一種能有效感染小鼠的柯薩奇a16型病毒突變株的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種能有效感染小鼠的柯薩奇A16型病毒突變株。本發(fā)明人利用鼠細(xì)胞和小鼠連續(xù)傳代CA16病毒，意外獲得一種鼠適應(yīng)的突變病毒株，該鼠適應(yīng)株對(duì)于鼠的感染能力非常強(qiáng)，可被應(yīng)用于制備柯薩奇病毒感染的鼠模型，用于病毒致病機(jī)制研究、抗病毒藥物評(píng)價(jià)等。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種能有效感染小鼠的柯薩奇Al 6型病毒突變株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種能有效感染小鼠的柯薩奇A16型病毒突變株。
【背景技術(shù)】[0002]手足口病(Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)是5歲以下兒童常見(jiàn)的病毒性疫病，患病兒童表現(xiàn)為發(fā)熱、口腔潰瘍、手部足部等處皮膚紅疹，嚴(yán)重患兒有呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等的病變甚至死亡，柯薩奇病毒(Coxsackievirus A16, CA 16)和腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是HFMD的兩個(gè)主要致病原。
[0003]中國(guó)最近爆發(fā)的手足口病與CA16和EV71均有關(guān)，不同地區(qū)CA16和EV71流行的比例有很大不同，2009年山東的HFMD患者中EV71感染致病的占61.9%，CA16感染致病的占16.5%，然而同年廣東的HFMD患者中EV71和CA16感染致病的分別占38.3%和58.5%，患者共感染EV71和CA16，體內(nèi)同時(shí)存在這兩種病毒的比率較高，這可能導(dǎo)致RNA病毒CA16和EV71發(fā)生點(diǎn)突變和重組，引起HFMD病原的抗原多樣化，重組的病原可能是下一次的流行株，在這種情況下，HFMD可能會(huì)在中國(guó)持續(xù)流行，使HFMD的防控難度更大。更重要的是，感染CA16的兒童也出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)病癥，患者出現(xiàn)腦炎、嚴(yán)重的遲緩性癱瘓和腦干腦炎等，甚至死亡。雖然EV71是導(dǎo)致患者嚴(yán)重癥狀和重大死亡的主要病原，但CA16的危害已不容忽視，開(kāi)發(fā)針對(duì)性的疫苗和藥物將能有效防控CA16。
[0004]小鼠感染模型是評(píng)價(jià)候選疫苗的必需工具，EV71小鼠感染模型已有較多報(bào)道，主要是在乳鼠體內(nèi)適應(yīng)傳代獲得突變株，也有EV71感染免疫缺陷型小鼠建立感染模型的報(bào)道，但有關(guān)CA16小鼠感染模型的研究甚少。缺乏用于評(píng)價(jià)疫苗或藥物保護(hù)效果的CA16感染小鼠模型是研發(fā)過(guò)程中的一個(gè)瓶頸，本領(lǐng)域亟待盡快解決這一瓶頸問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種能有效感染小鼠的柯薩奇A16型病毒突變株。
[0006]在本發(fā)明的第一方面，提供一種柯薩奇A16型病毒突變株，其基因組編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP4及非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D ;其中，VP4的第52位氨基酸為K；
[0007]VP2的第150位氨基酸為I，第217位氨基酸為V ；
[0008]VP3的第41位氨基酸為H，第141位氨基酸為N ;第185位氨基酸為H ；
[0009]VPl的第98位氨基酸為T(mén)，第102位氨基酸為D，第107位氨基酸為V，第213位氨基酸為K，第218位氨基酸為D，第248位氨基酸為A ；
[0010]2A的第37位氨基酸為S ；
[0011 ] 2B的第27位氨基酸為T(mén)，第41位氨基酸為K，第63位氨基酸為I，第90位氨基酸為T(mén) ;
[0012]2C的第9位氨基酸為N，第280位氨基酸為R，第303位氨基酸為V ；[0013]3A的第3位氨基酸為L(zhǎng)，第6位氨基酸為K，第34位氨基酸為R ；
[0014]3C的第98位氨基酸為G，第103位氨基酸為I，第177位氨基酸為S ；
[0015]3D的第8位氨基酸為S，第37位氨基酸為D，第44位氨基酸為T(mén)，第75位氨基酸為A，第106位氨基酸為Y，第143位氨基酸為F，第159位氨基酸為K，第169位氨基酸為R，第244位氨基酸為V，第251位氨基酸為V，第304位氨基酸為I，第422位氨基酸為A。
[0016]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的柯薩奇A16型病毒突變株中，所述的VP4具有SEQ IDNO:3中第1-69位所示的氨基酸序列；
[0017]所述的VP2具有SEQ ID NO:3中第70-323位所示的氨基酸序列；
[0018]所述的VP3具有SEQ ID NO:3中第324-565位所示的氨基酸序列；
