段，以此設(shè)計(jì)構(gòu)建dsRNA。在本發(fā)明實(shí)施例中，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，將正向多基因片段10731/7021質(zhì)粒雙酶切，同時(shí)將載體PFGC5941質(zhì)粒用相同兩個(gè)酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選單克隆用通用引物Pl，F(xiàn)lPCR檢測(cè)篩選正確的菌株，提取質(zhì)粒，然后酶切驗(yàn)證得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021”;將得到的“PFGC5941-正 向多基因片段10731/7021”質(zhì)粒雙酶切，同時(shí)相同酶切反向多基因片段10731/7021，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌隨機(jī)挑選單克隆，酶切驗(yàn)證，得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021+反向多基因片段 10731/7021”。在本發(fā)明實(shí)施例中，將獲得的農(nóng)桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進(jìn)行分子檢測(cè)將準(zhǔn)備好的外植體分別置于盛有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽生長(zhǎng)直至可以進(jìn)行嫁接。提取轉(zhuǎn)基因柑橘苗和其陰性對(duì)照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異弓I進(jìn)行擴(kuò)增、電泳檢測(cè)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種基于柑橘全爪螨幾丁質(zhì)基因的雙靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因載體的制備方法，其特征在于， 該制備方法首先從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出2條幾丁質(zhì)酶基因Unigenel0731和 Unigene7021，進(jìn)行真實(shí)性檢測(cè)后，將選出的兩個(gè)基因在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，找出保守序列，根據(jù)多基因大片段構(gòu)建策略將兩個(gè)基因拼接成一個(gè)多基因片段，將Unigenel0731與 Unigene7021拼接在一起作為一個(gè)多基因；設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，將正、反向多基因幾丁質(zhì)酶目的片段先后插入到載體內(nèi)含子兩端，從而構(gòu)成反向互補(bǔ)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi干擾載體“PFGC+Ugl0731/Ug7021”，將載體轉(zhuǎn)載于農(nóng)桿菌中對(duì)柑橘苗木進(jìn)行侵染。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，通過(guò)柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組搜索，將選出的兩個(gè)基因在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，找出保守序列，根據(jù)多基因大片段構(gòu)建策略將兩個(gè)基因拼接成一個(gè)多基因片段，將Unigenel0731與Unigene7021拼接在一起作為一個(gè)多基因；下面為要拼接的Unigenel0731與Unigene7021兩個(gè)基因序列。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，多基因Ug10731+Ug 7021片段的拼接 設(shè)計(jì)兩對(duì)拼接引物10731F/10731R，7021F/7021R，引物要求使片段ugl0731的3’端引物 10731R末端與片段ug7021的5’端引物堿基互補(bǔ)。用引物10731F/10731R以u(píng)gl0731為模版，退火溫度為57度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增出帶有互補(bǔ)序列的ugl0731片段；用引物7021F/7021R 以u(píng)g7021為模版，退火溫度為57度，PCR擴(kuò)增出帶有互補(bǔ)序列的ug7021片段。膠回收上述兩個(gè)片段，回收產(chǎn)物按1:1混合后取Iul作為模版，以10731F/7021R為引物，退火溫度 57度進(jìn)行第三次PCR，PCR對(duì)火過(guò)程中兩個(gè)帶有互補(bǔ)序列的片段ugl0731和ug7021將配對(duì)形成一條長(zhǎng)鏈，此時(shí)得到兩個(gè)基因連在一起的多基因大片段Ugl0731+Ug7021。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性，同時(shí)為了構(gòu)建干擾載體，設(shè)計(jì)引物時(shí)在引物10731F和7021R末端分別加了限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列。下列為構(gòu)建的多基因片段，以此設(shè)計(jì)構(gòu)建dsRNA。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，將正向多基因片段10731/7021質(zhì)粒雙酶切，同時(shí)將載體PFGC5941質(zhì)粒用相同兩個(gè)酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑選單克隆用通用引物Pl，F(xiàn)lPCR檢測(cè)篩選正確的菌株，提取質(zhì)粒，然后酶切驗(yàn)證得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021” ； 將得到的“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021”質(zhì)粒雙酶切，同時(shí)相同酶切反向多基因片段10731/7021，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌隨機(jī)挑選單克隆，酶切驗(yàn)證，得到 “PFGC5941-正向多基因片段10731/7021+反向多基因片段10731/7021”。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將獲得的農(nóng)桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進(jìn)行分子檢測(cè)將準(zhǔn)備好的外植體分別置于盛有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽生長(zhǎng)直至可以進(jìn)行嫁接。提取轉(zhuǎn)基因柑橘苗和其陰性對(duì)照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異引進(jìn)行擴(kuò)增、電泳檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)應(yīng)用2種幾丁質(zhì)酶基因的方法。從柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出2條幾丁質(zhì)酶基因Unigene10731和Unigene7021，進(jìn)行真實(shí)性檢測(cè)后，將選出的兩個(gè)基因在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，找出保守序列，根據(jù)多基因大片段構(gòu)建策略將兩個(gè)基因拼接成一個(gè)多基因片段，將Unigene10731與Unigene7021拼接在一起作為一個(gè)多基因。設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，將正、反向多基因幾丁質(zhì)酶目的片段先后插入到載體內(nèi)含子兩端，從而構(gòu)成反向互補(bǔ)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi干擾載體“PFGC+Ug10731/Ug7021”，將載體轉(zhuǎn)載于農(nóng)桿菌中對(duì)柑橘苗木進(jìn)行侵染。
文檔編號(hào)C12N15/66GK103014059SQ201210492338
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者冉春, 張?jiān)骑w, 劉浩強(qiáng), 陳飛, 李鴻筠, 李俊麗, 李曉姣, 岳建書(shū) 申請(qǐng)人:冉春