專利名稱：一種利普司他汀生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物合成領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種利普司他汀的新的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
利普司他汀(英文名Lipstatin)，白色油狀物，是一種用于生產(chǎn)新型減肥藥奧利司他的醫(yī)藥中間體。奧利司他是由發(fā)酵物利普司他汀經(jīng)一步加氫還原制得。奧利司他目前是全球唯一的減肥類藥品，是長效和強效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，它通過與胃和小腸腔內(nèi)胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價鍵使酶失活而發(fā)揮治療作用，失活的酶不能將食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身體吸收，從而減少熱量攝入，控制體重。
毒三素鏈霉菌(拉丁學(xué)名Streptomycestoxytricini )為鏈霉菌科、鏈霉菌屬，孢子絲長，頂端2-3圈緊密大螺旋形。孢子橢圓形至柱形，表面光滑。抑制金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、白色假絲酵母、顆粒青霉?，F(xiàn)有技術(shù)中，發(fā)酵生產(chǎn)利普司他汀的工藝存在生產(chǎn)成本高(約250(T3000元/千克)、發(fā)酵效價低(約7000mg/L)的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種生產(chǎn)成本低、發(fā)酵效價高的利普司他汀的新的生產(chǎn)工藝。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案。一種利普司他汀生產(chǎn)工藝，包括以下步驟(I)按2%_10%的接種量，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種毒三素鏈霉菌菌液，26°C 30°C發(fā)酵14(Tl98小時，控制發(fā)酵液pH值為6. 8^7. 8，攪拌速度為60_160rpm ;所述菌液中菌種濃度為 15%-25% ；以質(zhì)量百分含量計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括甘油2. 5%-6. 5%、黃豆粉3%_8. 5%、卵磷脂 0. 5%-2%、葵花油 3%-10%、硫酸鎂 0. 01%-0. 15%、碳酸鈣 0. 05%-0. 4% ；(2)發(fā)酵結(jié)束后，酸處理，使發(fā)酵液的pH值為2-7，噴霧干燥獲得干菌絲體；(3)將干菌絲體加入1-14倍體積的丙酮中，浸泡8 24小時，板框過濾除去菌絲，收集濾液；(4)在濾液中加入純水，得到濃度為359^55%的丙酮溶液；加入12_18倍體積的正庚烷，萃取，收集正庚烷相；(5)減壓濃縮至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；加入15-25倍體積的乙腈，冷卻后，分層除油，收集乙腈相；(6)減壓濃縮至無餾分析出，制得乙腈濃縮液；加入8-12倍體積的己烷，上硅膠柱進行吸附；吸附完畢后，己烷洗脫，收集洗脫液；
(7)減壓濃縮洗脫液至無餾分析出；二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，即得。上述發(fā)酵培養(yǎng)基以黃豆粉、葵花油、甘油等作為主要氮源和碳源。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選，是在首先了解單個因素對毒三素鏈霉菌生長及利普司他汀表達的影響后，再通過正交實驗綜合考慮各因素之間的交互作用，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后確定培養(yǎng)基配方的。同時進行發(fā)酵工藝檢驗和優(yōu)選，從而選定發(fā)酵工藝，通過一系列純化工藝檢驗與優(yōu)化，從而確定了最終的純化工藝。優(yōu)選地，步驟⑴中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括甘油4. 5%、黃豆粉6. 5%、卵磷脂4%、葵花油9%、硫酸鎂0. 15%、碳酸鈣0. 4%。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括適量微量元素。添加微量元素促進了菌種對數(shù)期前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，步驟⑴中發(fā)酵溫度為27±1°C，發(fā)酵時間為140-192小時。
優(yōu)選地，步驟(2)中采用25%_45%的硫酸進行酸處理，使發(fā)酵液的pH為4。優(yōu)選地，步驟(3)中加入10-14倍體積的丙酮中，浸泡12-16小時。優(yōu)選地，步驟(4)中丙酮溶液的濃度為45-55%。優(yōu)選地，步驟(6)中所述硅膠柱中的硅膠為80-120目。選擇這樣的目數(shù)是為了分離利普司他汀，使其與其他雜質(zhì)分開。通過上述工藝提高了發(fā)酵水平，使發(fā)酵水平達到10000mg/L以上，增加了回收率，使回收率達到75%。本發(fā)明的利普司他汀生產(chǎn)工藝采用特定的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)毒三素鏈霉菌，并通過控制發(fā)酵工藝和純化工藝，經(jīng)發(fā)酵、純化、精制而獲得利普司他汀，生產(chǎn)成本大大降低，發(fā)酵效價提高，具體地說，具有以下有益效果I、發(fā)酵時間短，一般6天即可達到最大發(fā)酵產(chǎn)量的90% ；2、菌體得率高，可達到250 350克(菌體濕重)/升(發(fā)酵液)；3、發(fā)酵成本低，比當(dāng)前成本低15% ；4、分離工藝精密，獲得產(chǎn)物純度高，獲得的利普司他汀含量可以達到98% ；5、利普司他汀效價高(包括相對含量和絕對含量)，其表達量可達到8000mg/L到14000mg/L。