[0019]所述的VPl具有SEQ ID NO:3中第566-862位所示的氨基酸序列；
[0020]所述的2A具有SEQ ID NO:3中第863-1012位所示的氨基酸序列；
[0021]所述的2B具有SEQ ID NO:3中第1013-1111位所示的氨基酸序列；
[0022]所述的2C具有SEQ ID NO:3中第1112-1440位所示的氨基酸序列；
[0023]所述的3A具有SEQ ID NO:3中第1441-1526位所示的氨基酸序列；
[0024]所述的3B具有SEQ ID NO:3中第1527-1548位所示的氨基酸序列；
[0025]所述的3C具有SEQ ID NO:3中第1549-1731位所示的氨基酸序列；或
[0026]所述的3D具有SEQ ID NO:3中第1732-2193位所示的氨基酸序列。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的柯薩奇A16型病毒突變株的基因組編碼的蛋白具有SEQID NO:3所示的氨基酸序列。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的柯薩奇A16型病毒突變株的編碼區(qū)具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的柯薩奇A16型病毒突變株的基因組具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的柯薩奇A16型病毒突變株是柯薩奇病毒株G08的突變株，其對(duì)鼠的感染能力或致病能力強(qiáng)于柯薩奇病毒株G08。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的柯薩奇A16型病毒突變株在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是 CCTCC V201247。
[0032]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的柯薩奇A16型病毒突變株的用途，用于制備柯薩奇A16型病毒感染鼠模型，或用于評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)效果。
[0033]在一個(gè)優(yōu)選例中,所述的柯薩奇A16型病毒感染鼠模型用于抗柯薩奇A16型病毒感染藥物的篩選、藥效研究。
[0034]在本發(fā)明的另一方面，提供一種試劑盒，其中包含容器，以及裝于容器中的所述的柯薩奇A16型病毒突變株。
[0035]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于制備柯薩奇A16型病毒感染鼠模型，或用于評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)效果。
[0036]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0037]圖1、鼠適應(yīng)株G08-MAV對(duì)鼠細(xì)胞有較高的毒性。0.01M0I的CA16感染1.0XlO5的L929細(xì)胞和Vero細(xì)胞，G08 (A)和G08_MAV(D)在感染Vero細(xì)胞24h后明顯病變；G08在感染鼠細(xì)胞L929后的24h(B)和48h(C)細(xì)胞病變情況；G08_MAV在感染鼠細(xì)胞L929后的24h(E)細(xì)胞明顯病變和48h(F)細(xì)胞完全病變。
[0038]圖2、鼠適應(yīng)株G08-MAV的空斑表型分析。病毒稀釋液加到長(zhǎng)成單層的Vero或L929細(xì)胞上，37°C吸附2h，按照方法中介紹的進(jìn)行空斑實(shí)驗(yàn)，G08和G08-MAV在Vero上形成大小一致的空斑(A，C)，G08和G08-MAV在L929上形成的空斑差異明顯(B，D)。
[0039]圖3、CA16對(duì)7日齡ICR乳鼠的致病性。1.35X 106TCID50的G08和1.35X 104TCID50的鼠適應(yīng)株G08-MAV腹腔感染7日齡ICR小鼠(n=15，14)，感染后觀察小鼠的存亡情況和臨床病癥14天。小鼠在感染CA16后的臨床病癥(A)、存亡曲線⑶和臨床癥狀分級(jí)情況(C)。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無(wú)力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0040]圖4、鼠適應(yīng)株G08-MAV腹腔感染2周齡及較小的ICR小鼠。1.35X 104TCID50的鼠適應(yīng)株G08-MAV腹腔感染2日齡(n=16)、5日齡(n=14)、10日齡(n=15)、14日齡(n=10)和21日齡(n=16)的ICR小鼠后的存亡曲線(A)和臨床癥狀分級(jí)(B)。臨床病癥分級(jí)如下:O級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無(wú)力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0041]圖5、不同劑量鼠適應(yīng)株G08-MAV腹腔感染7日齡ICR小鼠。1.35X 104TCID50、1.35X 103TCID50、1.35X 102TCID50和 13.5TCID50 的鼠適應(yīng)株G08-MAV腹腔感染 7 日齡 ICR小鼠(n=14，16，21，5)后的存亡曲線㈧和臨床癥狀分級(jí)(B)。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無(wú)力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0042]圖6、鼠適應(yīng)株G0 8-MAV 口服感染2日齡、5日齡和7日齡的ICR小鼠。
8.1X103TCID50 鼠適應(yīng)株G08-MAV 口服感染 2 日齡(n=48)、5 日齡(n=32)和 7 日齡(n=46)的ICR小鼠，小鼠在感染后觀察14天的存亡曲線(A)和臨床癥狀分級(jí)(B)。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無(wú)力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0043]圖7、G08-MAV 感染 Balb/c 小鼠。8.1X103TCID50 鼠適應(yīng)株 G08-MAV 口服感染 2日齡(n=5)的Balb/c小鼠及1.35X 104TCID50鼠適應(yīng)株G08-MAV腹腔感染2日齡(n=10)和7日齡(n=6)的Balb/c小鼠后的死亡曲線(A)和臨床癥狀分級(jí)(B)。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無(wú)力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0044]圖8、CA16核苷酸序列突變分析。G08和G08-MAV全長(zhǎng)序列的結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因的同義突變數(shù)量(A)與頻率(C)和非同義突變數(shù)量(B)與頻率(D)。
[0045]圖9、利用G08-MAV評(píng)價(jià)滅活CA16疫苗經(jīng)主動(dòng)免疫產(chǎn)生的保護(hù)效果。三組I日齡初生鼠在O周和I周齡時(shí)，經(jīng)腹腔注射分別免疫滅活的CA 16-SZ05 (n=6)、滅活的CA16-G08(n=10)，或者是VeiO細(xì)胞裂解液(n=13)。最后一次免疫的I周后，所有小鼠均通過(guò)腹腔注射接種鼠適應(yīng)株G08-MAV(2.3 X IO5TCID50)。之后連續(xù)18天每天記錄各組的臨床癥狀評(píng)分(A)和死亡率(B)。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；I級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào),肌無(wú)力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
【具體實(shí)施方式】
[0046]本發(fā)明人利用鼠細(xì)胞和小鼠連續(xù)傳代CA16病毒，意外獲得一株鼠適應(yīng)的突變病毒株(G08-MAV)，該鼠適應(yīng)株對(duì)于鼠的感染能力非常強(qiáng)，能有效感染鼠細(xì)胞并造成明顯的細(xì)胞病變，對(duì)小鼠進(jìn)行病毒腹腔接種后引起共濟(jì)失調(diào)、癱瘓等典型神經(jīng)癥狀和較高死亡率。因此，本發(fā)明的突變病毒株可被應(yīng)用于制備柯薩奇病毒感染的鼠模型，用于病毒致病機(jī)制研究、抗病毒藥物評(píng)價(jià)等。
[0047]病毒蛋白及編碼基因
[0048]本發(fā)明所述的柯薩奇A16型病毒突變株包括結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，非結(jié)構(gòu)蛋白包括2A、2B、2C及3A、3B、3C和3D ;編碼這些蛋白的基因在病毒基因組中如下排列:VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D。
[0049]進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，柯薩奇A16型病毒突變株中，VP1、VP2、VP3、VP4及2A、2B、2C、3A、3C、3D中的一些氨基酸突變貢獻(xiàn)了該柯薩奇病毒株的鼠適應(yīng)性，使之對(duì)于鼠的感染能力顯著增強(qiáng)。所述位點(diǎn)如下:VP4的第52位氨基酸為K ；VP2的第150位氨基酸為I，第217位氨基酸為V ；VP3的第41位氨基酸為H，第141位氨基酸為N ;第185位氨基酸為H ；VP1的第98位氨基酸為T(mén)，第102位氨基酸為D，第107位氨基酸為V，第213位氨基酸為K，第218位氨基酸為D，第248位氨基酸為A ；2A的第37位氨基酸為S ；2B的第27位氨基酸為T(mén)，第41位氨基酸為K，第63位氨基酸為I，第90位氨基酸為T(mén) ；2C的第9位氨基酸為N，第280位氨基酸為R，第303位氨基酸為V ；3A的第3位氨基酸為L(zhǎng)，第6位氨基酸為K，第34位氨基酸為R ;3C的第98位氨基酸為G，第103位氨基酸為I，第177位氨基酸為S ;3D的第8位氨基酸為S，第37位氨基酸為D，第44位氨基酸為T(mén)，第75位氨基酸為A，第106位氨基酸為Y，第143位氨基酸為F，第159位氨基酸為K，第169位氨基酸為R，第244位氨基酸為V，第251位氨基酸為V，第304位氨基酸為I，第422位氨基酸為A。