圖I是本發(fā)明實施例I的產(chǎn)物利普司他汀的HPLC圖譜；圖2是本發(fā)明實施例2的產(chǎn)物利普司他汀的HPLC圖譜；圖3是本發(fā)明實施例3的產(chǎn)物利普司他汀的HPLC圖譜。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述。以下實施例均以20L發(fā)酵罐進行說明，所使用的正庚烷、己烷、丙酮、乙腈均為工業(yè)級，含量均大于95%。實施例I 一種利普司他汀生產(chǎn)工藝包括如下步驟
A、配制發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分含量計，20L發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為甘油2. 5%、黃豆粉3%、卵磷脂I. 5%、葵花油5%、硫酸鎂0. 01%、碳酸鈣0. 05%,微量元素適量(氯化錳0. 001%,氯化鋅0. 0015%)，余量為去離子水。常規(guī)方法滅菌培養(yǎng)基。B、接種，發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種毒三素鏈霉菌菌液,接種量為發(fā)酵液的5%(V/V)，菌液的菌種濃度為15%;27°C ±1°C發(fā)酵8天；采用氫氧化鈉和鹽酸自動平衡來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使PH值維持在7. 0 ;發(fā)酵過程中，通過通氣量和攪拌速度調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在50%，在該實施例中，攪拌速度為90rpm ；
C、純化發(fā)酵產(chǎn)物(I)發(fā)酵結(jié)束后，用25%_45%的硫酸酸處理發(fā)酵液，使發(fā)酵液的pH值為4，采用噴霧干燥的方法獲得干菌絲體；(2)將干菌絲體加入8倍體積的丙酮溶液中，浸泡10小時，板框過濾除去菌絲，收集濾液；(3)在濾液中加入純水，得到濃度為35%的丙酮溶液；加入15倍體積正庚烷，進行萃取，收集正庚烷相；(4)減壓濃縮正庚烷相至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；加入20倍體積乙腈，冷卻后，分層除油；(5)收集乙腈相，減壓濃縮至無餾分析出，制得乙腈濃縮液；加入10倍體積己烷，上80-120目硅膠柱進行吸附；吸附完畢后，己烷洗脫，收集洗脫液；(6)減壓濃縮洗脫液至無餾分析出；二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，即得利普司他汀。經(jīng)步驟B發(fā)酵培養(yǎng)后，測定菌體得率，結(jié)果為300克(菌體濕重)/升(發(fā)酵液)；經(jīng)步驟C純化發(fā)酵產(chǎn)物后，HPLC測定利普司他汀的效價，結(jié)果為11800mg/L。如圖I所示，為本實施例制備得到的利普司他汀的HPLC圖譜，從圖I可以得出，本實施例的利普司他汀的純度為96. 4%。實施例2 —種利普司他汀生產(chǎn)工藝包括如下步驟A、配制發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分含量計，20L發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為甘油3%、黃豆粉4. 5%、卵磷脂2%、葵花油8%、硫酸鎂0. 05%、碳酸鈣0. 2%，微量元素適量(氯化錳0. 001%,氯化鋅0. 0015%)，余量為去尚子水。常規(guī)方法滅菌培養(yǎng)基。B、接種，發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種毒三素鏈霉菌菌液,接種量為發(fā)酵液的8%(V/V)，菌液的菌種濃度為20% ；27V ±1°C發(fā)酵7天；采用氫氧化鈉和鹽酸自動平衡來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使PH值維持在7. 0 ;發(fā)酵過程中，通過通氣量和攪拌速度調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在45%，在該實施例中，攪拌速度為IOOrpm ；C、純化發(fā)酵產(chǎn)物(I)發(fā)酵結(jié)束后，用25%_45%的硫酸酸處理發(fā)酵液，使發(fā)酵液的pH值為4，采用噴霧干燥的方法獲得干菌絲體；(2)將干菌絲體加入10倍體積的丙酮溶液中，浸泡8小時，板框過濾除去菌絲，收集濾液；(3)在濾液中加入純水，得到濃度為45%的丙酮溶液；加入15倍體積正庚烷，進行萃取，收集正庚烷相；(4)減壓濃縮正庚烷相至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；加入20倍體積乙腈，冷卻后，分層除油；(5)收集乙腈相，減壓濃縮至無餾分析出，制得乙腈濃縮液；加入10倍體積己烷，上80-120目硅膠柱進行吸附；吸附完畢后，己烷洗脫，收集洗脫液；(6)減壓濃縮洗脫液至無餾分析出；二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，即得利普司 他汀。經(jīng)步驟B發(fā)酵培養(yǎng)后，測定菌體得率，結(jié)果為320克(菌體濕重)/升(發(fā)酵液)；經(jīng)步驟C純化發(fā)酵產(chǎn)物后，HPLC測定利普司他汀的效價，結(jié)果為12400mg/L。如圖2所示，為本實施例制備得到的利普司他汀的HPLC圖譜，從圖I可以得出，本實施例的利普司他汀的純度為97. 7%。實施例3 —種利普司他汀生產(chǎn)工藝包括如下步驟A、配制發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分含量計，20L發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為甘油4. 5%、黃豆粉6. 5%、卵磷脂4%、葵花油9%、硫酸鎂0. 15%、碳酸鈣0. 4%，微量元素適量(氯化錳0. 001%，氯化鋅0. 