[0050]本發(fā)明還包括上述各突變型病毒蛋白的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明的突變型病毒蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類(lèi)似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。但是，所述的片段、衍生物和類(lèi)似物中，對(duì)應(yīng)于前段所述貢獻(xiàn)鼠適應(yīng) 性的位點(diǎn)的氨基酸是保守的。
[0051]本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明突變型病毒蛋白的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
[0052]本發(fā)明的編碼突變型多肽的多核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0053]此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0054]病毒突變株
[0055]在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明人通過(guò)在鼠細(xì)胞L929和小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代CA16病毒G08分離株，獲得鼠適應(yīng)性的突變株G08-MAV。與親本株G08相比，G08-MAV對(duì)鼠細(xì)胞和小鼠的毒力增強(qiáng)，能有效感染鼠細(xì)胞L929并造成明顯的細(xì)胞病變，對(duì)7日齡ICR小鼠進(jìn)行病毒腹腔接種后引起共濟(jì)失調(diào)、癱瘓等典型神經(jīng)癥狀和較高死亡率(71%)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，腹腔注射G08-MAV能感染14日齡ICR小鼠。更顯著的是，用G08-MAV 口服感染2_7日齡ICR小鼠造成癱瘓癥狀及死亡，G08-MAV 口服或腹腔感染2_7日齡Balb/c小鼠也引起嚴(yán)重癱瘓和死亡。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得G08-MAV的全長(zhǎng)cDNA并測(cè)序，與G08相比，序列分析發(fā)現(xiàn)，病毒基因組在不同區(qū)域均有突變，氨基酸突變集中在Pl和3D區(qū)域。
[0056]因此，本發(fā)明提供了一種柯薩奇A16型病毒突變株，相對(duì)于野生型出發(fā)菌株其感染鼠的能力大大增強(qiáng)。所述的柯薩奇A16型病毒突變株中，VP1、VP2、VP3、VP4及2A、2B、2C、3A、3C、3D中的一些氨基酸突變貢獻(xiàn)了該柯薩奇病毒株的鼠適應(yīng)性，使之對(duì)于鼠的感染能力顯著增強(qiáng)。
[0057]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的柯薩奇A16型病毒突變株的基因組編碼的蛋白具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。更佳地，其編碼區(qū)具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。更佳地，其基因組具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0058]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的柯薩奇A16型病毒突變株在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCC V201247。
[0059]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明已成功建立基于鼠適應(yīng)病毒G08-MAV的小鼠感染模型，為評(píng)價(jià)候選疫苗和藥物的保護(hù)效果以及研究CA16的傳播和致病機(jī)制提供了可靠的平臺(tái)。
[0060]試劑盒
[0061]本發(fā)明還包括用于制備柯薩奇A16型病毒感染鼠模型的試劑盒，所述試劑盒中包括:容器，以及置于所述容器中的所述的柯薩奇病毒突變株。
[0062]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒還包括其它應(yīng)用于病毒培養(yǎng)的試劑以及周邊試劑。更佳地，所述的試劑盒中還可包括說(shuō)明使用方法和注意點(diǎn)的使用說(shuō)明書(shū)，以有利于人們應(yīng)用所述的柯薩奇病毒突變株。
[0063]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0064]除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0065]1.材料與方法
[0066]細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[0067]RD細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))和Vero細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))用含有10%血清和100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。L929細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))用含有10%血清和100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。ICR和Balb/c孕鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于上海巴斯德研究所的ABSL2+動(dòng)物房。
[0068]CA16鼠適應(yīng)株的建立
[0069]CA16 病毒 G08 株(即 Liu, Q., et al., A virus-like particle vaccine forcoxsackievirus A16potently elicits neutralizing antibodies that protect miceagainst lethal challenge.Vaccine, 2012.30:p.6642 中的 CA16/GX08 病毒株)和 SZ05 株(參見(jiàn) Liu, F., et al., Construction and characterization of an infectious cloneofcoxsackievirus A16.Virol J, 2011.8:p.534)在 RD細(xì)胞上擴(kuò)增，按照 Reed-Muench法在RD細(xì)胞上測(cè)定病毒滴度TCID50為2.7X 107/ml，該分離株在L929細(xì)胞上連續(xù)傳代3次，獲得鼠細(xì)胞適應(yīng)的病毒，將該病毒20 μ I每只通過(guò)口服感染一日齡的ICR小鼠15只，取一只病死的小鼠腿部肌肉，加入Iml冷的無(wú)菌PBS溶液后碾磨勻漿，反復(fù)凍融三次后，5000rpm/min在4°C離心30min，取上清在鼠細(xì)胞L929上傳代一次，腹腔注射7日齡的ICR小鼠6只，取一只病死的小鼠腿部肌肉，同上處理后在鼠細(xì)胞L929上傳代一次，再擴(kuò)增一代，獲得鼠適應(yīng)的 CA16 病毒，命名為 CA16-G08-Mouse Adapted Virus (G08-MAV)，分裝后 _80°C保存，并在RD細(xì)胞測(cè)定其TCID50值為2.7X 105/ml。
[0070]CA16病毒感染鼠源L929細(xì)胞
[0071]0.01M0I的CA16分別感染1.0X105的L929細(xì)胞和Vero細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)觀察L929細(xì)胞和VeiO細(xì)胞的病變情況。
[0072]空斑實(shí)驗(yàn)
[0073]空斑實(shí)驗(yàn)是用Vero或L929細(xì)胞在24孔板上進(jìn)行的，細(xì)胞長(zhǎng)到單層時(shí)，病毒液十倍稀釋后，400 μ I/孔、37°C吸附2h，病毒液吸棄，每孔加入Iml含2%FBS和0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖(Promega)的DMEM培養(yǎng)基，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)48h，細(xì)胞用含10%甲醛和0.1%結(jié)晶紫(Sigma)的PBS固定，染色。
[0074]病毒感染小鼠實(shí)驗(yàn)
[0075]特定日齡的ICR或Balb/c小鼠腹腔注射或口服適當(dāng)劑量的野生毒株G08或鼠適應(yīng)株G08-MAV，以后每日觀察小鼠的臨床病癥和存亡情況。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；I級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無(wú)力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0076]病毒全基因組測(cè)序
[0077]G08 和 G08-MAV 的全基因序列測(cè)定按照 Liu, F., et al., Construction andcharacterization of an infectious clone of coxsackievirus A16.Virol J,2011.8:p.534描述的進(jìn)行,大致如下:用Trizol (Invitrogen)氯仿裂解法提取CA16感染的RD或L929細(xì)胞，oligo (dT)為引物M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)反轉(zhuǎn)錄提取的RNA為cDNA，與Liu相同的引物和策略構(gòu)建CA16全長(zhǎng)cDNA到pMD19T，并轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，經(jīng)酶切和PCR初步鑒定后，送上海桑尼公司和上海生工公司測(cè)序分析，正確克隆命名為PMD19T-G08-MAV。