0015%)，余量為去離子水。常規(guī)方法滅菌培養(yǎng)基。B、接種，發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種毒三素鏈霉菌菌液，接種量為發(fā)酵液的10%(V/V)，菌液的菌種濃度為20%;27°C ±1°C發(fā)酵8天；采用氫氧化鈉和鹽酸自動平衡來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使PH值維持在7. 0 ;發(fā)酵過程中，通過通氣量和攪拌速度調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在50%，在該實施例中，攪拌速度為120rpm ；C、純化發(fā)酵產(chǎn)物(I)發(fā)酵結(jié)束后，用25%_45%的硫酸酸處理發(fā)酵液，使發(fā)酵液的pH值為2，采用噴霧干燥的方法獲得干菌絲體；(2)將干菌絲體加入14倍體積的丙酮溶液中，浸泡12小時，板框過濾除去菌絲，收集濾液；(3)在濾液中加入純水，得到濃度為55%的丙酮溶液；加入15倍體積正庚烷，進行萃取，收集正庚烷相；(4)減壓濃縮正庚烷相至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；加入20倍體積乙腈，冷卻后，分層除油；(5)收集乙腈相，減壓濃縮至無餾分析出，制得乙腈濃縮液；加入10倍體積己烷，上80-120目硅膠柱進行吸附；吸附完畢后，己烷洗脫，收集洗脫液；(6)減壓濃縮洗脫液至無餾分析出；二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，即得利普司他汀。
經(jīng)步驟B發(fā)酵培養(yǎng)后，測定菌體得率，結(jié)果為350克(菌體濕重)/升(發(fā)酵液)；經(jīng)步驟C純化發(fā)酵產(chǎn)物后，HPLC測定利普司他汀的效價，結(jié)果為14300mg/L。如圖3所示，為本實施例制備得到的利普司他汀的HPLC圖譜，從圖I可以得出，本實施例的利普司他汀的純度為98. 2%。
以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟 (1)按2%-10%的接種量，在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種毒三素鏈霉菌菌液，26°C 30°C發(fā)酵140^198小時，控制發(fā)酵液pH值為6. 8^7. 8，攪拌速度為60_160rpm ;所述菌液中菌種濃度為 15%-25% ； 以質(zhì)量百分含量計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括甘油2. 5%-6. 5%、黃豆粉3%-8. 5%、卵磷脂O. 5%-2%、葵花油 3%-10%、硫酸鎂 O. 01%-0. 15%、碳酸鈣 O. 05%-0. 4% ； (2)發(fā)酵結(jié)束后，酸處理，使發(fā)酵液的pH值為2-7，噴霧干燥獲得干菌絲體； (3)將干菌絲體加入1-14倍體積的丙酮中，浸泡8 24小時，板框過濾除去菌絲，收集濾液； (4)在濾液中加入純水，得到濃度為35°/Γ55%的丙酮溶液；加入12-18倍體積的正庚烷，萃取，收集正庚烷相； (5)減壓濃縮至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；加入15-25倍體積的乙腈，冷卻后，分層除油，收集乙腈相； (6)減壓濃縮至無餾分析出，制得乙腈濃縮液；加入8-12倍體積的己烷，上硅膠柱進行吸附；吸附完畢后，己烷洗脫，收集洗脫液； (7)減壓濃縮洗脫液至無餾分析出；二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(I)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括甘油4. 5%、黃豆粉6. 5%、卵磷脂4%、葵花油9%、硫酸鎂O. 15%、碳酸鈣O. 4%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括適量微量元素。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(I)中發(fā)酵溫度為27± I°C，發(fā)酵時間為140-192小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(2)中采用25%-45%的硫酸進行酸處理，使發(fā)酵液的pH為4。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(3)中加入10-14倍體積的丙酮中，浸泡12-16小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(4)中丙酮溶液的濃度為45-55%。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的利普司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(6)中所述硅膠柱中的硅膠為80-120目。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利普司他汀生產(chǎn)工藝，采用特定的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)毒三素鏈霉菌，經(jīng)發(fā)酵、純化、精制而獲得利普司他汀。本發(fā)明以黃豆粉、葵花油、甘油等作為發(fā)酵培養(yǎng)基的主要氮源和碳源，并通過調(diào)控發(fā)酵工藝和純化工藝，獲得高純度利普司他汀，使利普司他汀的生產(chǎn)成本大大降低，發(fā)酵效價提高，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的生產(chǎn)成本高、發(fā)酵效價低的缺點。
文檔編號C12R1/465GK102965407SQ201210494679
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者安鴻, 尹海濱 申請人:廣州明新醫(yī)藥科技有限公司