[0078]利用G08-MAV評(píng)價(jià)滅活CA16疫苗經(jīng)主動(dòng)免疫產(chǎn)生的保護(hù)效果[0079]為了制備滅活的CA16全病毒作為免疫原，Vero細(xì)胞在37°C無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)CA16-SZ05或CA16-G08(即CA16/GX08)感染直至所有的細(xì)胞出現(xiàn)病變。細(xì)胞培養(yǎng)物凍融三次后，在4°C低溫條件下，4，500rpm離心lOmin，取上清用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾。用β-丙內(nèi)酯(購(gòu)自Serva Electrophoresis)按1:2000(V/V)在4°C條件下處理24h培養(yǎng)物以滅活病毒，接下來(lái)置于37°C下2h，使β-丙內(nèi)酯水解。接下來(lái)，將滅活的病毒液加到20%蔗糖墊的上面并離心，以達(dá)到部分純化并濃縮病毒的目的。用PBS重懸離心的沉淀，并加到10-50%的蔗糖梯度上層，接著用Beckman SW60Ti型號(hào)的轉(zhuǎn)子在4°C條件下,39，OOOrpm離心3h。離心結(jié)束后，從上至下依次收取共11個(gè)鹿糖層，按照Liu, Q.,et al., Detection,characterization and quantitation of coxsackievirus A16usingpolyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins.J VirolMethods, 2011.173:p.115 描述的進(jìn)行 western-blot,抗 VPl 多克隆抗體(參見(jiàn) Liu, Q.，et al., Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16usingpolyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins.J VirolMethods, 2011.173:p.115)檢測(cè)每層中CA16的含量。根據(jù)western-blot結(jié)果收取富含CA16的蔗糖層并混合在一起，并再次通過(guò)20%的蔗糖墊超速離心濃縮病毒。獲得的病毒沉淀用PBS重懸，并儲(chǔ)存在_80°C以備后續(xù)免疫用。
[0080]為了檢測(cè)病毒滅活是否徹底，將制備的滅活病毒懸液在Veix)細(xì)胞上連續(xù)傳代兩周。在此過(guò)程中，沒(méi)有觀察到細(xì)胞病變現(xiàn)象，說(shuō)明沒(méi)有病毒擴(kuò)增。
[0081 ] 最終，將制備的CA16滅活疫苗經(jīng)western-blot方法定量，以純化的CA16 (華蘭公司提供)作為標(biāo)準(zhǔn)品，用抗VPl-多克隆抗體檢測(cè)。采用同樣流程從未經(jīng)感染的VeiX)細(xì)胞裂解液中提取蛋白作為免疫時(shí)的陰性對(duì)照。將CA16滅活疫苗或VeiO細(xì)胞裂解液對(duì)照抗原分別與鋁佐劑(購(gòu)自Sigma)混合用于免疫。三組I日齡ICR初生鼠在O周和I周齡時(shí)，經(jīng)腹腔注射分別免疫0.5 μ g的滅活CA16-SZ05、滅活CA16-G08，或者是Vero細(xì)胞裂解液。最后一次免疫的I周后，所有 小鼠均通過(guò)腹腔注射接種鼠適應(yīng)株G08-MAV(2.3 X IO5TCID50)。之后連續(xù)18天每天記錄各組的臨床癥狀評(píng)分(A)和死亡率(B)。臨床病癥分級(jí)如下:0級(jí)，健康；1級(jí)，反應(yīng)遲緩；2級(jí)，平衡失調(diào)，肌無(wú)力；3級(jí)，癱瘓；4級(jí)，死亡。
[0082]實(shí)施例1、鼠適應(yīng)株G08-MAV對(duì)鼠細(xì)胞有較高的毒性
[0083]CA16 (MOI=0.01)野生株G08或鼠適應(yīng)株G08-MAV感染Vero細(xì)胞，24h后G08和G08-MAV均引起Vero細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重病變(圖1A，ID) ;CA16 (MOI=0.01) G08或鼠適應(yīng)株G08-MAV感染鼠細(xì)胞L929，G08-MAV感染L929細(xì)胞24h后發(fā)生嚴(yán)重病變(圖1E)，48h后全部病變(圖1F)，而G08感染L929細(xì)胞24h和48h后沒(méi)有病變(圖1B，1C)。為了進(jìn)一步比較G08和G08-MAV在細(xì)胞上的毒性，在Vero和L929細(xì)胞上進(jìn)行空斑實(shí)驗(yàn)。
[0084]結(jié)果顯示，G08和G08-MAV在Vero的空斑大小相差不大(圖2A，2C)，G08-MAV比G08在L929上的空斑明顯大得多(圖2D，2B)，說(shuō)明鼠適應(yīng)后的G08-MAV在鼠細(xì)胞上的毒性明顯增強(qiáng)。
[0085]實(shí)施例2、G08-MAV在小鼠體內(nèi)的致病力顯著增強(qiáng)
[0086]用1.35X 106TCID50 的 G08 和 1.35X 104TCID50 的鼠適應(yīng)株G08-MAV分別腹腔注射7日齡ICR小鼠，小鼠的死亡率分別為26.7%和71% (圖3B)，7日齡的小鼠在感染G08-MAV后6天出現(xiàn)死亡，G08感染的7日齡小鼠9天后才出現(xiàn)死亡。小鼠在感染后表現(xiàn)出反應(yīng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)、腿無(wú)力繼而發(fā)生癱瘓甚至死亡的臨床病癥(圖3A，3C)，有的小鼠感染后沒(méi)有發(fā)生癱瘓就死亡，小鼠死亡前兩到三天或持續(xù)消瘦，或逐漸消瘦伴隨至少兩個(gè)腿癱瘓。G08-MAV感染小鼠的臨床病癥明顯嚴(yán)重于G08感染的小鼠(圖3C)。
[0087]動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)表明，鼠適應(yīng)病毒G08-MAV能導(dǎo)致7日齡的小鼠更嚴(yán)重的病變和死亡。
[0088]實(shí)施例3、腹腔注射G08-MAV能有效感染2周齡ICR小鼠[0089]1.35X 104TCID50鼠適應(yīng)株G08-MAV腹腔感染2日齡、5日齡、10日齡、14日齡和21日齡的ICR小鼠，2日齡的小鼠在感染后14天全部死亡，5日齡和10日齡的小鼠在感染后觀察14天，表現(xiàn)出大致相同的死亡率，分別為79%和80%，14日齡小鼠死亡率為50%，21日齡小鼠感染后沒(méi)有死亡(圖4A)，隨著日齡的增加，鼠適應(yīng)病毒對(duì)小鼠的致死率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，感染的小鼠日齡越小，越先出現(xiàn)死亡，2日齡的小鼠在感染后4天就出現(xiàn)死亡(圖4A)。兩周齡及其以下的小鼠在感染后表現(xiàn)出反應(yīng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)、腿無(wú)力繼而逐漸消瘦、癱瘓甚至死亡的臨床病癥(圖4B)。
[0090]實(shí)施例4、GX08-MAV腹腔注射7日齡ICR乳鼠的劑量效應(yīng)
[0091]1.35X 104TCID50、1.35X 103TCID50、1.35X 102TCID50 和 13.5TCID50 鼠適應(yīng)株G08-MAV腹腔感染7日齡ICR小鼠，隨劑量降低感染的小鼠死亡率下降，分別為71%、31%、17% 和 0%(圖 5A)，1.35X 104TCID50 和 1.35X 103TCID50 的 G08-MAV 感染的小鼠先繼出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)、腿無(wú)力、逐漸消瘦、癱瘓甚至死亡的臨床病癥(圖5B) ；1.35X 102TCID50感染的小鼠臨床上僅是反應(yīng)遲緩，感染12天后，小鼠才開(kāi)始死亡；13.5TCID50的G08-MAV不能使7日齡ICR小鼠腹腔感染死亡，僅表現(xiàn)出輕微的臨床病癥(圖5B)。
[0092]實(shí)施例5、口服G08-MAV能夠有效感染7日齡ICR乳鼠
[0093]腹腔注射能引起ICR乳鼠的有效感染，接下來(lái)本發(fā)明人嘗試G08-MAV能否口服感染 ICR 乳鼠，8.IX 103TCID50 的 G08/MAV 口服感染 2 日齡(n=48)、5 日齡(n=32)和 7 日齡(n=46)的ICR小鼠，感染后小鼠也表現(xiàn)出反應(yīng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)、腿無(wú)力、癱瘓和死亡的臨床病癥，最終小鼠的臨床評(píng)分分別為2.69分、1.63分和1.65分(圖6B)，死亡率分別為60.4%(29/48) ,40.6%(13/32)和 41.3%(19/46)(圖 6A)，病毒感染 5 日齡和 7 日齡的 ICR 小鼠在最后評(píng)分和死亡率上沒(méi)有差異，但病毒感染2日齡、5日齡和7日齡的ICR小鼠的癱瘓比例分別為29/48、9/32和1/46，也就是說(shuō)病毒感染7日齡組的死亡小鼠中大部分未出現(xiàn)癱瘓就死亡，神經(jīng)癥狀較輕，小鼠明顯消瘦，體重下降，最終消耗而亡。
[0094]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，獲得的G08/MAV能口服感染ICR乳鼠，2日齡和5日齡的ICR小鼠感染后表現(xiàn)出典型臨床病癥。
[0095]實(shí)施例6、G08-MAV感染Balb/c小鼠
[0096]獲得的G08/MAV能通過(guò)不同途徑(口服和腹腔感染)感染ICR乳鼠，其他品系的小鼠是否也被CA16病毒感染？與感染ICR乳鼠(口服感染和腹腔感染)相同劑量的病毒，對(duì)Balb/C乳鼠進(jìn)行感染，感染后小鼠也表現(xiàn)出反應(yīng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)、腿無(wú)力、癱瘓和死亡的臨床病癥(圖7B)。1.35 X 106TCID50的G08腹腔感染2日齡(n=5) Balb/C小鼠死亡率為20%，最后評(píng)分為1.4分；1.35X 104TCID50的G08-MAV腹腔感染2日齡(n=10)和7日齡Balb/C 小鼠(n=6)全部死亡(圖 7A) ；8.1X103TCID50 的 G08/MAV 口服感染 2 日齡(n=5)Balb/C小鼠死亡率為60%，最后評(píng)分為2.8分，說(shuō)明獲得的G08/MAV通過(guò)口服和腹腔注射都能感染Balb/C 乳鼠。
[0097]實(shí)施例7、G08-MAV的全序列分析
[0098]為了研究G08/MAV鼠適應(yīng)的分子機(jī)制，對(duì)G08/MAV和G08的基因組序列分析比較，發(fā)現(xiàn)G08/MAV和G08的核苷酸和氨基酸同源性分別為94.1%和98.3%，但在不同區(qū)域共有410個(gè)堿基突變(圖8-A)，其中41個(gè)非同義堿基突變(圖8-B)，38個(gè)氨基酸突變，在VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3C和3D等處均有I到12個(gè)不等的氨基酸突變，氨基酸突變最多處集中在Pl (12個(gè))和3D (12個(gè))(表1)，占了氨基酸突變的63.16%(24/38)。
[0099]表1、鼠適應(yīng)株G08-MAV的氨基酸替換
【權(quán)利要求】
1.一種柯薩奇A16型病毒突變株，其特征在于，其基因組編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP4 及非結(jié)構(gòu)蛋白 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D ;其中， VP4的第52位氨基酸為K ； VP2的第150位氨基酸為I，第217位氨基酸為V ； VP3的第41位氨基酸為H，第141位氨基酸為N ;第185位氨基酸為H ； VPl的第98位氨基酸為T(mén)，第102位氨基酸為D，第107位氨基酸為V，第213位氨基酸為K,第218位氨基酸為D,第248位氨基酸為A ； 2A的第37位氨基酸為S ； 2B的第27位氨基酸為T(mén)，第41位氨基酸為K，第63位氨基酸為I，第90位氨基酸為T(mén) ； 2C的第9位氨基酸為N，第280位氨基酸為R，第303位氨基酸為V ； 3A的第3位氨基酸為L(zhǎng)，第6位氨基酸為K，第34位氨基酸為R ； 3C的第98位氨基酸為G，第103位氨基酸為I，第177位氨基酸為S ； 3D的第8位氨基酸為S，第37位氨基酸為D，第44位氨基酸為T(mén)，第75位氨基酸為A，第106位氨基酸為Y，第143位氨基酸為F，第159位氨基酸為K，第169位氨基酸為R，第244位氨基酸為V，第251位氨基酸為V，第304位氨基酸為I，第422位氨基酸為A。
2.如權(quán)利要求1所述的柯薩奇A16型病毒突變株，其特征在于， 所述的VP4具有SEQ ID NO:3中第1_69位所示的氨基酸序列； 所述的VP2具有SEQ ID NO:3中第70-323位所示的氨基酸序列； 所述的VP3具有SEQ ID NO:3中第324-565位所示的氨基酸序列； 所述的VPl具有SEQ ID NO:3中第566-862位所示的氨基酸序列； 所述的2A具有SEQ ID NO: 3中第863-1012位所示的氨基酸序列； 所述的2B具有SEQ ID NO:3中第1013-1111位所示的氨基酸序列； 所述的2C具有SEQ ID NO: 3中第1112-1440位所示的氨基酸序列； 所述的3A具有SEQ ID NO: 3中第1441-1526位所示的氨基酸序列； 所述的3B具有SEQ ID NO:3中第1527-1548位所示的氨基酸序列； 所述的3C具有SEQ ID NO: 3中第1549-1731位所示的氨基酸序列；或 所述的3D具有SEQ ID NO:3中第1732-2193位所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的柯薩奇A16型病毒突變株，其特征在于，其基因組編碼的蛋白具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的柯薩奇A16型病毒突變株，其特征在于，其編碼區(qū)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的柯薩奇A16型病毒突變株，其特征在于，其基因組具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求1所述的柯薩奇A16型病毒突變株，其特征在于，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)是CCTCC V201247。
7.權(quán)利要求1-6任一所述的柯薩奇A16型病毒突變株的用途，其特征在于，用于制備柯薩奇A16型病毒感染鼠模型，或用于評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)效果。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的柯薩奇A16型病毒感染鼠模型用于抗柯薩奇A16型病毒感染藥物的篩選、藥效研究。
9.一種試劑盒，其特征在于，其中包含容器，以及裝于容器中的權(quán)利要求1-6任一所述的柯薩奇A16型病毒突變株。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒用于制備柯薩奇A16型病毒感染鼠模型，或用于評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)效果。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103834618SQ201210492806
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月28日
【發(fā)明者】黃忠, 劉慶偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所